不同細(xì)胞因子組合對(duì)人臍血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增及CD49d和CXCR4表達(dá)

1、差異細(xì)胞因子組合對(duì)人臍血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增及CD49d和CXCR4表達(dá)毛平，許力，莫文健，應(yīng)逸，許美麗，林秀梅【摘要】為了探究差異的細(xì)胞因子組合對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞體外的擴(kuò)增作用及擴(kuò)增后D49d和XR4的變革，將奇怪臍血標(biāo)天職離的單個(gè)核細(xì)胞接種于含有差異細(xì)胞因子組合的無血清無基質(zhì)造就體系中造就7天，在0天，7天檢測有核細(xì)胞數(shù)，D34+細(xì)胞數(shù)及D34+XR4+，D34+D49d+的細(xì)胞數(shù)和集落形成單元(FU)數(shù).按照差異細(xì)胞因子組合實(shí)行分組為：比擬組;SF組SF+FL;SFT組SF+FL+TP和SFT6組(SF+FL+TP+IL-6)。結(jié)果表白，和比擬組比擬，SF組合僅能低程度支持臍血造血細(xì)胞擴(kuò)增，

2、參加TP后即SF/FL/TP組合能有用的擴(kuò)增臍血細(xì)胞，但SFT和SFT6兩組之間差異卻無顯著產(chǎn)生P0.05；SF，SFT和SFT63組的細(xì)胞因子組合均可進(jìn)步臍血D34+細(xì)胞D49d，XR4的表達(dá)，但3組之間差異無明顯性P0.05。結(jié)論：SF組合可協(xié)同擴(kuò)增人造血細(xì)胞，但協(xié)同作用較弱；TP在臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增中起緊張調(diào)治作用，而IL-6作用不明顯;SF/FL/TP3種因子組合不但可促進(jìn)臍血造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增，而且可上調(diào)臍血造血細(xì)胞D49d，XR4表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】臍血EffetfDifferentytkinebinatinsntheExpressinfD49dandXR4andExvivExp

3、ansinfUbilialrdBldnnulearellsAbstratThisstudyaspurpsedtexplretheeffetfdifferentytkinebinatinsntheexpansinfthennulearellsdrivedfrubilialrdbldBexvivandexpressinfXR4andD49dnD34+ellsafterexpansin.HuanfreshBnnulearellsereulturedinseru-freeandstra-freeediuntainingdifferentbinatinsfytkinefr7days.Atdayand7，

4、thettalellsereunted，D34+ellsandD34+XR4+，D34+D49d+ellsereassayedbyflytetry，andFUeredeterined.Ardingtthedifferentbinatinsfytkine，experientseredividedintfurgrups:ntrl，SFgrup(SF+FL)，SFTgrup(SF+FL+TP)andSFT6grup(SF+FL+TP+IL-6).TheresultsshedthattheSF(SFgrup)binatinsupprtednlylexpansinfttalells，D34+ellsan

5、dFU.TheadditinfTPinSFgruprestredUBste/prgenitrsexpansintahigherlevelthanthatinSFgrup，hilethereasndifferenebeteengrupsSFTandSFT6(P0.05).TheytkinebinatinsingrupsSF，SFTandSFT6alluldupregulatetheexpressinlevelsfD49dandXR4nexpandedrdbldD34+ells，butthereerensignifiantdifferenesbeteengrupsSF，SFTandSFT6(P0.

