氯氨酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡和Fas蛋白、Bcl

1、氯氨酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡和Fas蛋白、Bcl【關(guān)鍵詞】心肌缺血再灌注損傷；,心肌細(xì)胞凋亡；,氯胺酮；,Fas蛋白；,Bl摘要：目的：討論氯胺酮作用下大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡與Fas及Bl2蛋白表達(dá)的變化及與心肌組織損傷的關(guān)系，并分析心肌組織病理學(xué)損傷程度。方法：以穿線結(jié)扎或松扎左冠狀動(dòng)脈制備大鼠心肌缺血再灌注模型。32只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(假手術(shù)4.5h)、缺血再灌注組(缺血30in、再灌注4h)、低劑量氯胺酮+缺血再灌注組(缺血30in、再灌注4h)及高劑量氯胺酮+缺血再灌注組(缺血30in、再灌注個(gè)4h)。以缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡的變化,SP免疫組化法

2、分別檢測(cè)Fas與Bl2蛋白程度變化，做病理組織切片檢查心肌損傷情況。結(jié)果：心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白陽性染色指數(shù)與Bl2蛋白陽性染色指數(shù)均增加,氯氨酮可減少心肌凋亡，減少Fas和Bl2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá);心肌缺血再灌注后心肌組織呈大小不一的灶性壞死,壞死周圍有炎性細(xì)胞浸潤，氯胺酮作用后壞死減輕，低劑量氯胺酮作用更明顯。結(jié)論：心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡、Fas基因的蛋白與Bl2蛋白表達(dá)量均增加,氯氨酮可減少心肌凋亡,減少細(xì)胞Fas和Bl2蛋白陽性表達(dá),從而減輕心肌損傷，且低劑量氯氨酮作用更明顯。關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷；心肌細(xì)胞凋亡；氯胺酮；Fas蛋白；Bl2蛋白細(xì)胞凋亡不同

3、于細(xì)胞壞死的另一種細(xì)胞死亡形式,它是一個(gè)受遺傳基因調(diào)節(jié)的生理學(xué)細(xì)胞自殺過程或程序性細(xì)胞死亡1。研究說明在心肌缺血再灌注過程時(shí)，大量氧自由基生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、大量中性粒細(xì)胞浸潤以及線粒體損傷等均可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌損傷。而細(xì)胞凋亡中,凋亡刺激基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物Fas蛋白及抗凋亡因子Bl2蛋白的作用被認(rèn)為中有重要意義。有研究說明氯胺酮可抑制心肌缺血再灌注損傷，但對(duì)其是否抑制心肌中的細(xì)胞凋亡并不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究氯胺酮對(duì)其作用下大鼠心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡與Fas及Bl2蛋白表達(dá)量的變化及與心肌組織損傷的關(guān)系。1材料與方法11實(shí)驗(yàn)材料與儀器小型動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠),心電圖檢測(cè)

4、儀(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(InSituellDeathDetetinKit,PD)購自BehringerannhEi公司,兔抗鼠Fas多克隆抗體及FasL多克隆抗體均購自Santaruz公司。SAB試劑盒購自于博士德公司。12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性安康SD大鼠6個(gè)月左右32只，由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重250300g,隨機(jī)分為4組，每組8只。A組為假手術(shù)對(duì)照組；B組為缺血再灌注模型對(duì)照組；組為2g/kg氯胺酮+缺血再灌注模型組;D組為4g/kg氯胺酮+缺血再灌注組。13動(dòng)物模型制備10%水合氯醛40g/kg腹腔注射麻醉，連接多功能監(jiān)護(hù)儀記錄導(dǎo)心電圖；氣管切開，接

5、小型動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)展機(jī)械通氣，呼吸頻率60次/分，潮氣量2l/100g，于左胸第四肋間翻開胸腔暴露心臟，在左心耳1左冠狀動(dòng)脈處，用眼科外用不銹小圓針穿過心肌淺層，穩(wěn)定10in后將U型含有銅絲的膠管置于冠狀動(dòng)脈外表一起結(jié)扎A組不結(jié)扎，B、D組結(jié)扎；結(jié)扎開場(chǎng)左心室心尖部即由紅色變暗，30in后呈暗紅色，心電圖中出現(xiàn)ST段抬高，說明缺血形成。此時(shí)B、D組分別由右腹股靜脈注入10L/kg生理鹽水、2g/kg氯胺酮、4g/kg氯胺酮,解開結(jié)扎線后進(jìn)展再灌注。在再灌注4h后斷頭處死，將新穎心肌組織標(biāo)本放入40g/L中性甲醛溶液中固定,然后集中進(jìn)展石蠟包埋,切片于4冰箱保存?zhèn)溆谩?4凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分

6、析石蠟包埋的心肌組織,采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)。結(jié)果根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞分布情況,每張切片拍攝5個(gè)陽性視野,每視野記數(shù)300個(gè)心肌細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù),以平均計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI)。15Fas基因和Bl2基因蛋白表達(dá)檢測(cè)與半定量分析取上述石蠟標(biāo)本相應(yīng)部位的連續(xù)切片各5張，采用鏈霉親和素生物素過氧化酶復(fù)合物技術(shù)(SAB)法進(jìn)展免疫組化染色和HRP/AE顯色法。每張切片于陽性表達(dá)區(qū)域選擇10個(gè)無重疊視野,用圖像分析儀進(jìn)展分析,并計(jì)算其光密度值的均值。采用光密度值的均值102表示。16心肌組織病理學(xué)分析切片于HE染色后觀察其組

