2025年人教版高考生物一輪復(fù)習(xí)：綜合PCR的基因工程問題

專題突破10綜合PCR的基因工程問題

闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過程與原理，舉例說明不

課標(biāo)要求

同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。

2023?江蘇-T222023?山東-T252022?江蘇-T24

2022?山東-T25

考情分析幾種不同PCR的應(yīng)用

2021?全國甲?T382021?山東-T252020?北京-T12

2020?江蘇-T33

類型一利用PCR技術(shù)獲取目的基因

【基本模型】

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性

地快速擴(kuò)增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原

理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核昔酸序列進(jìn)行大量

復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化

學(xué)獎。

【典例突破】

1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X

基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下

列敘述錯誤的是（）

引■物1引?物2

3'--------讓------1-1--------5'

5,--------1------------U----3'

'X-因

圖1

3'

圖2

A.第一輪復(fù)制得到2個DNA分子，即①②各一個

B.第二輪復(fù)制得到4個DNA分子，即①②③④各一個

C.第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有4個X基因

D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子

答案C

解析據(jù)圖分析可知，第一輪復(fù)制形成2個DNA分子，即①②各一個，A正確；第二輪復(fù)

制得到22=4（個）DNA分子，即①復(fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④，即得到①②③④各一個,

B正確；第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有8個⑤（X基因），C錯誤；經(jīng)五輪循環(huán)后

共形成32個DNA分子，其中①②各一個，③④各四個，22個⑤，故產(chǎn)物中有五種不同的

DNA分子，D正確。

類型二利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式

【基本模型】

檢測目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標(biāo)

記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實(shí)際

操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過引物的巧妙

設(shè)計(jì)鑒定目的基因的連接方式。

【典例突破】

2.（2019?江蘇，33節(jié)選）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬

設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR

鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是o某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中

擴(kuò)增出了400bp片段，原因是o

答案乙、丙目的基因反向連接

解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲

和丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50+300+100=450（bp）,不

符合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙

和丙這對引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的

外側(cè)，此時若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300+100=400（bp）的片段。

類型三利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變

【基本模型】

重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成

了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)在基

因的定點(diǎn)突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用。

【典例突破】

3.水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水

蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）

替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG）,從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。

,擬突變位點(diǎn)

5'-----------------A------------------3'

3'——引幽4

引物2二5

3

Mr5

二-

35

5-——T---------------5，3，--------------T

階-3'I使用引物1和‘小中3

弓_

隊(duì)-2進(jìn)行PCRSgpCR

/

,5-3

3/個3'、,5'」5

第人④一一一3口

二

一I混合、變性后，雜交

階

段5'-------------5，

|首先使用DNA聚合酶延伸，

|然后使用引物1和4進(jìn)行PCR

5'------------------A---------------3'

3,------------------A--------------5，

突變后的基因

注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。

（1）由以上事例可知，要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過來完成。

（2）若擬突變位點(diǎn)的堿基對為A—T,則需要讓其突變?yōu)椴拍苓_(dá)到目的。引物2

的突變位點(diǎn)（突起處）應(yīng)設(shè)計(jì)為（假設(shè)引物為單鏈DNA）。

（3）在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引

物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生一種DNA分子。該階段必須將引

物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)?/p>

O

（4）利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)

把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物Mi、M2,基因N的引物Ni、N2=在設(shè)計(jì)這

4種引物時，特別要注意的問題是____________________________________________________

答案（1）改造基因（或基因定點(diǎn)突變）（2）T—A或C—GA或G（3）3引物2和3中存在

互補(bǔ)配對片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時會結(jié)合而失去作用

（4）Mi、M2中的一種引物與Ni、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對的片段

解析（2）若擬突變位點(diǎn)的堿基對為A—T,則需要讓其突變?yōu)門—A或C—G,對應(yīng)的密碼子

由AAU變成AAA或由AAC變成AAG,可使天冬酰胺替換為賴氨酸。（3）若兩個反應(yīng)系統(tǒng)

均進(jìn)行一次復(fù)制，則會產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因?yàn)橐?和4產(chǎn)生的DNA分子是一

樣的。（4）重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時，設(shè)計(jì)

引物時需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即Mi、M2中的一種引物與Ni、N2

中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對的片段。

類型四利用PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列

【基本模型】

利用PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增時，為了便于設(shè)計(jì)引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。當(dāng)

DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術(shù)。

【典例突破】

4.（2020?江蘇，33節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖（以EcoRI酶切為例）：