6、05).ItisnludedthatSF+FLhasnstrngsynergistieffetsnpriitiveheatpietiells.TPplaysaniprtantrleinenhaningexpansinfubilialrdbldheatpietiells，hileIL-6nlyshsaneutraleffetnit.SF+FL+TPbinatinntnlyprtesprgenitrellsexpansinbutalsupregulatestheexpressinfD49dandXR4nD34+ellsfrrdbld.Keyrdsubilialrdbld;ytkinebinatin

7、;expansinexviv;nnulearell;D49d;XR4臍血作為一種新的造血干祖細(xì)胞泉源，如今已普及的用于臨床造血干細(xì)胞的移植，但是，由于單份臍血細(xì)胞所含的造血干細(xì)胞數(shù)目較少，且移植后中性粒細(xì)胞和血小板較骨髓和發(fā)動(dòng)的外周血移植后規(guī)復(fù)慢1，而體外擴(kuò)增臍血細(xì)胞有望能辦理這一題目。因此，對(duì)臍血造血祖細(xì)胞體外擴(kuò)增已成為血液學(xué)研究的熱門。抱負(fù)的擴(kuò)增方案應(yīng)該可以或許促進(jìn)造血祖細(xì)胞的增殖本領(lǐng)而且擴(kuò)增后的細(xì)胞可以或許歸巢到造血微情況和重制作血，這些與擴(kuò)增體系中的細(xì)胞因子的選擇和組合、擴(kuò)增之后臍血細(xì)胞歸巢和遷徙本擁有很大干系。本實(shí)行比力了差異因子組合對(duì)臍血造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增服從和擴(kuò)增后歸巢相干受體的變

8、革，以確定最正確的細(xì)胞因子組合，為擴(kuò)增臍血臨床應(yīng)用提供理論基矗質(zhì)料和要領(lǐng)標(biāo)本的網(wǎng)絡(luò)和制備10份臍血標(biāo)原泉源于本病院婦產(chǎn)科，采自康健正常臨盆的胎盤構(gòu)造，均勻網(wǎng)羅量為50-110l，肝素抗凝，24小時(shí)內(nèi)用羥乙基淀粉臍血羥乙基淀粉=51混淆，沉淀30-45分鐘，汲取上層細(xì)胞，加在含人淋巴細(xì)胞分散液Fill-Hypaque1.077的10l離心管中臍血人淋巴細(xì)胞分散液約=21，1800-2000轉(zhuǎn)/分，離心25分鐘，汲取細(xì)胞膜層部門，用PBS洗2次，用ID去黏附，2小時(shí)后調(diào)解細(xì)胞濃度備用。細(xì)胞因子及實(shí)行分組干細(xì)胞因子SF，F(xiàn)LT3配基FL，血小板天生素TP，白介素-6IL-6，均購于Peprteh公司

9、。SF、FL、IL-6終濃度為50ng/l，TP終濃度為20ng/l。按照差異細(xì)胞因子組合實(shí)行分組為：空缺比擬組，SF組SF+FL，SFT組SF+FL+TP，SFT6組(SF/FL+TP+IL-6)。臍血N體外造就StespanT造就液(Steell公司產(chǎn)物)含1%的BSA，10g/l胰島素，200g/l轉(zhuǎn)鐵卵白，10-4l/L2-E，2l/LL-谷氨酰胺及ID。臍血N以終濃度為1106接種于25l造就瓶，造就體系為6l，置于37、5%2飽和濕度條件下造就7天，造就第3天半量換液，于0，7天檢測各項(xiàng)指標(biāo)。造血祖細(xì)胞集落造就ethultTGF(H4434)(Steell公司產(chǎn)物)含1%甲基纖維素

10、，30%FB，1%BSA，10-4l/L2-E，50ng/lrhSF，50ng/lG-SF，10ng/lrhIL-3，3U/lrhEP，造血祖細(xì)胞集落造就14天后于倒置顯微鏡下記數(shù)FU數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測流式細(xì)胞儀為美國BetnDikinsn公司FASVantage產(chǎn)物，利用ellQuest軟件體系舉行闡發(fā)，用于人D34+，XR4+，D49d+細(xì)胞檢測的單克隆抗體別離為AP標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗D34單克隆抗體，F(xiàn)IT標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗D49d單克隆抗體，PE標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗XR4單克隆抗體。統(tǒng)計(jì)闡發(fā)運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包闡發(fā)，數(shù)據(jù)接納均數(shù)尺度差表現(xiàn)，組間比力接納方差闡發(fā)。結(jié)果體外擴(kuò)增歷程中有核細(xì)胞數(shù)及

