分子生物學(xué)檢驗技術(shù)：第十三章 線粒體疾病的分子生物學(xué)檢驗

1、線粒體疾病的分子生物學(xué)檢驗Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders葉薇浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室線粒體（Mitochondrion）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College21. 動物細(xì)胞中的細(xì)胞器，二分裂方式進(jìn)行新陳代謝，平均壽命10天2. 每個細(xì)胞含幾百到幾千個線粒體3. 每個線粒體含2-10 線粒體DNA（mtDNA）線粒體的主要功能氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）電子傳遞鏈（electron transport cha

2、in）產(chǎn)能：ATP細(xì)胞凋亡（apoptosis） 自噬（autophagy）線粒體自噬（受損線粒體的清除）參與遺傳：含有DNASchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College34合成ATP參與細(xì)胞凋亡5受損線粒體啟動自噬School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College6線粒體功能涉及眾多的組織器官School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College7參與遺傳與疾病的發(fā)生School of Laboratory Medic

3、ine, Wenzhou Medical College8第一節(jié) 線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College9一、線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)人類有兩種DNA：一種在細(xì)胞核里（23對染色體），一種在線粒體里。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College10母系遺傳：在精子生成過程中，只保留極少數(shù)的線粒體提供精子運(yùn)動的能量。不會，即使個別進(jìn)入，精子中的線粒體DNA進(jìn)入受精卵

4、很快分解。受精卵細(xì)胞核基因，一半來自精子，一半來自卵子，但線粒體基因則全部來自卵子“線粒體夏娃”理論和人類起源1987年發(fā)現(xiàn)線粒體夏娃。線粒體夏娃理論：現(xiàn)代人類的線粒體DNA均來自非洲的一位女性，她是人類各種族的共同祖先。11一、線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College1213特點(diǎn)基因組小, 僅16569 bp雙鏈環(huán)狀DNA高突變率（一）人類線粒體基因組14 13 結(jié)構(gòu)基因 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 12S rRNA 基因 16S rRNA 基因 非編碼區(qū) D-loop（約1120bp）

5、 L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys）（一）人類線粒體基因組7/43 0/4 1/11 3/13 2/13蛋白質(zhì)編碼線粒體/細(xì)胞核呼吸鏈（respiratory chain）復(fù)合物I:NADH DH II: SDH III: cyt c redIV: COXV: ATPase由5個復(fù)合物組成（二）線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)16密碼子核基因組線粒體AUAIle起始UGA終止TrpAGA, AGGArg終止1、密碼子（二）線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體DNA的復(fù)制： 1）半保留方式進(jìn)行； 2）重鏈和輕鏈的復(fù)制不同步3）mtDNA的復(fù)制和核DNA的復(fù)制也不同步，參與mtDN

6、A復(fù)制的酶和復(fù)制所需要的調(diào)控因子均由核DNA編碼。17（二）線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄： 對稱性轉(zhuǎn)錄，重鏈按順時針方向轉(zhuǎn)錄，輕鏈則以逆時針方向轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后剪切位置常在tRNA處，成熟的mRNA僅在3末端加polyA尾巴，5末端不修飾帽子結(jié)構(gòu)。翻譯 ： 編碼的13個多肽，均在線粒體內(nèi)合成；合成系統(tǒng)與細(xì)菌中相似；合成體系中的其它因子（起始因子、延伸因子、釋放因子、以及核糖體蛋白質(zhì)等等）均在線粒體外合成；起始密碼AUA編碼的甲硫氨酸（Met），起始時需要甲酰化成甲酰Met 。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College18第一節(jié) 線粒

7、體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College19二、核基因組與線粒體基因組的相互作用School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College20核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對話（cross-talk）”機(jī)制第一節(jié) 線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病School of Labo

8、ratory Medicine, Wenzhou Medical College21線粒體疾病是復(fù)雜性疾病發(fā)生率： 1 / 8000遺傳方式復(fù)雜常染色體隱性遺傳（Autosomal Recessive）常染色體顯性遺傳（Autosomal Dominant）性連鎖遺傳（Sex linked）母系遺傳（Maternally inherited）臨床表型復(fù)雜累及多系統(tǒng)（Multisystemic involvement）影響幾乎所有組織器官（Any organ or tissue can be affected） School of Laboratory Medicine, Wenzhou Med

9、ical College22線粒體疾病中常見的突變核基因突變（nuclear gene mutations）氧化磷酸化系統(tǒng)由核基因編碼的蛋白質(zhì), 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.呼吸鏈缺陷: 重復(fù)、缺失線粒體DNA點(diǎn)突變（mtDNA point mutations）堿基突變School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College23線粒體疾病中常見的突變mtDNA缺失/重復(fù)（mtDNA Deletions/duplications） eg. KSS, Pearson synd, diabetes & d