染色體DNA

［酶切|空隋領(lǐng)圜

昆合的DNA片段

y-------7'^2,

」未知序歹!H已知序列I未知序列片段F

n連接［DNA連接酶

已知序列、

DI擴(kuò)增1"gDNA聚合酶

--------■PCR產(chǎn)物

IV測序、分析［片段F的

5'...........................................................3,完整序列

請據(jù)圖回答問題：

⑴步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切

割特定位點(diǎn)。

⑵步驟II用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3,一羥基與5'—磷酸間形成

;PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得；ThqDNA聚合酶

的作用是催化

（3）若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟III選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核甘酸序列）

5^-AACTATGCGCTCATGA----GCAATGCGTAGCCTCT-3'

已知序列11111111111111111111111111111111

3^-TTGATACGCGAGTACT----CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3z

PCR引物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'—TCATGAGCGCATAGTT-3'

答案（1）限制性內(nèi)切核酸（或限制）核甘酸序列

⑵磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸（3）②④

解析（3）PCR過程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是

相反的，引物的核甘酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核甘酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，環(huán)狀DNA

圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知

DNA序列的第一條鏈的左端互補(bǔ)結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物

是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補(bǔ)結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。

類型五利用PCR技術(shù)快速檢測病原體

【基本模型】

病原體檢測是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準(zhǔn)確地確定病原體的存在和種類，發(fā)

展了許多快速檢測方法。PCR技術(shù)是一種基于DNA擴(kuò)增原理的快速病原體檢測方法，它能

夠在幾小時內(nèi)擴(kuò)增和檢測極小量的病原體DNA,并且具備高度的特異性和敏感性。

【典例突破】

5.（2024?煙臺高三一模）人類猴痘由Yaba猴病毒（雙鏈DNA病毒）引起，實(shí)時熒光定量

PCR（qPCR河用于Yaba猴病毒的快速檢測。進(jìn)行qPCR時，在反應(yīng)體系加入Kzgman探針，

2qman探針兩端連有熒光基團(tuán)（R）和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)（Q）,完整的Zqman探針不發(fā)

出熒光，當(dāng)探針被水解后R基團(tuán)會發(fā)出熒光（如圖所示），隨循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號強(qiáng)度

增加。

⑴采用qPCR檢測Yaba猴病毒需在一定的溶液中才能進(jìn)行，反應(yīng)體系中還需提

供DNA模板、原料、、Thqman探針、ZgDNA聚合酶、Mg2+等。qPCR過程中，

TaqDNA聚合酶的兩個作用是=

⑵qPCR檢測病毒的核酸一般具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，這與反應(yīng)體系中加入的

和有關(guān)。但有時也可能會出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果?？赡艿脑蛴?/p>

_______________________________________________________________________（答出兩點(diǎn)）。

（3）在PCR反應(yīng)體系中一般都要加入Mg2+,原因是o為了探

究Mg2+對PCR擴(kuò)增效果的影響，科研人員在PCR反應(yīng)體系中加入不同濃度的Mg2+進(jìn)行了

實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖所示，據(jù)此可得出的結(jié)論有

⑥

22④

⑤

L8②

L4①

L0

S6

一（）21~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~*■

048121620242832364044

循環(huán)次數(shù)

注:①?⑤乂名?+濃度分別為2、3、4、5,6mM;

⑥為陰性對照。

答案（1）緩沖引物催化合成DNA子鏈；催化探針?biāo)猓?）引物探針取樣不規(guī)范；

取樣所獲樣本量不足;病毒發(fā)生了基因突變（3）7hgDNA聚合酶需要Mg2+激活在不含Mg2

+的緩沖液中靶基因幾乎無法擴(kuò)增；在不同濃度的Mg2+緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在

實(shí)驗(yàn)濃度下，4mM為最佳濃度

解析（3）真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（ThqDNA聚合酶）都需要Mg2+激活；分析題圖可知,

⑥為陰性對照組，其熒光強(qiáng)度非常弱，意味著不加Mg2+的緩沖液中靶基因幾乎無法擴(kuò)增；

而加了不同濃度的Mg?+的緩沖液對應(yīng)的曲線①②③④⑤熒光強(qiáng)度均高于⑥，且③曲線（Mg?+

濃度為4mM）的峰值對應(yīng)的熒光強(qiáng)度最高，說明在不同濃度的Mg?+緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效

果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4mM為最佳濃度。

課時精練

一、選擇題

1.（2024?廈門高三質(zhì)檢）如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)

物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

A.②鏈從L到R的方向?yàn)?'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制

C.以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③

D.物質(zhì)③的5,端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物

答案D

解析根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?,-3',

A錯誤；PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之后才進(jìn)行復(fù)

