分子生物學(xué)檢驗技術(shù)：第十一章 單基因遺傳性疾病的分子生物學(xué)檢驗

1、單基因遺傳病的分子生物學(xué)檢驗Molecular Diagnosis for Monogenic Inherited Diseases遺傳病分類 單基因遺傳病 多基因遺傳病 體細(xì)胞遺傳病 染色體病 線粒體遺傳病第一節(jié) 概述基因突變點突變 (Point Mutation)插入或缺失 (Indels)缺失或重復(fù) (Deletion/Duplication)基因倒位 (Inversion)基因融合 (Fusion)動態(tài)突變 (Dynamic):不穩(wěn)定三核苷酸重復(fù)序列，其突變是由于基因組中脫氧三核苷酸串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)增加，拷貝數(shù)的增加隨著世代的傳遞而不斷擴(kuò)增 單基因遺傳病分子生物學(xué)檢驗的策略直接診斷間接診

2、斷產(chǎn)前診斷靜態(tài)突變點突變片段突變動態(tài)突變不同層次的檢測方法DNA含量基因結(jié)構(gòu)異常表達(dá)改變轉(zhuǎn)錄翻譯直接診斷主要通過基因和DNA多態(tài)的連鎖分析作出診斷。連鎖分析是基于遺傳標(biāo)記與致病基因連鎖，子代是否獲得遺傳標(biāo)記間接地判斷做出診斷。遺傳標(biāo)記是基因組中的DAN多態(tài)性位點，如RFLP，VNTR 等。間接診斷單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 第三代遺傳標(biāo)記芯片技術(shù)產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）在遺傳咨詢的基礎(chǔ)上，通過遺傳學(xué)檢測和影像學(xué)檢查，對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行鑒別診斷，對患胎采用選擇性流產(chǎn)，從而降低出生缺陷率，有助于提高優(yōu)生質(zhì)量和

3、人口素質(zhì)。單基因遺傳病是產(chǎn)前診斷的主要適應(yīng)病種X連鎖遺傳病血友病A、B迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良脆性X綜合征創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性為主：羊膜腔穿刺（最常用）、絨毛取樣（最常用）、臍血取樣、胎兒鏡及胚胎活檢等超聲波檢查、母體外周血血清標(biāo)志物和胎兒細(xì)胞檢測等。血紅蛋白病血友病 迪謝內(nèi)營養(yǎng)不良癥 脆性X綜合癥 成年型多囊腎第二節(jié) 血紅蛋白病的分子生物學(xué)檢驗異常血紅蛋白病 鐮狀細(xì)胞貧血(血紅蛋白S病)；不穩(wěn)定血紅蛋白??；氧親和力增高血紅蛋白；血紅蛋白M(家族性紫紺癥) 鐮狀細(xì)胞貧血（SICKLE CELL ANAEMIA）1949 年世界上最早發(fā)現(xiàn)的第一個分子病，由此開創(chuàng)了疾病分子生物學(xué)?；颊叱錾肽旰螅Y狀和體征逐

4、漸出現(xiàn)，生長發(fā)育不良，易發(fā)生感染。有貧血、黃疸和肝、脾增大，心、肺功能常受損，可發(fā)生充血性心力衰竭，甚至產(chǎn)生肌肉骨骼痛、腹痛等痛性危象。診斷：本病的診斷并不困難，重要的是要考慮到本病的可能性而不遺漏本病。根據(jù)種族和家族史、鐮變試驗陽性、血紅蛋白電泳顯示主要成分為HbS，再結(jié)合臨床表現(xiàn)，即可明確診斷。實驗室檢查：1.外周血 血紅蛋白為50100g/L。網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)常在10%以上。紅細(xì)胞大小不均，可見有核紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞、異形紅細(xì)胞。鐮狀紅細(xì)胞并不多見，若發(fā)現(xiàn)則有助于診斷。通常采用“鐮變試驗”檢查有無鐮狀細(xì)胞。2.骨髓象示紅系顯著增生，在再生障礙危象時增生低下，在巨幼細(xì)胞危象時有巨幼細(xì)胞變。3

5、.血清膽紅素 輕中度增高，溶血危象時顯著增高。本病的溶血雖以血管外溶血為主，但也存在著血管內(nèi)溶血。4.血漿結(jié)合珠蛋白 降低，血漿游離血紅蛋白可能增高。5.紅細(xì)胞半衰期測定 顯示紅細(xì)胞生存時間明顯縮短至515 天正常為(285)天。6.血紅蛋白電泳 顯示HbS 占80%以上，HbF 增多至2%15%，HbA2 正常，而HbA 缺如。 珠蛋白基因的第6位密碼子由正常的GAG突變?yōu)镚TG（AT），使其編碼的珠蛋白N端第6位氨基酸由正常的谷氨酸變成了纈氨酸，形成HbS。這種血紅蛋白分子表面電荷改變，出現(xiàn)一個疏水區(qū)域，導(dǎo)致溶解度下降。在氧分壓低的毛細(xì)血管中，溶解度低的HbS聚合形成凝膠化的棒狀結(jié)構(gòu)，使紅