10、eafnessmtDNA拷貝數(shù)變異S. D. Taylor et al. Aging Cell (2014) 13, 293824母系遺傳School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College25同質(zhì)性突變與異質(zhì)性突變School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College26線粒體基因同質(zhì)性（Homoplasmy）0 或 100%異質(zhì)性（Heteroplasmy） 0-100%核基因純合子（Homozygous） 0 或 100%雜合子（Heterozygous）50%mtDNA同質(zhì)性/

11、異質(zhì)性突變與閾值School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College2728在線粒體相關(guān)疾病中常見的DNA點(diǎn)突變MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）MERRF（肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維）： A8344G (80%), T8356C（在tRNALys基因）Leber視神經(jīng)病（LHON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical Col

12、lege29在線粒體相關(guān)疾病中常見的DNA點(diǎn)突變耳聾（Deafness）: A1555G, T1494C（在12S rRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿?。═ype 2 Diabetes）: A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） NARP（共濟(jì)失調(diào)伴色素性視網(wǎng)膜炎神經(jīng)病）：T8993G, T8993C（在ATPase 6 基因）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College30突變檢測的方法變性高效液相色譜法（DHPLC）：點(diǎn)突變，異質(zhì)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）限制酶指紋（REF）限制酶片

13、段長度多態(tài)性（RFLP）：點(diǎn)突變點(diǎn)雜交（dot blot）：點(diǎn)突變測序（Sequencing）：所有變異芯片（Chip） Technology：所有變異實(shí)時-PCR（Real-time PCR）：拷貝數(shù)長片段PCR（Long region PCR ）：缺失質(zhì)譜（Mass Spectrometer）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾與耳聾相關(guān)的mtDNA突變點(diǎn)突變School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College3112S rRNA 基因C

14、1494T ，A1555G突變位點(diǎn)基 因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾 病首次報道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagarajan et al. (2000)C1494T12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal異質(zhì)性綜合征型耳聾

15、Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)異質(zhì)性綜合征型耳聾van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Sue et al.(1999)T7512C

16、tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同質(zhì)性綜合征型耳聾Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wang et al.(2008)第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)基因芯片技術(shù)School of Labora

17、tory Medicine, Wenzhou Medical College33第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術(shù)34檢測位點(diǎn)引物序列(53)退火溫度() 產(chǎn)物長度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TTDNA測序35A1555GPark MK, et al. Int J Pediatr Otorhinolaryngol.

18、2014;78(11):1996-9.Partial sequence chromatograms of the mitochondrial 12S rRNA gene for a deaf patient carrying the A1555G mutation (A), and a normal hearing individual having a normal allele (B).Audiograms of some affected subjects.Pedigree of a six-generation Chinese Han family that harbors the 1

19、555A G mutation with aminoglycoside-induced and nonsyndronic hearing loss.Bai Y, et al. BMC Med Genet. 2010; 11: 129.Quantification of mtDNA 1555A G mutation load by pyrosequencing.Bai Y, et al. BMC Med Genet. 2010; 11: 129.第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)金標(biāo)準(zhǔn)基因芯片技術(shù)School of Labor

20、atory Medicine, Wenzhou Medical College38基因芯片技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College39基因芯片技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College40第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College411871年德國眼科醫(yī)生Leber首先描述了一種主要發(fā)病于青少年男性的家族性視神

21、經(jīng)病變。后來，該病以他的名字命名（Lebers hereditary optic neuropathy, LHON）。第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College42線粒體遺傳病急性或亞急性無痛性雙眼視力下降好發(fā)于青年男性早期是視盤周圍毛細(xì)血管擴(kuò)張晚期為視神經(jīng)萎縮Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College43診斷根據(jù)先證者的發(fā)病情況及體征，結(jié)合家族史

22、可明確診斷實(shí)驗室檢查：眼底檢查和基因診斷Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)1988年，Douglas C.Wallace等，首次在一個LHON家族發(fā)現(xiàn)mtDNA復(fù)合物I的ND4亞基基因的一個點(diǎn)突變(G11778A)，開創(chuàng)了研究mtDNA與人類疾病的新領(lǐng)域。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College44第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou M

23、edical College45突變位點(diǎn)基因同質(zhì)性/異質(zhì)性首次報道*G3316AND1同質(zhì)性Saillard et al.(2000)T3394CND1同質(zhì)性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同質(zhì)性Kong et al.(2003）G3733AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Valentino et al.(2004)C4171AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Kim et al.(2002)T4216CND1同質(zhì)性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同質(zhì)性Herrnstadt et al

