生物化學(xué)2.1蛋白質(zhì)性質(zhì)

1、蛋白質(zhì)的變異與分子病 分子病 指蛋白質(zhì)分子中由于AA排列順序與正常蛋白質(zhì)不同而發(fā)生的一種遺傳病(基因突變?cè)斐傻?。鐮刀形貧血病：病因：血紅蛋白AA順序的細(xì)微變化 -鏈N端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys鐮刀形貧血?。翰∪梭w內(nèi)血紅蛋白的含量乃至紅細(xì)胞的量都較正常人少，且紅細(xì)胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細(xì)胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細(xì)胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機(jī)能降低，使

2、臟器官供血出現(xiàn)障礙，從而引起頭昏、胸悶而導(dǎo)致死亡。鐮刀狀紅細(xì)胞與正常血紅細(xì)胞.鐮刀狀紅細(xì)胞貧血:病變細(xì)胞正常紅細(xì)胞鐮刀形紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖 谷氨酸在生理pH值下為帶負(fù)電荷R基氨基酸，而纈氨酸卻是一種非極性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷電性發(fā)生改變，引起等電點(diǎn)改變，溶解度降低，使之不正常地聚集成纖維狀血紅蛋白，致使紅細(xì)胞變形成鐮刀狀,輸氧功能下降,細(xì)胞脆弱易溶血.鐮刀型貧血病鐮刀狀紅細(xì)胞貧血:變形及后果鐮刀狀紅細(xì)胞的疏水基團(tuán)造成聚集這種聚集造成鐮刀型血紅蛋白纖維化鐮刀型血紅蛋白的地域性非洲大地流行瘧疾，使人類在進(jìn)化中作出痛苦的選擇 瘧原蟲 瘧原蟲 雜合子 父系HbS

3、 瘧疾 母系HbS 正常人 單系HbS 可抵抗瘧原蟲 使人患瘧疾 可活到30歲左右 童年死亡 死于瘧疾 但可有生育能力 一、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)第六節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)分離純化手段第六節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)和分離純化手段一 、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在10 0001 000 000之間。測(cè)定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計(jì)）：蛋白質(zhì)顆粒在2550*104 g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)

4、（s）：單位（cm）離心場(chǎng)里的沉降速度。沉降系數(shù)的單位常用S，1S=110-13（s） v =沉降速度（dx/dt）=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s） x =蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm） s = v2x離心機(jī)圖示二、蛋白質(zhì)的兩性解離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點(diǎn)pH時(shí)為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開。1. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。3. 紙上電泳：用濾紙作支持物。等電聚焦

5、電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。+5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度+三 、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層） 2）帶相同電荷 （雙電層）布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力酸酸堿堿堿酸 溶液中蛋白質(zhì)的聚沉 COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PHPI用于分離物質(zhì)的原理：以生物大分子為例闡明電荷來源：四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1. 加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)

6、鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。鹽析 在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方

7、法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。 各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。不可逆沉淀在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀的常用方法：1. 加有機(jī)溶劑2 加重金屬鹽3. 加生物堿試劑單寧酸、苦味酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑可逆沉淀在溫和條件

8、下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。五、蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation） 發(fā)生變性的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（構(gòu)型）和分子量不變，高級(jí)結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）遭到破壞。變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結(jié)晶能力喪失，分

9、子形狀改變，肽鏈松散，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被酶消化。有些蛋白質(zhì)的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)（復(fù)性作用）。變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。變性作用 蛋白質(zhì)復(fù)性四.蛋白質(zhì)分離純化的一般程序1.前處理 生物組織 破碎、溶解、離心分離 蛋白質(zhì)提取液2.粗分級(jí) 鹽析、等電點(diǎn)沉淀、超濾、有機(jī)溶劑分級(jí)分離3.細(xì)分級(jí) 層析、電泳 精制品4.結(jié)晶 結(jié)晶或凍干粉 適宜介質(zhì)2、根據(jù)溶解度分等電點(diǎn)沉淀鹽析（常用硫酸銨

10、）有機(jī)溶劑沉淀3、根據(jù)電離性質(zhì)分電泳離子交換層析1、根據(jù)分子大小分透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析四、分離純化的方法4、特異親和力： 親和層析沉降平衡離心法沉降速度離心法蛋白質(zhì)的分離純化測(cè)定（一）根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化1、透析和超過濾 透析和超過濾都是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)分開。 超過濾是利用壓力或離心力，強(qiáng)使水和其它小分子溶液透過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。凝膠過濾又稱分子篩層析（molecular-sieve chromatography)。這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠過濾是一種柱層析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常

