山銀花含量分析方法確認(rèn)方案

1、 9/15山銀花含量分析方法確認(rèn)方案方案編號(hào)：JYYZFA- 09 - 00起草 日期審核 日期批準(zhǔn) 日期上海松華藥業(yè)有限公司目 錄一、確認(rèn)方案概述 3二、確認(rèn)范圍和目的 3三、確認(rèn)組織及分工 3四、確認(rèn)進(jìn)度計(jì)劃 4五、前期準(zhǔn)備及確認(rèn)相關(guān)支持 4六、確認(rèn)方式 5七、確認(rèn)實(shí)施項(xiàng)目及內(nèi)容 5八、確認(rèn)過(guò)程及結(jié)果詳見(jiàn)此方案配套驗(yàn)證報(bào)告 11九、確認(rèn)過(guò)程偏差 11十、再確認(rèn)或驗(yàn)證時(shí)間及建議 11十一、附件 11附件1參加人員會(huì)簽及驗(yàn)證結(jié)論12附件2 驗(yàn)證小組培訓(xùn)記錄 13一、確認(rèn)方案概述:傳統(tǒng)中藥飲片山銀花為中國(guó)藥典長(zhǎng)期收載品種，幾次藥典修訂此品種的含量測(cè)定方法及實(shí)驗(yàn)條件均未變動(dòng)。采用HPLC-UV-E

2、LSD聯(lián)動(dòng)測(cè)定山銀花中綠原酸 、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量。根據(jù)GMP要求，企業(yè)應(yīng)對(duì)變更后的檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法確認(rèn)，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。為了確保此檢驗(yàn)條件的準(zhǔn)確性和符合性特依據(jù)中國(guó)藥典分析技術(shù)檢測(cè)技術(shù)指南及藥品GMP指南、2015版中國(guó)藥典四部、一部相關(guān)部分要求結(jié)合上海市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室老師指導(dǎo)起草此確認(rèn)方案。對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。二、確認(rèn)范圍和目的本方案適用于2015版中國(guó)藥典一部山銀花含量項(xiàng)下所涉及的相關(guān)內(nèi)容。1.通過(guò)確認(rèn)證明現(xiàn)行藥典所采用的方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求，保證該方法在我公司實(shí)驗(yàn)室具有良好的適用性。2.確認(rèn)公司所配備硬件、軟件即實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及人員

3、符合并熟練撐握此實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。3.確認(rèn)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需變更時(shí)，應(yīng)填寫(xiě)確認(rèn)方案變更申請(qǐng)及批準(zhǔn)，報(bào)驗(yàn)證小組批準(zhǔn)。三、確認(rèn)組織及分工姓名部門(mén)確認(rèn)分工李志勇質(zhì)量部負(fù)責(zé)對(duì)確認(rèn)中出現(xiàn)的問(wèn)題提出指導(dǎo)意見(jiàn)，負(fù)責(zé)審核批準(zhǔn)報(bào)告。韓子佩QA部負(fù)責(zé)審核確認(rèn)方案、確認(rèn)報(bào)告。劉潤(rùn)雅QC部負(fù)責(zé)起草確認(rèn)方案，協(xié)調(diào)確認(rèn)試驗(yàn)安排及實(shí)施，收集各項(xiàng)確認(rèn)、試驗(yàn)記錄，并起草確認(rèn)報(bào)告。協(xié)助完成試驗(yàn)徐婷、韓曉鳳QC部含量檢驗(yàn)方法確認(rèn)的實(shí)施。四、確認(rèn)進(jìn)度計(jì)劃2019年06月03日2019年06月30日五、前期準(zhǔn)備及確認(rèn)相關(guān)支持5.1方案培訓(xùn)參與本次方法確認(rèn)的人員均應(yīng)過(guò)該方案的培訓(xùn)，培訓(xùn)記錄表見(jiàn)附件。5.

4、2文件資料（1）相關(guān)SOP文件資料方法確認(rèn)所需文件序號(hào)文件名稱(chēng)文件編號(hào)生效日期是/否現(xiàn)行版文件1島津高效液高效液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作程序是 否2CP124S電子天平標(biāo)準(zhǔn)操作程序是 否3Varian380-LC蒸發(fā)光散射器標(biāo)準(zhǔn)操作程序是 否4金銀花露檢驗(yàn)操作檢驗(yàn)規(guī)程是 否（2）所有與確認(rèn)有關(guān)的儀器、儀表、計(jì)量器具應(yīng)進(jìn)行過(guò)校驗(yàn)，并達(dá)到合格要求。儀器儀表檢定記錄序號(hào)儀器型號(hào)/名稱(chēng)儀器編號(hào)校驗(yàn)日期是/否在有效期內(nèi)1島津高效液相色譜儀是 否2Varian380-LC蒸發(fā)光散射器標(biāo)準(zhǔn)操作程序是 否3CP124S電子天平是 否4BT 25 S精密電子天平是 否5容量瓶（ ）是 否6移液管（ ）是 否（3） 對(duì)照

