臨床檢驗的室內質控方法

1、臨床檢驗的室內質控方法第1頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日存在的問題概念不清不知道具體怎么做不會寫室內質控的SOP不知道如何選擇室內質控物不會分析室內質控的結果第2頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日室內質控SOP存在的問題責任人不清。質控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質量檢驗，定量結果沒有溯源性。沒有明確所選用的質控方法。對前20次的測定的室內質控沒有解決方法。沒有明確的失控判斷標準，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。沒有失控后的分析及處理措施。 第3

2、頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日室內質量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作?？筛爬?(1)執(zhí)行者：實驗室技術人員；(2)目的：監(jiān)測實驗室測定的重復性；(3)功能：決定了當批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的即時性評價。 第4頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日室內質量控制（IQC）的基本內容主要包括三個方

3、面：（1）測定前的質量控制；（2）統(tǒng)計學質量控制；（3）質量控制的評價。第5頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日測定前的質量控制實驗室設施、儀器設備及管理理想的試劑和操作方法 人員培訓 第6頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日實驗室設施、儀器設備及管理實驗室空間及工作流程的設計實驗室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設備、穩(wěn)壓或不間斷電源第7頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日理想的PCR實驗室設計A產物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)第8頁，共54頁，2022年，5月20日，

4、6點18分，星期日產物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)理想的PCR實驗室設計B第9頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日臨床PCR實驗室設計的一般原則各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作“十六字口訣”第10頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日產物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴增區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗第11頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日臨床PCR實驗室質量管理的特點 “無基因”概念 實驗室要有嚴格的人員進入限制

5、和程序 使用合格的試劑和消耗品 第12頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日PCR實驗室“污染”的主要來源臨床標本中存在的大量待測微生物科研中得到的質粒克隆以前分析研究的特定微生物大量存在于實驗環(huán)境中的特定微生物以前擴增產物的殘留污染。這也是PCR實驗室最容易產生的將造成假陽性的“污染”。 第13頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日PCR實驗室的重要防“污染”措施實驗室的嚴格分區(qū)及工作程序的嚴格遵守 化學方法：實驗臺面可使用10的次氯酸鈉（漂白劑）清洗 ；有些物品比如放置擴增反應管的盤必須從污染區(qū)轉回到清潔區(qū)時，在轉回之前，應將其置于210的次氯酸鈉溶液中

6、過夜，并充分沖洗。紫外照射：實驗臺面、儀器設備、實驗室空間UNG第14頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日儀器設備及管理PCR儀、離心機、加樣器、恒溫設備等應建立技術檔案，并定期維護;PCR儀、加樣器、恒溫設備應定期進行校準第15頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日理想的試劑:試劑的質檢核酸提取或標本處理方法的抗干擾能力（能否 有效地去掉PCR抑制物）測定下限(Detection limit)（定性測定）測定準確性和線性范圍批內變異和批間變異試劑批間的一致性有否污染其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等第16頁，共54頁，2022年，5月20日，6

7、點18分，星期日理想的操作方法按照試劑盒說明書操作即可嗎?操作中影響測定結果的關鍵環(huán)節(jié)寫出具有可操作性的SOP第17頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日人員培訓培訓所涉及的范圍:儀器設備使用、維護和校準；試劑、方法原理；質量管理體系；相關法律法規(guī)、相關領域的新技術、新理念和新進展；實驗操作技能等。如何培訓：講座、討論、自學和參加培訓班等。培訓的評估：書面考試、實驗考核、討論心得、論文、綜述等。第18頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日統(tǒng)計質控方法質控物濃度的選擇每次（批）測定質控物的數量及放置質控規(guī)則Levey-Jennings質控圖方法 “即刻法”質控

8、方法 “假陽性”的統(tǒng)計質控方法第19頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控物濃度的選擇定量測定：測定線性范圍內的高、中、低三種濃度定性測定：接近方法測定下限的濃度陰性質控物第20頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日每次（批）測定質控物的數量及放置標本數量如小于30，弱陽性和陰性質控各1份，標本數量增加，質控物數量相應按比例增加均勻分散于臨床標本中，與臨床標本一同處理（核酸提?。U增時的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應永久性的固定的在一個孔，而應在每次擴增檢測時，進行相應的順延，以使在一定的時間內，可以盡可能的監(jiān)

9、測每一個孔的擴增有效性。第21頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日陰性質控樣本的種類陰性原血清樣本實驗過程中帶入的空管僅含擴增反應混合液的管第22頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日陰性原血清樣本的功能監(jiān)測實驗室的以前擴增產物的“污染”由實驗操作所致的標本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標本氣溶膠經加樣器所致的污染、強陽性標本經操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等擴增反應試劑的污染。 第23頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日核酸提取過程中帶入的空管監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的存在（在整個實驗

10、過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內，最后以水為基質，進行擴增 ）第24頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日僅含擴增反應混合液的管監(jiān)測試劑的“污染”第25頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控規(guī)則的表達方式及定義 質控規(guī)則的表達方式 質控規(guī)則的功能 常用質控規(guī)則的符號及定義 第26頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控規(guī)則的表達方式通常質控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質控測定中超出質量控制限的測定值的個數，L為控制限，通常用均值或均值13SD來表示。 當質控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 常用的13S質控規(guī)

