TGFβ信號在造血發(fā)育中的作用

1、TGF-信號在造血發(fā)育中的作用【摘要】造血發(fā)育包括胚胎期的造血發(fā)生和成體造血穩(wěn)態(tài)的維持。作為重要形式生物的小鼠為研究造血發(fā)育提供了非常好的模型。轉(zhuǎn)化生長因子-TGF-作為造血調(diào)控的重要因子受到越來越多的重視。系統(tǒng)地研究TGF-信號在哺乳動物個體發(fā)育的生理環(huán)境下對造血發(fā)生和發(fā)育的作用，隨著基因剔除技術(shù)的建立和成熟而成為可能。本文就近年來以小鼠為研究對象，應(yīng)用基因剔除、顯性負(fù)效轉(zhuǎn)基因等手段構(gòu)建的TGF-信號分子缺失個體的造血相關(guān)表型等研究作一綜述，以進(jìn)一步說明TGF-信號在造血發(fā)生和發(fā)育中的作用及可能機(jī)制。【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)化生長因子-；基因剔除；造血；造血發(fā)育TGF-SignalingduringHe

2、atpietiDevelpentRevieAbstratHeatpietidevelpentisharaterizedbythedynaigeneratinfheatpietiste/prgenitrellsduringebrygenesis,andafterard,theaintainingfheatpietihestasisinadult.usedelhasbeenappreiatedvaluablefrdissetingtheregulatryehanissfheatpietidevelpent.Asaniprtantytkineplayingpivtalandversatilerles

3、intheregulatinfheatpiesis,transfringgrthfatr-(TGF-)attratsreandreattentin.Inpartiular,genetargetingbyhlgusrebinatinprvidesakeyeansfrsysteatievaluatinfhTGF-signalingisinvlvedinheatpiesisunderphysilgialnditins.TfurtherillustratethefuntinsandpssibleehanissfTGF-inheatpietidevelpent,heatpietiphentypesfta

4、rgetedutatinsand/rdinantnegativetransgenesfleulesithintheTGF-signalingpathayareategrizedanddisussedinthisrevie.KeyrdsTGF-;genetargeting;heatpiesis;heatpietidevelpent從發(fā)育學(xué)角度，造血包括胚胎期造血的發(fā)生和成體造血穩(wěn)態(tài)的維持。作為重要形式生物的小鼠為研究造血發(fā)育提供了非常好的模型。小鼠造血發(fā)生同人類一樣，包括胚外造血和胚內(nèi)造血，二者在終末細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、分子調(diào)控機(jī)制上均有很大不同。前者又稱原始造血，發(fā)生于小鼠胚胎7.0-7.5天的胚外

5、中胚層的卵黃囊血島。造血和血管內(nèi)皮的共同前體成血-血管細(xì)胞分化為造血前體細(xì)胞，主要產(chǎn)生原始紅細(xì)胞。原始造血僅維持較短的時間。胚胎8.5-9.0天在主動腺-生殖腺-中腎AG區(qū)發(fā)生了胚內(nèi)造血又稱定向造血、永久造血，產(chǎn)生造血干細(xì)胞HS，同時胚胎內(nèi)的循環(huán)建立。隨后AG區(qū)的HS遷移至胎肝進(jìn)展造血活動。胚胎中期后，永久造血完全取代了原始造血。出生后骨髓代替胎肝成為成體造血活動的主要場所1。造血穩(wěn)態(tài)的維持是指在成體的造血活動中，通過對造血干細(xì)胞增殖分化的準(zhǔn)確調(diào)控，以保持干細(xì)胞池的穩(wěn)定，并且產(chǎn)生數(shù)量功能正常的成熟血細(xì)胞。TGF-信號分子超家族含有至少45個成員，是一組構(gòu)造相似、功能重疊的多效性細(xì)胞因子。其中T