5、品、供試品及試劑及耗材信息名稱(chēng)批號(hào)來(lái)源取用量對(duì)照品綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續(xù)斷忍冬皂苷乙供試品山銀花山銀花試劑乙腈乙酸甲醇色譜柱六、確認(rèn)方式依據(jù)法規(guī)藥品GMP指南之分析方法驗(yàn)證和確認(rèn)要求，采用方式一進(jìn)行：即，由兩名檢驗(yàn)人員分別獨(dú)立對(duì)同一批產(chǎn)品（如必要用不同儀器）進(jìn)行檢驗(yàn)。比較兩人檢測(cè)關(guān)鍵項(xiàng)目及結(jié)果來(lái)證明方法在本實(shí)驗(yàn)室的適用性。七、確認(rèn)實(shí)施項(xiàng)目及內(nèi)容7.1 確認(rèn)前準(zhǔn)備 7.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：7.1.1.1固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠。流動(dòng)相：A相：乙腈 B相：0.4%醋酸溶液按下表進(jìn)行梯度洗脫時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）01011.51588.5851012121818

6、301529293333458164716767557.1.1.2檢測(cè)條件：UV 綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)：330nm。 ELSD 皂苷用蒸發(fā)光散射器檢測(cè)。7.1.1.3 理論板數(shù)：按綠原酸峰計(jì)算不低于1000。7.1.1.4 開(kāi)啟儀器并按上述色譜條件及工作站界面要求進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)設(shè)定與系統(tǒng)預(yù)平衡。7.1.2 對(duì)照品溶液配制： 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品約12.5mg、含灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品約15mg，置25ml棕色量瓶中，另取川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品約10mg，置10ml棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，精密量取5ml至上上述25ml棕色量瓶中加50%甲醇定容，制成每1ml含綠原酸0.5mg、含灰氈毛忍冬皂

7、苷乙0.6mg和川續(xù)斷皂苷乙0.2mg的混合溶液，即得。7.1.3 供試品溶液配制： 取供試品粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.5g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率300W，頻率40kHz）40分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。7.1.4 計(jì)算公式1：綠原酸：y=ax+b 式中：y為對(duì)照品或樣品峰面積或峰高； x為對(duì)照品或樣品的進(jìn)樣質(zhì)量。公式2：兩皂苷：LgA=aLgC+b式中： A為對(duì)照品或樣品峰面積或峰高； 7.1.4 檢驗(yàn)結(jié)果判定本品按干燥品計(jì)算，含綠原酸（C16H18O9）不少于2.0%,含灰氈毛忍冬皂苷乙

8、(C65H106O32) 和川續(xù)斷皂苷乙(C53H86O22)的總量不得少于5.0。即為符合規(guī)定。7.2專(zhuān)屬性確認(rèn)分別精密量取陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、及供試品溶液各10l，依次注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)： 1、HPLC：檢測(cè)波長(zhǎng)330nm：供試品溶液中綠原酸保留時(shí)間與對(duì)照溶液中綠原酸峰保留時(shí)間一致。綠原酸峰理論塔板數(shù)不低于1000。2、ELSD陰性對(duì)照?qǐng)D譜中無(wú)干擾色譜峰；對(duì)照品色譜與供試品色譜峰中灰氈毛忍冬皂苷乙峰與川續(xù)斷忍冬皂苷乙相應(yīng)位置上無(wú)干擾色譜峰，且出峰保留時(shí)間一致。 表2綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的專(zhuān)屬性結(jié)果 項(xiàng)目名稱(chēng) 保留時(shí)間R第一人檢測(cè)結(jié)果

9、第二人檢測(cè)結(jié)果對(duì)照品樣品對(duì)照品樣品綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續(xù)斷忍冬皂苷乙結(jié)論匯總?cè)?日期： 復(fù)核人/日期：7.3 準(zhǔn)確度 （兩點(diǎn)法通過(guò)線性關(guān)系）考察7.3.1待系統(tǒng)平衡后將混合對(duì)照品溶液按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液2ul、|10ul,為一組數(shù)據(jù)；2ul、|10ul結(jié)合 4ul、|8ul,為第二組、分別進(jìn)樣2針（可跟據(jù)驗(yàn)證實(shí)際情況做合法調(diào)整），觀察測(cè)定各峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中綠原酸以峰面積 Y對(duì)綠原酸對(duì)照品濃度 X進(jìn)行線性回歸,而灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙則分別以峰面積 Y對(duì)相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品濃度 X的 log對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸。3個(gè)成分的線性方程見(jiàn)表 3。可接受標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良