7、織病理性損傷改變。17統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比擬用單因素方差分析，q檢驗(yàn)進(jìn)展組間比擬，P0.05為差異有顯著性。2結(jié)果21心肌凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)心肌組織中凋亡細(xì)胞的分布及變化:經(jīng)TUNEL染色及蘇木素復(fù)染后凋亡細(xì)胞核呈棕色,正常細(xì)胞核染藍(lán)色。假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞;心肌缺血再灌注后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,氯氨酮作用后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降,且低劑量氯氨酮作用組下降更多。見表1。22心肌組織中Fas和Bl2基因的蛋白陽性染色變化假手術(shù)組僅見極少數(shù)散在的Fas蛋白陽性染色細(xì)胞和Bl2蛋白陽性染色細(xì)胞;心肌缺血再灌注后Fas和Bl2蛋白陽性染色的細(xì)胞增加,Fas和Bl2蛋白陽性

8、細(xì)胞多為位于心肌梗死區(qū)周圍的心肌細(xì)胞,氯氨酮作用后Fas蛋白和Bl2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)較缺血再灌注組減少,低劑量組減少更多。見表2。表1各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡變化(略)表2大鼠心肌組織Fas與FasL蛋白陽性染色細(xì)胞指數(shù)的變化(略)23心肌組織病理學(xué)改變假手術(shù)組心肌組織未見細(xì)胞變性和壞死;心肌缺血再灌注各組均有明顯的心肌細(xì)胞濁腫灶性壞死,甚至可見多個(gè)互相連接的壞死灶。氯胺酮作用組細(xì)胞壞死情況減輕，壞死灶減少，低劑量氯胺酮作用組減輕程度更多。3討論研究說明，心肌缺血再灌注過程中除了細(xì)胞壞死外，還有另外一種細(xì)胞死亡形式即細(xì)胞凋亡1。早在90年代就有研究證實(shí)心肌缺血再灌注能引起心肌細(xì)胞凋亡2。本研究缺血再

9、灌注組較對(duì)照組的的心肌凋亡細(xì)胞明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。Fas蛋白是存在于細(xì)胞外表型膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員之一。在心肌細(xì)胞凋亡中，啟動(dòng)凋亡的一條最具特征性的可直接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑為以Fas受體/Fas配體(FasL)系統(tǒng)為代表的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而凋亡抑制基因Bl2可通過其抗氧化,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及抑制線粒體中細(xì)胞色素的釋放等作用,阻止細(xì)胞凋亡。普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡依賴于凋亡促進(jìn)基因與凋亡抑制基因表達(dá)產(chǎn)物的比值3。研究證實(shí)在缺血再灌注的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡明顯增加,同時(shí)伴有Fas程度的明顯增加4,5。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組Fas蛋白陽性率明顯增加，B

10、l2蛋白陽性率也明顯增加,而Fas/Bl2增加，說明心肌缺血再灌注能增加心肌中Fas和Bl2陽性蛋白表達(dá),使Fas/Bl2增加，從而導(dǎo)致心肌凋亡。早已有研究證實(shí),氯氨酮對(duì)心臟和心肌具有正性和負(fù)性的直接作用。近年研究證實(shí)6,氯胺酮通過抑制細(xì)胞膜電壓門控的a2+通道,降低細(xì)胞內(nèi)a2+濃度。已廣泛證實(shí)a2+通道通透性增加,心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載可導(dǎo)致心肌凋亡,從而導(dǎo)致心肌缺血再灌注。心肌缺血時(shí)a2+大量積聚,進(jìn)一步激活I(lǐng)P3和AP等第二信使,促使Fas，Bl2等基因的產(chǎn)生。而氯氨酮可能通過降低a2+濃度,降低IP3和AP等第二信使的產(chǎn)生,從而可能減少Fas和Bl2基因的產(chǎn)生,減少蛋白表達(dá)，在一定程度上抑止

11、心肌凋亡,減輕心肌缺血再灌注損傷。研究證實(shí)7,高濃度氯胺酮(110-3l/L)對(duì)心肌有直接抑制作用,而低中濃度氯胺酮(110-5l/L和110-4l/L),就沒有抑制作用,還具有正性變時(shí)變力效應(yīng),濃度越低(110-5l/L),作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)2g/kg氯氨酮和4g/kg氯氨酮作用組結(jié)果,心肌凋亡減輕,Fas和Bl2蛋白表達(dá)減少,Fas/Bl2增加較缺血再灌注組減少，病理切片也顯示壞死情況減輕，壞死灶減少,也證明中小劑量氯氨酮能減輕心肌凋亡和缺血再灌注損傷，而2g/kg氯氨酮作用更大。綜上所述,心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞發(fā)生壞死,Fas和Bl2蛋白陽性細(xì)胞增加,心肌細(xì)胞凋亡增加。氯氨酮可減少心肌凋

12、亡,減少Fas和Bl2蛋白陽性細(xì)胞表達(dá),且低劑量氯氨酮作用更大。參考文獻(xiàn)1Buerke.ardiprtetiveeffetfinsulin2likegrthfatrinyardialisheiaflledbyreperfusin.PrNatlAadSiUSA,1995,92:80312GttliebRA,BurlesnK,KlnerRA,etal.Reperfusininjuryin2duesapptsisinrabbitardiyytes.JlinInvest,1994,94:16211628.3JayanthiS,DengX,Brdeln,PaarS.ethaphetaineausesdi

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