6、GF-在哺乳動物中有TGF-1、2、3三種異構(gòu)體，而以TGF-1分布最廣，活性最強(qiáng)，對其理解也最為深化2,3。TGF-作為造血調(diào)控的重要因子受到越來越多的重視。TGF-信號傳導(dǎo)阻斷可能是人類多種類型白血病的發(fā)病機(jī)制之一，而病理性的TGF-過表達(dá)與骨髓纖維化和造血干/祖細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)，提示TGF-對人類造血干/祖細(xì)胞的靜息、增殖和分化發(fā)揮重要的調(diào)控作用。大量的體外研究進(jìn)一步說明，盡管TGF-可對造血細(xì)胞的增殖、分化、凋亡發(fā)揮正性或負(fù)性的調(diào)控，其效應(yīng)也隨細(xì)胞的系列、分化階段、甚至培養(yǎng)條件的差異而有不同，但是TGF-主要是作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子在造血干/祖細(xì)胞程度發(fā)揮生長抑制效應(yīng)4。系統(tǒng)地研究TGF-信

7、號在哺乳動物個體發(fā)育的生理環(huán)境下對造血發(fā)生和發(fā)育的作用，隨著基因剔除技術(shù)的建立和成熟而成為可能5。本文以作為重要形式生物之一的小鼠為研究對象，就近年來應(yīng)用基因剔除、顯性負(fù)效轉(zhuǎn)基因等手段構(gòu)建的TGF-信號分子缺失個體的造血相關(guān)表型做一綜述，以期說明TGF-信號在造血發(fā)生和發(fā)育中的作用及可能機(jī)制。TGF-信號傳導(dǎo)通路TGF-通過跨膜的I型TRI和II型受體TRII傳導(dǎo)信號。TGF-首先與TRII結(jié)合，隨后結(jié)合并磷酸化TRI。繼而胞內(nèi)的信號分子Sads作為跨膜受體的底物，繼續(xù)傳遞信號。Sads根據(jù)其功能不同分為3類：第一類受體激活型SadsR-Sads，可直接被TRI磷酸化激活，再與第二類通用型Sa

8、ds-Sads結(jié)合，形成異源二聚體。R-Sads/-Sads復(fù)合物入核，發(fā)揮針對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。第三類抑制型SadsI-Sads，可阻斷R-Sads和-Sads的互相作用，并參與TGF-信號的負(fù)反響調(diào)節(jié)。對于哺乳動物的TGF-信號，R-Sads主要包括Sad2和Sad3，-Sads包括Sad4，I-Sads包括Sad6和Sad72，3。研究TGF-信號分子在造血發(fā)育中的作用，主要針對3類靶分子進(jìn)展基因干預(yù)：TGF-使內(nèi)源性分泌缺失、TR使細(xì)胞對TGF-的反響性消失和胞內(nèi)信號分子Sads使信號傳遞受阻。TGF-對小鼠胚胎造血發(fā)育的作用用原位雜交的方法，最早可在小鼠胚胎7.5天的胚外卵黃囊的

9、血島檢測到TGF-1的表達(dá)。在胚胎發(fā)育的后期，胎肝的血細(xì)胞和早期內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)TGF-1的RNA。這提示TGF-1在造血發(fā)育、血管發(fā)生和血管生成中可能發(fā)揮調(diào)控功能6。1995年，Diksn等7應(yīng)用TGF-1基因剔除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，TGF-1是卵黃囊造血和內(nèi)皮分化所必需的。50%的TGF-1完全基因剔除小鼠和25%的雜合子死于胚胎發(fā)育第10.5天。原發(fā)缺陷局限于胚外卵黃囊的血管和造血系統(tǒng)：內(nèi)皮分化缺陷導(dǎo)致血管發(fā)生障礙；造血缺陷導(dǎo)致卵黃囊內(nèi)紅系細(xì)胞數(shù)量減少，而紅系細(xì)胞中的血紅蛋白含量正常。小鼠胚胎由于繼發(fā)的嚴(yán)重發(fā)育停滯而死亡。這些表型說明TGF-1可同時調(diào)控胚胎造血發(fā)生和血管發(fā)生兩個系統(tǒng)，它是內(nèi)皮分

