基因表達(dá)及分析技術(shù)

1、基因表達(dá)及其分析技術(shù)生命現(xiàn)象的奧秘隱藏在基因組中，對(duì)基因組的解碼一直是現(xiàn)代生命科學(xué)的主 流。 基因組學(xué)研究可以說(shuō)是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域炙手可熱的方向。從DNA測(cè)序 到SNP、拷 貝數(shù)變異(咿響er variation CNV)等DNA多態(tài)性分析，到DNA甲基化修飾等表觀遺傳學(xué)研究，生命過(guò)程的遺傳基礎(chǔ)不斷被解讀。基因組研究的重要性自然不言而喻。應(yīng)該說(shuō)，DNA測(cè)序技術(shù)在基因組研究 中功不可沒(méi)，從San ger測(cè)序技術(shù)到目前盛行的新一代測(cè)序技術(shù)(NextGen eration Seque ncing NGS)到即將走到前臺(tái)的單分子測(cè)序技術(shù)，測(cè)序技術(shù)是基 因組解讀最重要的主流技術(shù)。而基因組測(cè)序、基因組多態(tài)

2、性分析、DNA甲基化修飾 等表觀遺傳分析等在基因組研究中是最前沿的課題。但是基因組研究終究類(lèi)似“基 因算命”，再清晰的序列信息也無(wú)法真正說(shuō)明一個(gè)基因的功能，基因功能的最后鑒 定還得依賴(lài)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，而轉(zhuǎn)錄作為基因發(fā)揮功能的第一步，對(duì)基因功能 解讀就變得至關(guān)重要。聲稱(chēng)特定基因、特定SNP、特定CNV、特定DNA修飾等與某種表型有關(guān)，最終需要轉(zhuǎn)基因、基因敲除、突變、 RNAi、中和抗體等技術(shù)驗(yàn)證，并必不可少要結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白修 飾等數(shù) 據(jù)。基因?qū)崿F(xiàn)功能的第一步就是轉(zhuǎn)錄為mRNA或非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要研 究基因 轉(zhuǎn)錄為RNA的過(guò)程。在轉(zhuǎn)錄研究中，下面幾點(diǎn)是必須考慮的：1，基因是否

3、轉(zhuǎn)錄(基因是否表達(dá))及基因表達(dá)水平高低(基因是低豐度表 達(dá)還是 中、高豐度表達(dá))。特定基因有時(shí)候在一個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)拷貝的表達(dá)，而表達(dá)量會(huì) 隨細(xì)胞類(lèi)型不同或發(fā)育、生長(zhǎng)階段不同或生理、病理狀態(tài)不同而改變。因此任何基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，其是否科學(xué)，就是要看能否檢測(cè)到低豐度表達(dá)基因，能否檢測(cè)到基因豐度的變化尤其是微弱變化，線(xiàn)性范圍是否寬廣等。 這方面的誤區(qū)在于，很多人過(guò)分強(qiáng)調(diào)特定技術(shù)能否檢測(cè)到低豐度基因的表達(dá)，忽視 了特定技術(shù)能否檢測(cè)到基因表達(dá)豐度微弱的改變。如果關(guān)注全基因組表達(dá)信息，那么目前最經(jīng)典的技術(shù)就是全基因組表達(dá)譜芯片技 術(shù)，這種基因芯片設(shè)計(jì)了數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已知基因、EST和預(yù)測(cè)基因、EST的已知

4、轉(zhuǎn)錄本的探針，用來(lái)分析全基因組中已知基因、預(yù)測(cè)基因的已知轉(zhuǎn)錄本 的表 達(dá)信息。在利用基因芯片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究時(shí)，應(yīng)該選擇能檢測(cè)低豐度表達(dá)基因的芯片 技術(shù)，選擇可以反映基因表達(dá)微弱變化并且線(xiàn)性范圍廣的技術(shù)，比如?Affymetrix公司的轉(zhuǎn)錄研究方面的芯片。以GeneChip? Human Genome U133Plus 2.0 Array為例，該芯片可以分析多達(dá)38500個(gè)基因的47400個(gè)轉(zhuǎn)錄本（而 GeneChip? Human Genome U133A 2.0 Array 是對(duì)其中 14500 個(gè) well- characterized human gen e的18400個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析的）

5、。從精確度、重復(fù) 性、性?xún)r(jià)比等角度來(lái)講，芯片技術(shù)仍然是基因表達(dá)研究的首選技術(shù)。除人全基因組表達(dá)譜芯片外，Affymetrix公司還可以提供以下物種的全基 因 組表達(dá)譜芯片：大鼠，小鼠，擬南芥，大麥，牛，線(xiàn)蟲(chóng)，狗，雞，柑橘，棉花，果 蠅，大腸桿菌，玉M，苜蓿，綠膿桿菌，蚊子/瘧原蟲(chóng)、楊樹(shù)，豬，恒河 猴，水 稻，金黃色葡萄球菌，大豆，甘蔗，西紅柿，葡萄，小麥，爪蟾，酵 母，斑馬魚(yú) 等。2,對(duì)mRNA表達(dá)而言，更重要的問(wèn)題是，每個(gè)基因的編碼區(qū)域由若干外 顯子組成，而特定基因在不同細(xì)胞類(lèi)型中或不同發(fā)育、生長(zhǎng)階段或不同生理、病理狀態(tài) 下，外顯子存在選擇性剪接(alternative splici ng)