24、.（2002）G7444ACO同質(zhì)性Huoponen et al.（1993）T10663CND同質(zhì)性Brown et al.(1995)G11696AND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Wallace et al.(1988)T12338CND4同質(zhì)性Wong et al.（2002）G14459AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Johns et al.(1992)A14495GND6異質(zhì)性Chinnery

25、et al.(2001)T14502CND6同質(zhì)性O(shè)zawa et al.（1991）C14568TND6同質(zhì)性Wissinger et al.(1997)A14693GtRNAGlu同質(zhì)性/異質(zhì)性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同質(zhì)性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College46原發(fā)性突變：G3460A， G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的 80-90繼發(fā)性突變：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438

26、A ，G13708A ，G15257A新突變： A4435G 位于tRNAMet 基因可以調(diào)節(jié)ND4 G11778A 突變的外顯率與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變原發(fā)性突變：G3460A， G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的 80-90繼發(fā)性突變：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257ASchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College47與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)

27、的mtDNA突變G11778A最常見；同質(zhì)性/異質(zhì)性突變頻率：北美和歐洲約50-70%，中國90%左右G3460A攜帶該突變位點(diǎn)的LHON占所有病例的20%較高異質(zhì)性T14484C該突變位點(diǎn)的遺傳外顯率27-80%School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College4849A4435G可以調(diào)節(jié)ND4 G11778A 突變的外顯率tRNAMetSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變L

28、eber病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College50PCR-SSCP技術(shù)SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測是一種基于DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College51DNA測序技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzh

29、ou Medical College52G3460AG11778AT14484C第四節(jié) 線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College53線粒體糖尿病美國糖尿病協(xié)會(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于細(xì)胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的13線粒體糖尿病是遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷，使ATP合成障礙、能量來源不足導(dǎo)致的一組異質(zhì)性病變。School of Laboratory Med

30、icine, Wenzhou Medical College54Possible Metabolic Basis of Diabetes Mellitus55第四節(jié) 線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College56線粒體DNA突變與糖尿病突變位點(diǎn)累及基因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾病首次報道C1310T12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Vawter et al.(2009)A3243G*

31、tRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Van den et al.(1992)C3254AtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Jaksc

32、h et al. (1995)A3399TMT-ND1同質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T4291CtRNA Ile同質(zhì)性糖尿病臨床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同質(zhì)性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同質(zhì)性糖尿病Onaya e

33、t al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同質(zhì)性2型糖尿病Poulton et al. (1998)Pathological mutations in tRNALeu(UUR)58tRNA參與蛋白質(zhì)合成59第四節(jié) 線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗診斷PCR技術(shù)DHPLC技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)DNA測序技術(shù)School of Laborator

34、y Medicine, Wenzhou Medical College6061攜帶tRNA Leu(UUR) A3243G突變的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College62399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 為異質(zhì)性突變RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical CollegeDenaturing High Performance

35、 Liquid Chromatography (DHPLC)雙鏈 DNA 片段大小寡核苷酸純化和質(zhì)控 突變檢測RNA 分析和純化基因分型 微生物鑒定 DNASep 柱是WAVE系統(tǒng)的“心臟” DNASep 柱的表面化學(xué)帶正電的 三乙基銨(TEAA)與帶負(fù)電的DNA 通過離子間的靜電相互作用DHPLC 技術(shù)原理DHPLC三種工作模式 非變性條件部分變性條件完全變性條件School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College671、非變性條件工作溫度: 50 C (大小依賴，序列不依賴)應(yīng)用：雙鏈DNA大小分析 (最大到 2000bp)微衛(wèi)星不穩(wěn)

36、定分析，雜合性缺失分析PCR 產(chǎn)物的檢測和純化結(jié)合多重PCR擴(kuò)增對大片段的缺失和重復(fù)進(jìn)行基因劑量分析School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College681、非變性條件：DNA 片段分離質(zhì)粒 pUC18 由限制性內(nèi)切酶 HaeIII切割，9個片段經(jīng)WAVE 系統(tǒng)分離。在 0.8% 瓊脂糖膠上， 257 和 267 bp 片段分離不開。 bp587458434298257+26717410280多重PCR - DHPLC 分析 RB1 基因樣本DHPLC三種工作模式 2、部分變性條件工作溫度 52-78 C (大小和序列依賴)應(yīng)用：整個基因的突變篩查單核苷酸多態(tài)（SNP）發(fā)現(xiàn) 3、完全變