10、化和卵黃囊造血的重要正向調(diào)節(jié)因子。同TGF-1基因剔除小鼠的表型一樣，TRII基因剔除小鼠也是由于卵黃囊血管發(fā)生和造血的缺陷而死于胚胎中期8。上述結(jié)果提示，TGF-可能是卵黃囊造血的重要調(diào)節(jié)因子，但實(shí)驗(yàn)結(jié)論均基于體內(nèi)原位檢測的結(jié)果，不能排除造血為繼發(fā)性缺陷的可能。2001年Larssn等9報道，TRI基因剔除小鼠也死于胚胎10.5天，原位檢測到卵黃囊的血管分支減少，循環(huán)中的紅細(xì)胞減少導(dǎo)致外觀貧血。但進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)分析其造血潛能是正常的卵黃囊造血前體細(xì)胞的集落形成才能正常：FU-G和FU-ix集落數(shù)量正常，紅系造血集落的數(shù)量還顯著增高。而卵黃囊的血管發(fā)育缺陷是胚胎期死亡的主要原因基因剔除的原代

11、內(nèi)皮細(xì)胞纖連蛋白產(chǎn)生減少、遷移功能異常，增殖失去對TGF-抑制效應(yīng)的反響，導(dǎo)致了血管形成障礙。上述表型提示TGF-信號缺失造成的卵黃囊貧血并非造血前體的內(nèi)在缺陷，而是卵黃囊異常的微環(huán)境使造血前體無法正常分化成熟。除了采用基因剔除的動物模型，胚胎干細(xì)胞的體外造血分化體系也為全面認(rèn)識TGF-信號對胚胎早期造血發(fā)育的作用提供了重要線索。通過考察胚胎干細(xì)胞ebrynisteell,ESell體外造血分化過程中各種發(fā)育與造血相關(guān)基因編碼細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞外表抗原的表達(dá)，目前認(rèn)為：體外模型和體內(nèi)的發(fā)育事件是大致平行的，擬胚體造血可以在一定程度上模擬卵黃囊的原始造血10。盡管缺乏對TGF-及其受體基因

12、剔除的ES細(xì)胞體外造血分化的研究，但應(yīng)用此體系針對胞內(nèi)信號分子的研究發(fā)現(xiàn)，Sad5基因剔除的ES細(xì)胞，其原始紅系增殖缺陷，而定向造血是顯著增強(qiáng)的。這種效應(yīng)是通過介導(dǎo)TGF-的信號而實(shí)現(xiàn)，并且具有基因劑量效應(yīng)11。我們對Sad3基因剔除的ES細(xì)胞體外造血的初步研究也獲得了相似的結(jié)果未發(fā)表。這提示阻斷TGF-信號或至少局部阻斷，確有可能一定程度影響卵黃囊的原始造血。TGF-信號分子對胎肝造血發(fā)育的作用，主要來源于對TGF-2剔除鼠胎肝造血的研究。TGF-2基因剔除小鼠由于多種發(fā)育缺陷導(dǎo)致新生期死亡12。純合子和野生型在胎肝造血干細(xì)胞的數(shù)量、體外增殖才能以及第一代受體鼠的造血重建功能上沒有區(qū)別。然而

13、，雜合子和純合子的第二代造血重建才能顯著下降，提示TGF-2對胎肝造血干細(xì)胞維持屢次重建的才能是必要的13。同卵黃囊造血一樣，胎肝造血也可能受到繼發(fā)因素的影響。對Sad2和Sad3雙雜合小鼠的表型分析顯示：80%雙雜合小鼠出現(xiàn)的嚴(yán)重胎肝發(fā)育障礙14，可能是間接影響胎肝造血的重要因素。我們發(fā)現(xiàn)Sad3基因剔除小鼠的胎肝具有正常的組織構(gòu)造和造血功能未發(fā)表，但Sad2蛋白表達(dá)升高14，TGF-作用后Sad2磷酸化程度增強(qiáng)，均提示在胎肝發(fā)育中有信號分子功能的代償未發(fā)表。TGF-信號對成體造血功能的影響1992年Shull等15及Kulkarni等16兩個研究小組幾乎同時報道了應(yīng)用基因打靶技術(shù)建立的TG