制，B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23=8,需消耗7個引

物③，C錯誤。

2.（2024?重慶高三質(zhì)檢）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）

的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較

多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1：100,PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)

增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會產(chǎn)生大量的ssDNA。下列

相關(guān)說法錯誤的是（）

也”限制性引物

乙

3'5'、

\\R--非限制性引物

x乙j?ii1111h

3，5，

A.用不對稱PCR方法擴(kuò)增目的基因時，不需要知道基因的全部序列

B.進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離

答案C

解析不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與

乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。

3.（2024?無錫高三模擬）重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代

表突變位點(diǎn)）。下列說法正確的是（）

通用引物FP1突變引物FP2

突變引物通用引物RP2

①3RP1I

——第1對引物

的PCR產(chǎn)物

第對引物

2重疊區(qū)域

的PCR產(chǎn)物

②卜昆合、變性、復(fù)性

―能------

L通用引物RP2

PCRI?

茨―

突變的基因

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物

C.過程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2

答案D

解析兩種突變引物能互補(bǔ)配對，因此過程①必須分兩個反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯誤；過程①至

少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯誤；過程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延

伸過程，因?yàn)樽渔溨荒軓囊锏?'端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由

于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個突變基因共需要消耗16X2—2=30（個）通用引物，而

需要通用引物RP2的數(shù)量為30+2=15（個），D正確。

4.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計(jì)引物對未知序列（圖中L、R）進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過程

如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

環(huán)化并加入根據(jù)已

知序列合成的引物

③PCR擴(kuò)增

L

已知序列已知序列

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進(jìn)行切割

B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術(shù)可檢測T-DNA整合到植物染色體DNA的位置

答案C

解析過程③即PCR擴(kuò)增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實(shí)現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，

C錯誤。

5.IKK激酶參與動物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患兒的

/K曲基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物

PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）

引物

/KK6基因"7777M-

PCR]I…T,,丁二

*5_,iiI/^Ii。

引物_LU3^

C—J—大引物a鏈

G大士物b鏈

1__/KKB基因

o___o

PCR23,I.TI5,

引物'nC-------大引物a鏈

ILG大引物b鏈

vSacI

HindTH

注：定點(diǎn)誘變獲得突變基因的過程，需要以下

3種引物：

引物A：S'—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—37

、突變堿基

引物B:51—TAAGCTTCGAACATCCTA—31

一識別序列

引物C：5(—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3f

SacI識別序列

A.PCRi中使用的引物有引物/、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物8、大引物b鏈

C.PCRi過程需要擴(kuò)增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物

D.PCR2過程中，為減少錯誤DNA片段的產(chǎn)生可適當(dāng)升高復(fù)性溫度

答案C

解析在PCRi中，需要兩種引物，將來在切取區(qū)陰基因時，在基因的左側(cè)需要用限制酶

來切割，在基因的右側(cè)用限制酶SacI切割，因此在PCRi中結(jié)合到基因右端的引物

選擇引物C,從題圖中看，另一個引物應(yīng)含有突變堿基C,所以選擇引物力,A正確；在PCRj

中，有一個引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶4"dill識別的序列，所以要用到引物2,

而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5'端到3'端的

序列中開始部位應(yīng)含有SacI識別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCRi過

程主要是為了獲得大引物，則擴(kuò)增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯誤；由于大引物較長，含C

與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR2復(fù)性過程中應(yīng)適當(dāng)提高溫度，便于引

物與模板鏈的結(jié)合，D正確。

6.（2024?安順高三調(diào)研）熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其

原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針。當(dāng)耐高溫的

DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴(kuò)增

一次,就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實(shí)時檢測熒光信號強(qiáng)度，可得Ct值（熒光信號達(dá)到

設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。下列相關(guān)敘述錯誤的是（）

A.PCR每個循環(huán)包括變性、復(fù)性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監(jiān)測的熒光強(qiáng)度與起始時反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高

答案D

解析Ct值越小，說明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，D錯誤。

7.（2024?襄陽高三模擬）通過設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖

為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段

配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計(jì)增

加限制酶a和限制酶b的識別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述不正確的是（）

酶aT

引物］三____________

7二7引物2

酶第沖CRBb

引物------------

一.------------^引物2

酶a箸輪酶b

引物1士二一二二物2

Ai酶b

I

A.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入

B.復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

答案D

解析引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識別位點(diǎn)，幫助目的基因定

向插入載體，避免發(fā)生自身連接，A正確；PCR技術(shù)中，復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與互

補(bǔ)DNA鏈（模板）牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降，B正確；第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基