6、,因而會(huì)出現(xiàn)不同 轉(zhuǎn)錄本。不 同轉(zhuǎn)錄本正是解釋同一基因具有不同功能甚至相反功能遺傳基礎(chǔ)。因此分析基因表 達(dá)，不僅要知道基因是否表達(dá)與表達(dá)水平高低，更重要的是需要知道特定基因表達(dá) 的轉(zhuǎn)錄本是什么。如果關(guān)注全基因組所有外顯子表達(dá)并希望預(yù)測(cè)每個(gè)基因選擇性剪接，那么基因芯 片仍然是該方面研究的經(jīng)典技術(shù)。以Affymetrix公司的GeneChip Human Exon 1.0 ST Array為例，該芯片可以分析已知的及預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的超過(guò)1百萬(wàn)個(gè)外顯子簇的表達(dá)，分析選擇性剪接。這是迄今為止最全面的、唯一的同時(shí)可 以研究基因表達(dá)與選擇性剪接的基因芯片。Affymetrix公司也可以提供小鼠、大 鼠的

7、此類(lèi)芯片，分別分析小鼠的1百萬(wàn)個(gè)外顯子或大鼠的85萬(wàn)個(gè)外顯子。3，基因調(diào)節(jié)分析。任何基因表達(dá)都是受到嚴(yán)格調(diào)控的，包括轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀 遺傳修飾等。如果關(guān)注特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的所有基因，那么ChIP on chip技術(shù)是必 須的。以 Asymetrix 公司的 Gen eChip Human Promoter 1.0R Array 為 例，該 芯片可以分析任何特定蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子與超過(guò)25500個(gè)啟動(dòng)子的相互作用。每個(gè) 啟動(dòng)子覆蓋10-12.5kb (轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游2.5kb+上游7.5kb，對(duì)1300個(gè)癌基因而 言，上游延長(zhǎng)至10kb)。如果分析特定轉(zhuǎn)錄因子在特定細(xì)胞類(lèi)型的特定生長(zhǎng)、發(fā)育階

8、段或特定生理、病理下調(diào)控基因表達(dá)的特點(diǎn)，該芯片是很好的工具。該芯片也覆蓋 了 UCSC in NCBI human genome assembly(Build 34)中注解的 59% 的 CpG 島， 該芯片同時(shí)可以用于DNA甲基化修飾的分析。Affymetrix公司也可以提供小鼠的 此類(lèi)芯片，分析轉(zhuǎn)錄因子與28000個(gè)啟動(dòng)子 的相互作用Array可以分析71個(gè)物種的數(shù)以千計(jì)的microRNA與Small nucleolar RNAs （sn oRNAs ）的表達(dá)。樣本問(wèn)題。最科學(xué)的樣本應(yīng)該是同質(zhì)細(xì)胞。不同細(xì)胞類(lèi)型，其基因表達(dá)是有 差異的，建立細(xì)胞類(lèi)型特異的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，才能真正揭示特定細(xì)胞類(lèi)

9、型基因表達(dá) 的真實(shí)面貌。對(duì)于組織，制作組織切片，利用（免疫）組織化學(xué)技術(shù)對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型 進(jìn)行鑒定，進(jìn)而利用激光顯微切割技術(shù)分離特定細(xì)胞類(lèi)型，這是目前從組織中獲得 同質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)。問(wèn)題在于組織切片制備和（免疫）組織化學(xué)等環(huán)節(jié)可能造成 RNA的降解，針對(duì)這種情況，Affymetrix公司有專(zhuān)門(mén)分析福爾馬林固定的、石蠟 包埋的組織的全基因組表達(dá)的芯片GeneChip（R） Human X3P Array,該芯片設(shè)計(jì)的每 個(gè)基因的探針，都更靠近mRNA 3端位 置，因?yàn)閙RNA越靠近3端越穩(wěn)定。對(duì)于醫(yī)學(xué)樣品的分組，臨床上對(duì)疾病、行為等的診斷、分類(lèi)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)是轉(zhuǎn)錄分 析中對(duì)樣本分組的必不可少的參考，