14、F-基因剔除小鼠中造血和免疫系統(tǒng)的異常。他們分別應(yīng)用了針對TGF-不同外顯子的打靶載體。雖然基因剔除小鼠在出生2-3周內(nèi)無明顯異常表型，但隨后很快出現(xiàn)消耗、衰竭病癥，3-4周齡死亡。組織學(xué)分析提示涉及心臟、胃、肝、肺、胰腺、唾液腺等多系統(tǒng)的不同程度的混合炎性細(xì)胞浸潤和組織壞死，而皮膚、胸腺、骨髓沒有明顯的炎癥累及。血液系統(tǒng)檢測骨髓容積和細(xì)胞比例正常16，而外周血白細(xì)胞總數(shù)升高，尤其是不成熟中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的絕對值顯著增高15。上述改變強(qiáng)烈提示：基因剔除小鼠的免疫和炎癥系統(tǒng)功能異常；血液系統(tǒng)的改變或者是原發(fā)性的造血前體細(xì)胞失去對TGF-反響的直接結(jié)果，或者為繼發(fā)于炎性因子刺激的血象反映。由于

15、信號分子的完全剔除，表型的多樣性給功能分析帶來一定困擾：一種可能是繼發(fā)因素的影響，正如上述報道中血象可能受到炎癥影響一樣；一種是胚胎發(fā)育早期缺陷的累積效應(yīng)，使得靶分子在成體中的功能很難評價。在目前的研究中，有兩種策略可以分別在基因剔除的空間和時間上局部解決上述問題：一是采用無免疫細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植模型，使得受體鼠只有造血系統(tǒng)來源于基因缺陷的細(xì)胞；一是成體程度的顯性負(fù)效轉(zhuǎn)基因或誘導(dǎo)性剔除，使正常發(fā)育的小鼠在成體程度再出現(xiàn)信號的阻斷，進(jìn)一步結(jié)合移植實(shí)驗(yàn)?zāi)敲纯筛鼫?zhǔn)確地評價信號通路對成體造血功能的影響。上述策略尤其被用于由于基因剔除可導(dǎo)致胚胎期死亡的TRI和TRII。Shah等17應(yīng)用攜帶可表達(dá)顯性

16、負(fù)效TRII的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，體外感染小鼠的骨髓細(xì)胞后重建致死劑量照射小鼠的造血和免疫系統(tǒng)。在確認(rèn)受者鼠中來源于造血前體的所有細(xì)胞中TGF-信號被阻斷后，發(fā)現(xiàn)受者鼠除了出現(xiàn)炎癥表型以肺部和支氣管的炎性細(xì)胞浸潤為特征外，還表現(xiàn)為脾臟中髓系的顯著擴(kuò)增，繼而受者鼠在移植后3-4月內(nèi)出現(xiàn)明顯的惡液質(zhì)和高死亡率。盡管顯性負(fù)效TRII載體感染的骨髓造血前體細(xì)胞可有效重建受者鼠的造血，但第一代受者鼠的造血干/祖細(xì)胞不能再重建致死劑量照射的第二代受者鼠，提示體內(nèi)阻斷TGF-信號通路的HS的造血重建功能可能受到影響17。另一研究小組應(yīng)用re/lxP系統(tǒng)，在成體小鼠程度進(jìn)展TRII的誘導(dǎo)性剔除，通過鑒定骨髓來源單

