細(xì)胞因子檢測

1、關(guān)于細(xì)胞因子檢測第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞因子 一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。 白細(xì)胞介素(interleukin, IL)干擾素(interferon, IFN)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)生長因子(growth factor, GF)趨化因子(chemokine)第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：敏感、可靠；缺點(diǎn)：需長期飼養(yǎng)細(xì)胞、檢測耗時長、步驟繁雜。1不同的CK具有不同的生物學(xué)活性

2、，選擇CK獨(dú)特的生物學(xué)活性，即可檢測。細(xì)胞增殖/抑制實驗細(xì)胞病變抑制實驗細(xì)胞毒實驗細(xì)胞趨化實驗。生物學(xué)檢測法細(xì)胞因子的檢測方法2利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。免疫學(xué)檢測法優(yōu)點(diǎn)：方便、迅速缺點(diǎn)：價格昂貴，結(jié)果僅代表CK的量而非活性，敏感性較低。3利用基因探針，檢測特定細(xì)胞因子基因表達(dá)，即mRNA水平。斑點(diǎn)雜交Northern印跡細(xì)胞和組織原位雜交RT-PCR。分子生物學(xué)檢測法局限性：僅能檢測基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)細(xì)胞因子的濃度和活性，只用于機(jī)制探討。第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月待檢樣品(細(xì)胞上清) 指示細(xì)

3、胞（CTLL-2）IL-2依賴細(xì)胞系按不同稀釋度加入37C，16-20小時加入3HTdR（1-5Ci）37C，4-6小時收集細(xì)胞測定細(xì)胞增殖實驗第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞病變抑制實驗待檢樣品（細(xì)胞上清） IFN-指示細(xì)胞（wish）按不同稀釋度加入37C，4小時37C，24-48小時棄取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Using CFSE to track CML progenitor proliferationSDMSDM + Glivec第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Calcu

4、lation of Proliferative Index (P.I.)CFSE -4 3 2 1 0The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells.It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.第七張，

5、PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)第八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Chromium-51 (51Cr) release assays第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月計數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化實驗示意圖微孔濾膜第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測定的。免疫標(biāo)記技術(shù)第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 高通量細(xì)胞因子檢測CBA (Cytometric

6、Bead Array)是一種微珠多用途檢測分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時檢測多項指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數(shù)據(jù)。第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Cytokine network第十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月CBA原理示意圖第十六張，

7、PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Lab Invest 2003, 83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實驗)ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子。實驗中每個斑點(diǎn)（spot）是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個活性淋巴細(xì)胞。它可在單細(xì)胞水平檢測淋巴細(xì)胞對特異性抗原的反應(yīng)能力。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術(shù)。可檢測到百萬分之一陽性細(xì)胞率; 單細(xì)胞水平、

8、活細(xì)胞功能檢測; 操作簡便，可進(jìn)行高通量篩選。第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；3.加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；4.移出細(xì)胞，洗滌；5.加入生物素標(biāo)記的二抗；6.加入酶標(biāo)鏈霉親和素；7.加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；8.斑點(diǎn)計數(shù)（可人工計數(shù)，也可用自動讀板儀計數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。ELISPOT第二十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng) 用移植研究-allograft rejec

9、tion 疫苗開發(fā)-亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響 Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析 自體免疫研究-免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究 癌癥研究-腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用 過敏機(jī)制探討-IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究 傳染疾病研究-Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等 第二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月MediumPHAPeptide 1Peptide 21Peptide 47Gz

10、BHIV- peptide recall patient BIFN- gHIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- g and GzBKleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392第二十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT 和 ELISA的區(qū)別ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展，它們最大的不同: 1.ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性

11、蛋白總量(整體水平);ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)，1個斑點(diǎn)代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率（單細(xì)胞水平）；2.ELISPOT比ELISA更敏感。ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測等。第二十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF-的測定R1：淋巴細(xì)胞；R2：單核細(xì)胞第二十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月TNF-的誘生和檢測主要由單核/巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細(xì)胞;THP-1(人