11、則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質控測定值中，如果有一個測定值超出均值3s范圍，即可將該批測定判為失控。 第27頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控規(guī)則的功能 簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。第28頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日常用質控規(guī)則的符號及定義 符 號 定 義12S 一個質控測定值超出2s控制限。13S 一個質控測定值超出3s控制限。22S 兩個連續(xù)的質控測定值同時超出+2s或2s控制限。R4S 同一批測定中，兩個不同濃度質控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。41S 四個連續(xù)的質控

12、測定值同時超出+1s或1s控制限。7T 七個連續(xù)的質控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變 化。10X 十個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（）的同一側。第29頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日Levey-Jennings質控圖方法也稱Shewhart質控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產品的質量控制。二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質量控制 。經Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質控圖。第30頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控圖第31頁，共54頁

13、，2022年，5月20日，6點18分，星期日第32頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日Levey-Jennings質控圖基本的統(tǒng)計學含義穩(wěn)定條件下，在20個IQC結果中不應有多于1個結果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結果中超過3SD（99.7%可信限）的結果不多于3個。如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 第33頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日“即刻法”質控方法“即刻法”質控方法的實質是一種統(tǒng)計學方法，即Grubs異常值取舍法 ；只要有3個以上的數據即可決定是否有異常值的存在。第34頁，共54頁，2022年，5月20日，6

14、點18分，星期日“假陽性”的統(tǒng)計學室內質控方法基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布)直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）第35頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日基于日常檢驗的陽性率比值半Levey-Jennings質控圖法 第36頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日質控規(guī)則當陰性質控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標本須重新測定，并增加一倍陰性質控樣本。如果陰性質控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結果陰性結果根據陽性質控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增

15、高的原因，并在增加一倍陰性質控樣本的情況下重新檢測。第37頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日可能的幾種失控表現(xiàn) 曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導致實驗室被污染如標本泄漏，產物泄漏，試劑被污染等向上的趨勢性變化：可能存在累積性的產物污染，實驗室擴增產物逐漸累積，從而使病人結果的陽性率逐漸增高。此時實驗室需要進行徹底清潔。第38頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日直接概率計算法按統(tǒng)計學規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。當一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。對

16、每天的日常病人結果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。 第39頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日根據二項式分布的概率計算在一個實驗室中某檢測項目結果的陽性率為p,計算在n個血液樣本中有k個陽性結果的概率。根據二項式分布的概率計算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1) 其中n為當次實驗檢測標本數，k為陽性個數，p為陽性率。P(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。第40頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日根據二項式分布的概率計算如果一個實

17、驗室檢測HBV DNA，平常病人結果的陽性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性結果，19個陰性結果，則檢測過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性結果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性結果的概率）即：1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334則在這個實驗室一次檢測25

18、個標本獲得6個或6個以上陽性結果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽性結果的可能。第41頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日根據泊松分布的概率計算在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目如HCV RNA 、CT、結核桿菌、淋球菌的陽性結果率均較低，這時雖然可以使用公式（1）計算概率，但如果標本量很大，使用泊松分布來估計二項式分布是一種更為簡便的方法。根據泊松分布，可使用下式計算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2) P(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。第42頁，共5

19、4頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日根據泊松分布的概率計算一個實驗室中，某項目每次檢測結果的陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性結果的概率。根據泊松分布，可使用公式（2）計算概率，此時n=100,p=0.02,k=8, np=2代入公式（2）計算得 P(X=10) =28e-2/8!=0.0009。第43頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日標本間交叉污染的概率計算如果所有陽性結果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計算公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n為當次實

20、驗檢測標本數，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個數。 當某次實際測定標本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，則判為失控。陰性標本結果可以發(fā)出，陽性標本要考慮標本間交叉污染的問題。第44頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日標本間交叉污染的概率計算如在一次檢測100個標本的HBV DNA檢測中，所有兩個陽性結果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率為2.0%。 因此，如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數有3次，即概率為3.0%，則為失控。而在一次檢測100個標本，所有三個陽性結果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-3+1)/

21、100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率為0.06%。 因此，如果如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)三個為陽性次數有1次，即概率為1.0%，為失控。第45頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日室內質量控制的評價IQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測定的有效性的判斷，也反應了實驗室測定趨勢的變化。IQC的失控不能做為處罰的依據，應建設性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進。對IQC應定期進行評價。第46頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日陽性質控樣本失控的常見原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、

22、標本中擴增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。第47頁，共54頁，2022年，5月20日，6點18分，星期日陽性質控樣本測定結果偏低或為陰性結果偏低陰性臨床標本中無強陽性臨床標本中有較強陽性臨床標本中有陽性臨床標本全為陰性觀察臨床標本情況所用離心管含抑制物Taq酶活性降低核酸提取試劑效率低更換進口離心管更換Taq酶再檢測更換核酸提取試劑所有標本重新檢測核酸提取中靶核酸丟失核酸提取中抑 抑物殘留核酸提取試劑混入擴增儀孔間溫度差異隨機誤差檢測質控樣本及35份已知陽性樣本質控樣本測定正常且陽性樣本有些值增加質控及已知陽性樣本測定仍異常按系統(tǒng)誤差途徑分析重新提取或已知濃度DNA在同一孔內擴增結果正常結果仍低進行擴增儀孔溫度校準后再檢測Taq酶或逆轉錄酶失活第4