17、個造血集落的基因型和檢測誘導(dǎo)后的骨髓集落形成細(xì)胞失去對TGF-抑制效應(yīng)的反響，驗(yàn)證了誘導(dǎo)性剔除導(dǎo)致信號通路阻斷的有效性。盡管誘導(dǎo)剔除的小鼠出現(xiàn)了多器官的多發(fā)炎癥病變主要累及胃、胰腺和肺和早期死亡，但小鼠的造血平衡未破壞：骨髓容積正常；外周血細(xì)胞白細(xì)胞、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)正常；反映祖細(xì)胞程度的BFU-E、FU-eg、FU-G在集落形態(tài)和數(shù)量上均正常18。但該作者著重于免疫功能的觀察，并沒有對造血干細(xì)胞的重建功能進(jìn)展深化的研究。為更加有針對性地研究TGF-信號通路對成體小鼠造血穩(wěn)態(tài)的影響，Larssn等19應(yīng)用re/lxP系統(tǒng)在成體小鼠程度進(jìn)展TRI的誘導(dǎo)性剔除。除了發(fā)現(xiàn)剔除小鼠的造血穩(wěn)態(tài)可維持不同階段的

18、造血祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞的數(shù)量功能正常，還為了防止免疫活性細(xì)胞對造血系統(tǒng)的繼發(fā)影響，采用競爭重建實(shí)驗(yàn)將去除T細(xì)胞的骨髓細(xì)胞移植給免疫缺陷的受者鼠，并在此根底上再進(jìn)展二次移植。結(jié)果說明，TGF-信號阻斷后小鼠的造血干細(xì)胞盡管體外的增殖才能增強(qiáng)，但在體內(nèi)環(huán)境中具有正常的造血重建功能。進(jìn)一步，該小組應(yīng)用同樣的條件剔除小鼠，考察造血干細(xì)胞在清髓處理和系列移植的強(qiáng)烈應(yīng)激條件下的增殖和穩(wěn)態(tài)維持情況，結(jié)果提示內(nèi)源性的TGF-對于成體小鼠的造血干細(xì)胞功能和造血穩(wěn)態(tài)的維持不是必需的20。TGF-2與TGF-1具有高度同源性，并且通過同一受體復(fù)合物傳遞信號，但與TGF-1顯著不同的是，其雜合子就有很突出的異常造血表

19、型：除了骨髓容積和造血干細(xì)胞數(shù)量的減少，其造血重建功能也有顯著的減低，并且隨著重建代數(shù)的增多更突出。這提示TGF-2是造血干細(xì)胞的重要正向調(diào)節(jié)因子。TGF-2在造血干細(xì)胞重建造血過程中，可能是作為細(xì)胞周期的進(jìn)入信號發(fā)揮作用13。胞內(nèi)信號分子中與造血關(guān)系最為親密的是Sad3。同樣作為傳遞TGF-信號的R-Sads，Sad2基因剔除小鼠死于胚胎7.5-8.5天的中胚層發(fā)育缺陷，而Sad3基因剔除小鼠胚胎發(fā)育正常，出生后才逐漸出現(xiàn)表型21。1999年，Yang等22及Datt等23兩個研究小組同時報道了應(yīng)用基因打靶技術(shù)建立的Sad3基因剔除小鼠，純合子小鼠出生3周后出現(xiàn)衰弱、消耗，1-8月齡死亡。同

20、TGF-相似的是，基因剔除純合子小鼠表現(xiàn)為免疫功能異常導(dǎo)致的粘膜多發(fā)慢性炎癥22。血液學(xué)改變主要為：外周血象的白細(xì)胞升高，各類白細(xì)胞絕對值均增高，尤以中性粒和單核細(xì)胞比例增高明顯22，24；血小板數(shù)量增高24-27；而紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是正常22，24-27。對Sad3基因剔除小鼠造血祖細(xì)胞的進(jìn)一步分析顯示：Sad3基因剔除小鼠FU-G增多，F(xiàn)U-GE和FU-S減少24。局部純合子小鼠還伴有肝脾的髓外造血22。上述結(jié)果提示Sad3基因剔除小鼠的成體造血穩(wěn)態(tài)受到影響。由于抑制型Sads的過表達(dá)亦可到達(dá)阻斷TGF-信號通路的效應(yīng)，Blank等28應(yīng)用過表達(dá)Sad7的骨髓移植實(shí)驗(yàn)考察造血干細(xì)胞的重建功能，發(fā)