10、好，且R20.999表 3綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的線性方程：名稱(chēng)第一人檢測(cè)第二人檢測(cè)檢驗(yàn)員檢驗(yàn)日期色譜柱信息實(shí)驗(yàn)組別信息第一組第二組第一組第二組 檢測(cè)結(jié)果成分線性方程R2線性方程R2線性方程R2線性方程R2綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續(xù)斷忍冬皂苷乙結(jié)論產(chǎn)品批號(hào)： 匯總?cè)?日期： 復(fù)核人/日期： 15/157.4精密度7. 4.1重復(fù)性精密吸取樣品溶液各510L,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 5次 ,測(cè)得綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙峰面積的記錄色譜圖RSD(n=5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別匯總附件）?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：5針主峰峰面積RSD不大于2%。ELSD主峰峰面積RSD不大于5%符合標(biāo)準(zhǔn)表明儀

11、器精密度良好， （由于ELSD檢測(cè)器性能所限如遇個(gè)別參數(shù)超標(biāo)可視風(fēng)險(xiǎn)而判定）。名稱(chēng)測(cè)定結(jié)果RSD12345平均綠原酸灰氈毛忍冬皂苷乙川續(xù)斷忍冬皂苷乙結(jié)論表4 含量精密度（重復(fù)性）測(cè)定結(jié)果匯總?cè)?日期： 復(fù)核人/日期：7. 4.2中間精密度及穩(wěn)定性由兩名實(shí)驗(yàn)員在不同天，分別用同一批對(duì)品溶液及配制供試品溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣分析，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別匯總相應(yīng)附件。表5含量中間精密度測(cè)定結(jié)果供試品批號(hào)： 名稱(chēng)第一人檢測(cè)第二人檢測(cè)檢驗(yàn)員檢驗(yàn)日期儀器編號(hào)色譜柱綠原酸灰氈毛+川續(xù)斷兩次相對(duì)平均偏差綠原酸灰+川結(jié)論匯總?cè)?日期： 復(fù)核人/日期：7.4.3樣品測(cè)試（測(cè)試過(guò)程及實(shí)驗(yàn)信息詳見(jiàn)配套報(bào)告）可接受標(biāo)準(zhǔn)

12、：按藥典山銀花項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)判定其是否合格。7.4.3.1實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)試；選用確認(rèn)批次山銀花YG05- 按現(xiàn)行藥典方法測(cè)試。7.4.3.2重現(xiàn)性測(cè)試；選用確認(rèn)批次山銀花YG05- 按本方案確認(rèn)方法委托第三方進(jìn)行測(cè)試結(jié)果同本單位結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，證明儀器及方法的重性。7.5耐用性7.5.1應(yīng)用HPLC-UV-ELSD法進(jìn)行山銀花含量測(cè)定的方法學(xué)考察過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)ELSD 檢測(cè)器的漂移管溫度和載氣流速對(duì)儀器的基線噪音和被測(cè)樣品的響應(yīng)值影響較大，最佳的參數(shù)應(yīng)該是可接受噪音的最低溫度和獲得最大檢測(cè)響應(yīng)值的最低氣體流量。本試驗(yàn)通過(guò)分別逐漸改變漂移管溫度和霧化器氣體流量，記錄峰面積的變化，選擇了最優(yōu)的溫度和載氣氮?dú)獾牧魉?，漂移管溫度、載氣流量 確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件（見(jiàn)配套報(bào)告）。八、確認(rèn)過(guò)程及結(jié)果詳見(jiàn)此方案配套驗(yàn)證報(bào)告九、確認(rèn)過(guò)程偏差在確認(rèn)實(shí)施過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的偏差必須進(jìn)行記錄和分析（表6）。內(nèi)容要包括：偏差的表現(xiàn)、查找引起偏差的原因及查找過(guò)程、偏差分析的結(jié)果、此偏差是否對(duì)驗(yàn)證結(jié)論有影響、有何影響。偏差概述引起偏差的原因及查找過(guò)程偏差分析及解決方案糾正和預(yù)防結(jié)論確認(rèn)人員/日期審核人員/日期批準(zhǔn)人員/日期偏差調(diào)查處理報(bào)告（表6）十、再確認(rèn)或驗(yàn)證時(shí)間及建議10.1法定相關(guān)檢查標(biāo)準(zhǔn)修改后需要對(duì)本方法重新進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)；10.2檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。十一、附件 11.1相關(guān)實(shí)驗(yàn)