對且兩條鏈等長的DNA有1個，而子代DNA有23=8（個），故含突變堿基對且兩條鏈等長

的DNA占1/8,D錯誤。

8.（2024?南通高三調(diào)研）如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán)，

并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出T—DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關(guān)說法錯誤的是（）

未知序列引物①T-pNA引物②未知序列

I：J匚/二J

限制st切點(diǎn)引物③引物④限制儲切點(diǎn)

A.農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T—DNA存在于其Ti質(zhì)粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列

C.若擴(kuò)增循環(huán)〃次，需要2"+i—2個引物

D.將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—DNA的插入位置

答案B

解析農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染

能力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④

組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯誤；擴(kuò)增循環(huán)〃次，得到2"個DNA分子，總單鏈數(shù)為

2X2"即2—1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2/1一2個引物，C正確；不

同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定

T—DNA的插入位置，D正確。

9.實(shí)時熒光定量RT—PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料

能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號。在流感流行季節(jié)，對懷疑流感病毒感染的

患者，可以通過實(shí)時熒光定量RT—PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

針

1.熱變性魯譬熒光物質(zhì)點(diǎn)謁淬滅物質(zhì)

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2.復(fù)性/探針與模板的雜交

聚合也?探針雜交。

r~rQf.................

??????????????

3.延伸反應(yīng)TTT

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標(biāo)記的流感病毒獨(dú)特的基因序列

B.核酸檢測是通過檢測熒光信號來確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT—PCR技術(shù)測定病毒的核酸具有特異性

答案C

解析PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，不需要解旋酶，可通過高溫使DNA雙鏈解開,

但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯誤。

二、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)

構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：

擬構(gòu)建的720bp390bp

注：EGFP熒光蛋白

基因結(jié)構(gòu)EGFP

AnBl納米抗體。

Fg2gF2片段PCR引物

叱FF1片段-及目的產(chǎn)

、一堂包物片段

T7坳F2-R

Fi-RE>一線性質(zhì)粒

基因重組AmPR)-------------------

載體

克隆流程PCR產(chǎn)物片段與重組酶

線性載體混合J里一

注：一?表示PCR引物;

相同背景方框表示

同源序列。

圖1

(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有,

擴(kuò)增程序中最主要的不同是。

(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)

化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有。

(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有。

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30~300個菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高

C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化

(4)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物Fl—F和

F2—R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1?P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可

以舍棄的質(zhì)粒有=

圖2

⑸對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)，原因是

答案⑴模板、引物引物的設(shè)計(jì)（2）限制酶、（T4）DNA連接酶（3）ABC（4）P3、P4（5）

電泳只能檢測DNA分子的大?。ㄩL度），無法確定待檢測DNA分子的堿基序列

解析（l）PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。分別進(jìn)

行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、

引物。PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合。

引物設(shè)計(jì)是決定PCR反應(yīng)成敗的最主要因素。（2）傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制性內(nèi)切核

酸酶（限制酶）切割質(zhì)粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的

基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在DNA連接酶的作

用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，不需要使用限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）。（3）用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計(jì)

數(shù)時，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30?300的平板，A錯誤；培養(yǎng)基冷卻后才接

種，故抗性平板上未長出菌落不是因?yàn)榕囵B(yǎng)基溫度太高，B錯誤；轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用

含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會出現(xiàn)大量

雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細(xì)菌的方法，用稀釋

涂布平板法接種后在抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化，D正確。（4）EGFP為720

bp,AnBl為390bp，二者的總大小為720+390=1100（bp）,用引物Fl-F和F2-R進(jìn)行PCR

擴(kuò)增，其大小接近于Pl、P2,根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4o（5）瓊脂糖凝

膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列，

因此對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)。

11.基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請回答下列相關(guān)問題：

（1）目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機(jī)會和可能，目的基因往往從相關(guān)的

_______________________的基因中進(jìn)行篩選。

⑵目的基因可以人工合成、從基因文庫中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增。如圖1

展示了PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因的原理，請分析回答下列問題：

目的基因

圖1

①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、

復(fù)性和延伸三個過程，復(fù)性的作用是。

②將一個DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，理論上目的基因最早在第次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)

后，可擴(kuò)增得到個目的基因。

（3）反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列,

外側(cè)為未知序列。請回答相關(guān)問題：

圖3經(jīng)EcoR酶切后的DNA分子圖4環(huán)化后的DNA分子

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是,EcoRI

切割得到黏性末端的原因是_________________________________________________________

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增,原因是0

③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是（填“順時

針”或“逆時針”），PCR產(chǎn)物（填“含有”或“