10、比如腫瘤樣本的病理學(xué)判讀、血液分 析中的各 種參數(shù)、心腦血管分析中的各種參數(shù)、精神類(lèi)疾病診斷中的行為學(xué)參數(shù)等。優(yōu)秀的 高級(jí)別的科學(xué)論文，往往在樣本分組分類(lèi)上非常嚴(yán)格，描述很清晰，篇幅很大。沒(méi) 有合格樣本及沒(méi)有合格樣本分組，任何下游分析技術(shù)都無(wú)法得出有價(jià)值數(shù)據(jù)。候選基因表達(dá)分析技術(shù)。在實(shí)際研究中，經(jīng)常會(huì)遇到兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄分析，全基因 組表達(dá)分析與候選基因表達(dá)分析。應(yīng)該說(shuō)，只有通過(guò)全基因組表達(dá)分析，才能了解特定生命過(guò)程相關(guān)的所有基因表 達(dá)，從中鑒定出特定生命過(guò)程的關(guān)鍵候選基因（如轉(zhuǎn)錄因子）及相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)、 信號(hào)通路。關(guān)于候選基因表達(dá)分析技術(shù)，在實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷很多年后，新的技術(shù)不斷沖擊，包括

11、Affymetrix公司的Branch-DNA技術(shù)。該技術(shù)在分析基因表達(dá) 時(shí)，不是基于將模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原理，而是檢測(cè)雜交于特異基因的一組特異探 針的信號(hào)，避免了 PCR過(guò)程引發(fā)的很多問(wèn)題；而且可以進(jìn)行單基因表 達(dá)分析或3- 36個(gè)基因表達(dá)的多重分析。本期基因快訊有專(zhuān)門(mén)介紹Branch-DNA技術(shù)的文獻(xiàn)。相 信Branch DNA技術(shù)很快會(huì)成為候選基因表達(dá)分析的主流技術(shù)?？傊?，Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于 人類(lèi)和動(dòng)物生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究中，如鑒定發(fā)育、生長(zhǎng)、分裂、分 化、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命過(guò)程的相關(guān)基因，鑒定疾病相關(guān) 基因。大量的研究在利用基因芯片技術(shù)鑒

12、定癌癥發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基 因，對(duì)癌癥進(jìn)行分子分類(lèi)/分期，尋找癌癥分子機(jī)制的關(guān)鍵分子，為癌癥診 斷篩選重要標(biāo)志分子，為癌癥治療篩選重要的靶分子，預(yù)后分析 等而在作物遺傳育種領(lǐng)域，針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物新品種培育，全基因組 表達(dá)譜芯片等技術(shù)也大有作為：1，高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)等農(nóng)業(yè)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的鑒定：每個(gè)物種在自然界中都有不同品種， 傳統(tǒng)育種也產(chǎn)生了很多栽培種。不同品種、栽培種間性狀差異很明顯，因此深入分析表 型差異的遺傳機(jī)制，鑒定高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)等農(nóng)業(yè)優(yōu)良性狀相關(guān)基因?qū)D(zhuǎn)基因育種很重 要。利用中國(guó)豐富的種質(zhì)資源，通過(guò)各物種全基因組表達(dá)物種的全基因組表達(dá)芯片，包括：大豆基因組（包括大豆線(xiàn)蟲(chóng)基因組、大豆疫霉

13、 菌基 因組）、玉M、小麥、大麥、水稻、苜蓿（含固氮菌）、楊樹(shù)（包括胡楊）、葡萄、 西紅柿、擬南芥、豬、牛、雞、甘蔗、棉花、柑橘等。2，轉(zhuǎn)基因生物安全的評(píng)估：轉(zhuǎn)基因生物安全的評(píng)估需要從多層次綜合進(jìn)行，系統(tǒng)比較基因修飾作物與傳統(tǒng)育種作物是必須的。國(guó)際上這方面的評(píng)估正在形成相關(guān)理論技術(shù) 體系，具體包括：基因組層次（轉(zhuǎn)進(jìn)去的目的基因是否對(duì)作物基因組穩(wěn)定性產(chǎn)生影響）， 轉(zhuǎn)錄組層次（從基因轉(zhuǎn)錄水平上評(píng)估轉(zhuǎn)進(jìn)去的目的基因及其表達(dá)是否對(duì)作物全基因組表 達(dá)產(chǎn)生影響），蛋白組層次（轉(zhuǎn)進(jìn)去的目的基因的蛋白產(chǎn)物是否對(duì)作物蛋白組學(xué)特征產(chǎn) 生影響）。其他包括代謝組層次，功能特征分析等。轉(zhuǎn)錄組學(xué)層次的分析是至關(guān)重要的， 而且技術(shù)相當(dāng)成熟。已經(jīng)有科學(xué)家做了初步研究，結(jié)果顯示：傳統(tǒng)育種的大豆不同栽培 品種間基因表達(dá)是有差異的，這也從遺傳機(jī)制上解釋了大豆不同栽培品種間為什么有性 狀差異；更重要的是，該研究也顯示，轉(zhuǎn)基因大豆與其相應(yīng)的對(duì)照栽培種間的基因表達(dá) 差異非常小，也就是說(shuō)，轉(zhuǎn)基因大