21、現(xiàn)TGF-信號的胞內(nèi)阻斷，使造血干細(xì)胞的體內(nèi)重建才能增強(qiáng)，但是體外的結(jié)果卻恰恰相反：在無基質(zhì)細(xì)胞層的液體培養(yǎng)體系中，過表達(dá)Sad7的造血干細(xì)胞的增殖才能是下降的。由于Sad7的過表達(dá)阻斷了全部的胞內(nèi)Sads信號，包括通過Sads傳遞的BP等信號，上述結(jié)果一定程度上反映了TGF-和BP等信號對造血干細(xì)胞的綜合效應(yīng)。結(jié)語基因剔除技術(shù)為研究靶分子在體內(nèi)環(huán)境下對個體發(fā)育的作用提供了非常好的工具。與體外實(shí)驗(yàn)不同，基因剔除的形式生物表型更多的是反映在生理狀況的微環(huán)境中，分子網(wǎng)絡(luò)互相調(diào)節(jié)和細(xì)胞之間互相作用的綜合結(jié)果：一個無差異的表型可能是信號分子功能冗余或互相代償?shù)慕Y(jié)果，而一個有差異的表型也可能是微環(huán)境中繼

22、發(fā)因素的影響9。因此，我們在進(jìn)展基因剔除動物模型的表型分析時，結(jié)合體外功能實(shí)驗(yàn)的精巧的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是得到靶基因真實(shí)功能的結(jié)論所必需。造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)從發(fā)育學(xué)角度密不可分，它們來源于共同的造血干細(xì)胞。對于TGF-信號來講，由于它對免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控作用，使造血表型的分析不免受到干擾。因此我們在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析研究結(jié)論時，應(yīng)更加慎重考慮其可靠性。研究說明，TGF-信號對胚胎造血發(fā)育的影響，更傾向于是繼發(fā)缺陷。卵黃囊造血主要繼發(fā)于卵黃囊的血管生成障礙9，而胎肝造血那么繼發(fā)于肝臟的發(fā)育異常14。對于成體造血，在認(rèn)為白細(xì)胞增高15和髓系擴(kuò)增的表型17都可能繼發(fā)于免疫炎癥反響后，TGF-信號缺失對造血穩(wěn)態(tài)的

23、維持是沒有影響的18，19。這與大量豐富的體外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的TGF-是造血干細(xì)胞重要負(fù)調(diào)控因子的結(jié)論形成鮮明比照。有趣的是，許多其它的細(xì)胞類型，如上皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)，TGF-基因剔除模型和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常一致的9，18。由于體內(nèi)微環(huán)境和體外實(shí)驗(yàn)的條件不同，這種體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的宏大差異說明TGF-對造血系統(tǒng)的作用顯著依賴于微環(huán)境的詳細(xì)情況28，29。在個體程度，TGF-信號對造血發(fā)育并不必需，一種可能是在造血發(fā)育過程中，TGF-信號確實(shí)不重要；而更可能的情況是，由于功能的重要性，TGF-信號存在體內(nèi)的功能冗余或代償，在TGF-2和Sad3基因剔除小鼠中出現(xiàn)更為突出的造血表型13，22，24，這

24、恰恰說明TGF-信號通路中的某一類分子/信號在造血發(fā)育中確有重要作用，而完全阻斷信號通路受體程度的剔除，那么可能因信號的代償和平衡使表型得到糾正。而在造血發(fā)育中，TGF-信號通路同其它的信號通路之間，以及TGF-下游的不同胞內(nèi)信號分子之間，是如何互相作用和調(diào)節(jié)，又通過怎樣的機(jī)制，都將有待進(jìn)一步探究和明確?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1GdinI,uanA.Thehareandthetrtise:anebrynihaeatpietirae.NatRevIunl,2002;2:593-6042ShiY,assagueJ.ehanissfTGF-signalingfrellebranetthenuleus.ell,

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