11、D34+細(xì)胞數(shù)，F(xiàn)U數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)的變革顛末7天造就，比擬組有核細(xì)胞數(shù)及D34+細(xì)胞數(shù)均較0天落落，而FU數(shù)略高于0天，SF組中有核細(xì)胞數(shù)，D34+細(xì)胞數(shù)，F(xiàn)U數(shù)別離增長至10317，21956和25996，SFT組別離中增長到308161，569281和449141。造就7天后，SFT6組中有核細(xì)胞數(shù)和D34+細(xì)胞數(shù)，F(xiàn)U數(shù)也別離增長到274128，585251和535241。SF、SFT、SFT63組組間比力，SFT組擴(kuò)增結(jié)果優(yōu)于SF組(P0.05)，但SFT組和SFT6組之間差異無明顯性(P0.05)。SF、SFT、SFT63組與比擬組比擬，差異有明顯性(P0.05)表1。Table1.In

12、reentftheabslutenubersfTN，D34+ellsandFUnday7fultureindifferentgrthfatrbinatins(略)體外擴(kuò)增歷程后D49d和XR4表達(dá)的變革造就7天，比擬組D34+XR4+，D34+D49d+的細(xì)胞數(shù)均較0天落落，SF組，SFT組，SFT6組D34+XR4+，D34+D49d+的細(xì)胞數(shù)別離較0天擴(kuò)增到(6353)%和(309162)，(20481)%和(432214)，(22872)%和(413164)，和比擬組比擬，SF組、SFT組、SFT6組的擴(kuò)增結(jié)果均優(yōu)于比擬組，差異有明顯性P0.05，但SF組，SFT組，SFT6組3組之間差

13、異均無明顯性P0.05表2。Table2.InreentftheabsluenubersfD34+XR4+，D34+D49d+ellsafterexpansinfB(略)討論如今，國表里很多學(xué)者多利用分散純化的D34+細(xì)胞作為擴(kuò)增造就的起始細(xì)胞，但是在分散純化D34+細(xì)胞的歷程中不成制止造成干/祖細(xì)胞的喪失，對(duì)付象臍血如許網(wǎng)羅到的細(xì)胞數(shù)有限的移植物而言，末了的總細(xì)胞產(chǎn)量將受到顯著影響。因此，對(duì)付體外擴(kuò)增臍血細(xì)胞，分散純化D34+細(xì)胞似無需要，且大多數(shù)黏附分子像D49d，D44，XR4不但存在于早期造血細(xì)胞上，而且也存在于像單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞這些有核細(xì)胞上。以是，D34+細(xì)胞和其他的有核細(xì)胞都

14、表達(dá)和歸巢有關(guān)的黏附分子和趨化因子受體2。別的，臍血造血干細(xì)胞移植，其植入的速率重要和整個(gè)有核細(xì)胞記數(shù)有關(guān)，而不是和D34+細(xì)胞記數(shù)有關(guān)3。因此，本實(shí)行選用單個(gè)核細(xì)胞作為擴(kuò)增造就的起始細(xì)胞。國表里已有研究表白，差異的生長因子組合可以或許在無基質(zhì)支持的造就體系中促進(jìn)人造血細(xì)胞的擴(kuò)增4，5，但對(duì)付何種細(xì)胞因子組合是最正確的組合如今尚不決論。一些研究證明，SF、FL兩因子可協(xié)同擴(kuò)增人造血細(xì)胞，而TP既可調(diào)控巨核細(xì)胞天生，又可促進(jìn)早期造血細(xì)胞的增殖6。比來有研究以為，IL-6是一種早期細(xì)胞作用因子，可以或許維持G0期HS/HP的存活，并能促進(jìn)早期細(xì)胞的擴(kuò)增7，因此本實(shí)行將SF、FL、TP，IL-64種

