貼壁培養(yǎng)細(xì)胞表面形貌的掃描電鏡觀察

1、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞表面形貌的掃描電鏡觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鈷呙桦婄R生物樣品制備的基本過(guò)程了解掃描電鏡的基本操作【實(shí)驗(yàn)原理】掃描電鏡的電子學(xué)系統(tǒng)電子槍組成部分為聚光鏡和物鏡等。由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡和物鏡的匯聚作用形成了極細(xì)的電子束照射樣品。在掃描線圈的作用下，入射電子束在樣品表面作柵狀掃描。由入射電子和樣品相互作用所產(chǎn)生的二次電子經(jīng)樣品上方的光電倍增管檢測(cè)并輸出一電信號(hào)。該電信號(hào)由視頻放大器放大后輸入顯像管的柵極，用來(lái)調(diào)制其亮度。由于顯像管上某點(diǎn)的亮度由樣品上對(duì)應(yīng)點(diǎn)所產(chǎn)生的二次電子信號(hào)調(diào)制，所以在顯像管上可以顯示樣品的表面形貌的圖像。二次電子像的分辨力近似等于入射電子束斑直徑，二次電子像景深大，

2、像的立體感強(qiáng)。二次電子像的反差由樣品的表面形貌所決定。樣品臨界點(diǎn)干燥的原理：臨界點(diǎn)干燥可以避免干燥過(guò)程中樣品表面形貌受到破壞。當(dāng)液體和氣體二相體系的溫度和壓力增加時(shí)，氣體的密度逐漸增高，而液體的密度逐漸降低。待溫度和壓力增加至特定值時(shí)，氣體和液體二相的密度相等，兩相之間的界面消失，表面張力等于零，該體系處于臨界點(diǎn)。此后繼續(xù)增大壓力，體系中氣體不會(huì)轉(zhuǎn)變成液體從而可以達(dá)到干燥樣品的目的?！緦?shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑及用品】一儀器：掃描電鏡(HITACHIS-4800)、臨界點(diǎn)干燥儀(HITACHIHCP-2)、離子濺射鍍膜儀(EIKOIB-3)二材料：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(HeLa細(xì)胞和CHO細(xì)胞)三試劑：2.

3、5%戊二醛溶液、磷酸緩沖液、乙酸異戊酯、乙醇、雙蒸水等四用品：培養(yǎng)皿、蓋玻片、鑷子、移液器、雙面膠帶、掃描電鏡樣品臺(tái)等【實(shí)驗(yàn)步驟】1取材：用0.1M磷酸緩沖液洗凈(兩次)2固定：用2.5%戊二醛溶液室溫于通風(fēng)廚固定1小時(shí)。固定完后用0.1M磷酸緩沖液和蒸餾水充分洗凈。脫水：洗凈后用30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%,100%乙醇逐漸上升脫水。每級(jí)各10分鐘左右。干燥：進(jìn)行自然干燥。噴鍍：將已干燥好的樣品用導(dǎo)電膠粘于金屬的樣臺(tái)上,再一起置于真空噴鍍儀真空罩中,進(jìn)行噴鍍金鉑合金鍍層。掃描電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.HeLa細(xì)胞與CHO細(xì)胞比較HeLa細(xì)胞表面具有豐富的微絨毛，形狀

4、近似球星CHO細(xì)胞表面具有微絨毛，有些呈橢圓形，有些長(zhǎng)圓形。2.自然干燥和臨界點(diǎn)干燥細(xì)胞觀察比較下面為自然干燥后觀察的細(xì)胞，與上面的臨界點(diǎn)干燥后細(xì)胞比較后可以看出自然干燥的細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，很難觀察其真實(shí)結(jié)構(gòu)；而臨界點(diǎn)干燥后觀察的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚。思考題】為什么選擇CO2作為臨界點(diǎn)干燥的工作介質(zhì)？在自然干燥時(shí)，液體的蒸汽壓大于空氣的蒸汽壓，由于表面張力的作用，細(xì)胞受外界液體往下的拉力，易破壞細(xì)胞表面的形貌，所觀察到的二次電子圖像就不能真實(shí)地反映出樣品表面的形態(tài)信息。而在CO2的臨界條件（31C和7.4MPa）下，液體的蒸汽壓等于氣體的蒸汽壓,液體表面張力為0,細(xì)胞表面較好地保存其原始形態(tài)，所以選擇CO2作為臨界點(diǎn)干燥的工作介質(zhì)。生物樣品在掃描電鏡觀察前，為什么要進(jìn)行金屬噴鍍處理？掃描電鏡的原理是通過(guò)高能電子入射樣品原子激發(fā)產(chǎn)生二次電子，通過(guò)收集二次電子的信息成像