6、細(xì)胞變成鐮刀狀。 ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA 已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)記，

7、進(jìn)行Southern Blot 雜交/斑點雜交。Normal Gene ProbeMutation S Gene ProbeASO探針診斷正常探針突變探針/ /S S/S斑點雜交結(jié)果正常 雜合子 純合子珠蛋白生成障礙性貧血 分布最廣和最嚴(yán)重的珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血 地中海貧血（常顯）212112111211表型基因型正常人/靜止型地中海貧血/輕型地中海貧血/HbH病/Hb Bart綜合征/PCR是首選方案大范圍缺失：Southern印跡地貧的基因診斷基因不同程度的缺失引起不同類型的地貧，基因缺失14個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個 Gene

8、時可得到10kb片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe珠蛋白生成障礙性貧血 分布最廣和最嚴(yán)重的珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血 珠蛋白生成障礙性貧血-珠蛋白生成障礙性貧血中發(fā)病率最高的類型 地中海貧血（常隱）地中海貧血珠蛋白基因位于11號染色體上突變-主要發(fā)病原因點突變-單核苷酸置換（主要）堿基的插入缺失（少見 ）中國人地貧突變位點與頻率1PCR-RDB （反向點雜交）2PCR-ASO 3AS-PCR4基因芯片5突變寡核苷酸延伸擴(kuò)增 反向點雜交同時診斷基因多個點突變M1 M2 M3 M4 M5 M6 正常探針突變探針 基因芯片技術(shù) 現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了多種診斷地貧的

9、芯片檢測閱讀系統(tǒng)，系統(tǒng)多采用國際先進(jìn)的PCR體外擴(kuò)增結(jié)合DNA芯片反向點雜交檢測技術(shù)，可快速準(zhǔn)確檢測全血樣本中珠蛋白基因上多個基因位點的突變 珠蛋白生成障礙性貧血的遺傳咨詢PCR-RFLP連鎖分析技術(shù)珠蛋白基因5端有一限制性內(nèi)切酶HgiA的多態(tài)性位點通過PCR擴(kuò)增包括這一酶切位點在內(nèi)的110bp片段用HgiA限制酶消化為65bp和45bp兩個片段當(dāng)父母均為雜合子時，則具有110bp、65bp及45bp三個片段結(jié)果判讀待測胎兒若具有65bp和45bp二個片段，則為正常若有110bp、65bp和45bp三個片段， 則為珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者若僅110bp片段一條帶，則為患兒 血友病是一種遺

10、傳性出血性疾病。發(fā)病原因是由于患者的血液中先天缺乏某種因子，根據(jù)缺乏因子的不同分為三種類型：血友病甲（缺乏凝血因子V，又稱血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子，又稱血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子）。血友病A和血友病B均屬X性聯(lián)隱性遺傳，一般由女性傳遞，男性發(fā)病。血友病丙較少見，為常染色體不完全隱性遺傳，男女均可發(fā)病。通常所說的血友病是指血友病甲。第三節(jié) 血友病的分子生物學(xué)檢驗血友病F的基因結(jié)構(gòu) F基因位于X染色體長臂末端（Xq28），包括26個外顯子和25個內(nèi)含子，全長186kb 血友病的遺傳方式和基因突變遺傳方式：X連鎖隱性遺傳至1994年已報道F基因點突變174種，缺失117種，插入10

11、種。由于導(dǎo)致HA F基因的點突變多，故在實際工作中不可能對每一病人作點突變的檢測，所以DNA多態(tài)性的連鎖分析仍然是血友病基因診斷的常用手段。 FVIII基因倒位 （一）直接診斷：LD-PCR （二）間接診斷PCR-RFLP法 基因的非編碼區(qū)DNA序列相對穩(wěn)定，可以作為特定的多態(tài)性標(biāo)志，如果某一致病基因與特定的多態(tài)性標(biāo)志物緊密聯(lián)鎖，就可以利用該多態(tài)性標(biāo)志物作為一種遺傳標(biāo)記，來診斷家系成員或胎兒基因組中是否攜帶該致病基因較常用作因子基因的多態(tài)性標(biāo)志物有位于內(nèi)含子18的Bcl內(nèi)含子19的Hind 內(nèi)含子22的Xba內(nèi)含子13和22的CA二核苷酸重復(fù)序列(STR)肌營養(yǎng)不良癥（muscular dys

12、trophies，MD）是一類常見的骨骼肌變性的遺傳性疾病。臨床表現(xiàn)為骨骼肌進(jìn)行性萎縮和肌無力，主要累及肢體的近端肌肉，極少數(shù)累及遠(yuǎn)端肌肉，腱反射消失、肌肉假性肥大。分為多種類型（根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、累及肌肉的分布、遺傳方式等）假性肥大性肌營養(yǎng)不良（pseudohypertrophic muscular dystrophy）:最常見的肌營養(yǎng)不良，X連鎖性隱性遺傳病杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)貝氏肌營養(yǎng)不良癥(Becker Muscular Dystrophy，BMD)Emery-Dreifuss型肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy）肢-帶型肌營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy）遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良(distal muscular dystrophy）先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophy）強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(myotonic m