15、造血因子舉行差異組合，探究它們?cè)谀氀w外擴(kuò)增中的作用。結(jié)果表現(xiàn)，顛末7天的造就，各時(shí)間點(diǎn)FL和SF2細(xì)胞因子組合擴(kuò)增人臍血造血細(xì)胞數(shù)較之比擬組有輕度進(jìn)步，這表白FL+SF組合在無基質(zhì)懸浮造就體系中可協(xié)同擴(kuò)增人臍血造血細(xì)胞，但協(xié)同作用較弱。然而在FL+SF組合的底子上，參加TP后，創(chuàng)造有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、D34+細(xì)胞、FU數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)與SF組合比力，均能顯著擴(kuò)增臍血造血祖細(xì)胞，表白TP可維持原始造血細(xì)胞的存活并能促進(jìn)祖細(xì)胞的擴(kuò)增。我們?cè)贔L+SF+TP3因子組合的底子上再參加IL-6后，創(chuàng)造4因子組合固然較比擬組和FL+SF組合可有用地?cái)U(kuò)增臍血造血祖細(xì)胞，但和FL+SF+TP3因子組合比力起來，各時(shí)間

16、點(diǎn)數(shù)據(jù)卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這表白IL-6在臍血造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增中不起顯著的促進(jìn)作用8，3因子組合SF+FL+TP對(duì)付體外擴(kuò)增臍血是充足的。體外擴(kuò)增的造血細(xì)胞可否重制作血起首必要造血細(xì)胞可以或許歸巢到受體骨髓微情況，而造血細(xì)胞的歸巢是一個(gè)龐大的歷程，其機(jī)制如今還不明晰。就如今研究的結(jié)果來說，造血細(xì)胞的歸巢與黏附分子的表達(dá)、體外擴(kuò)增時(shí)細(xì)胞因子的選擇嚴(yán)密相干9?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1在造血細(xì)胞的遷徙、定居、增殖和分化中起著緊張作用，XR4是如今的SDF-1唯一受體，在多種造血細(xì)胞外貌都有較高程度的表達(dá)，上調(diào)造血細(xì)胞上XR4的表達(dá)可以或許增能人臍血細(xì)胞的植入潛能。D49d是黏附分子家

17、屬的一個(gè)緊張成員，在移植后的細(xì)胞早期歸巢到造血微情況起緊張作用，表達(dá)高程度的D49d的細(xì)胞每每有較高的增殖活性，并可以或許增長移植細(xì)胞的植入本領(lǐng)10。因此，本實(shí)行探究了差異因子組合對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增后D49d和XR4表達(dá)的影響，結(jié)果創(chuàng)造，顛末6天的造就，SF組、SFT組、SFT6組3組D34+XR4+和D34+D49d+的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均優(yōu)于比擬組，差異有明顯性P0.05，提示SF組、SFT組、SFT6組各組細(xì)胞因子組合均可進(jìn)步造血細(xì)胞上D49d、XR4表達(dá)。而SF組和SFT組之間差異卻無明顯性P0.05，這說明在SF+FL兩因子組合的底子上參加TP后，固然可進(jìn)步祖細(xì)胞的數(shù)目4，卻不克不及進(jìn)步D34+細(xì)胞上XR4、D49d的表達(dá)。SFT組與SFT6組比力，差異仍無明顯性P0.05，提示IL-6在促進(jìn)造血細(xì)胞的歸巢方面大概不起作用10。有研究證明，造血細(xì)胞上黏附分子的維持或上調(diào)表達(dá)在擴(kuò)增后的細(xì)胞可否植入受體起關(guān)鍵作用11，而可否植入受體取決于造血細(xì)胞可以或許歸巢到造血微情況。本實(shí)行的結(jié)果表現(xiàn)，經(jīng)SF、SFT、SFT63組細(xì)胞因子介導(dǎo)的臍血細(xì)胞體外擴(kuò)增均可進(jìn)步臍血D34+細(xì)胞上XR