11、用的有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)和瓊脂糖凝膠（商品名為.Sepharose）等。葡聚糖凝膠是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，它的“網(wǎng)孔”大小可以通過控制交聯(lián)劑與葡聚糖的比例來達(dá)到。不同型號(hào)的葡聚糖凝膠裝在層析柱中，不同分子的蛋白質(zhì)混合物借助重力通過層析柱時(shí)，比“網(wǎng)孔”大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)格內(nèi)，而被排阻在凝膠粒之外，隨著洗脫劑通過凝膠粒外圍而流出；比“網(wǎng)孔”小的分子則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠粒內(nèi)部，然后再可逆地?cái)U(kuò)散出來通過下層凝膠。這樣，由于不同大小的分子所經(jīng)路程不同而得以分離，大分子先洗下來，小分子后洗下來。 凝膠過濾層析原理凝膠層析葡聚糖的合成親合層析 親和層析 ( affinit

12、y chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法。它經(jīng)常只需經(jīng)過一步的處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法根據(jù)的是某些蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)性質(zhì)，即它們與另一種稱為配體的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合。親和層析（二）根據(jù)電荷不同的分離方法1.電泳 在外界電場(chǎng)的影響下，如果蛋白質(zhì)不處于等電點(diǎn)狀態(tài)，它將向電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。純化中應(yīng)用最多的是聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，它們既可以作為蛋白質(zhì)純度檢驗(yàn)方法，也可以純度、制備蛋白質(zhì)。電泳的影響因素1. 待分離大分子的性質(zhì) ：所帶的電荷、分子大小和形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形

13、狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快 2. 緩沖液pH和離子強(qiáng)度：pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大 ；但是pH過高或過低引起蛋白變性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度；強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易維持PH恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強(qiáng)度為0.02-0.2之間。凝膠電泳法 本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。臨床醫(yī)學(xué)常用血清蛋白間相對(duì)百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。 醋酸纖維膜是由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)

14、學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、類固醇及同工酶等。它具有微量、快速、簡便、分辨力高，對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。電滲作用雖然較高但很均一 ，不影響樣品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度?。s10100m），樣品用量很少，不適于制備。 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）+白蛋白(A)12（三）血漿蛋白的分類 通過鹽析法將血漿蛋白質(zhì)分為清蛋白和球蛋白兩大類。通過醋酸纖維膜電泳或瓊脂糖凝膠電泳將血漿蛋白質(zhì)分成清蛋白和1、2、-球蛋白等

15、五個(gè)主要區(qū)帶 。電泳照片示例凝膠電泳法五 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（一）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：1.紫外光吸收法：此法是用紫外吸收分光光度計(jì)在紫外光區(qū)測(cè)定蛋白質(zhì)的光吸收，從而測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。 2.雙縮脲法在強(qiáng)堿性溶液中，蛋白質(zhì)與CuSO4反應(yīng)，生成紫紅色化合物，這個(gè)反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)（biuret reaction)。在堿性條件下，蛋白質(zhì)與CuSO4所生成的顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃渡成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸組成無關(guān)。將樣品同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)同時(shí)試驗(yàn)，并于540-560nm波長下側(cè)其光吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線即可求得蛋白質(zhì)的含量。此方法簡便、迅速，不受蛋白質(zhì)特異性的影響，但方法的靈敏度較差，所需樣品量大

16、（0.2-1.7mg/ml）。3福林一酚試劑法福林一酚試劑（Folin-phenol reagent )包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸及磷鎢酸的混合試劑。堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，這是蛋白質(zhì)中肽鍵的反應(yīng)，這種被作用的蛋白質(zhì)中的酚基（酪氨酸），在堿性條件下很容易將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，所生成藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此，在650nm或660nm波長下測(cè)定光吸收值，即可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。這個(gè)方法實(shí)際上是勞里（Lowry, O, H., 1951）在原方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)了的，常稱Lowry法，具有操作簡便、靈敏度高（比雙縮脲法靈敏100倍）等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)測(cè)定范圍為25-250g/ml。但不同蛋白質(zhì)顯色強(qiáng)度稍有不同，而且酚類物質(zhì)和檸檬酸有干擾。 一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的元素組成 二、蛋白質(zhì)的分類 三、蛋白質(zhì)的大小與分子量四、蛋白質(zhì)的功能五、蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次二、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位氨基酸一、蛋白質(zhì)的水解二、氨基酸的一般結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其分類三、氨基酸的兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)四、氨基酸的化學(xué)反應(yīng)五、氨基酸的旋光性和光吸收 本章總結(jié)三、肽一、肽與肽鍵的結(jié)構(gòu)二、肽單位（二面角）三、肽鏈中AA的排列順序和命名四、天然存在的活性肽四、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定）二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)