質(zhì)粒DNA的提?。瓑A裂解法實驗原理及步驟

1、實驗二 質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法一、實驗原理細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以

2、及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢

3、復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。二、儀器及試劑1.儀器及耗材：37恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。2.試劑及配制：LB培養(yǎng)液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子

4、水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4保存。溶液 （GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制：1000 ml1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 25 ml0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 20 ml20% Glucose（1.11mol/L） 45 mldH2O 910ml將以上溶液混合裝瓶， 10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4保存。溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS配制： 500 ml 10% SDS 50

5、ml2N NaOH 50 ml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。 溶液 III (醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸鉀 147 g冰醋酸 57.5 ml加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至500 ml。高溫高壓滅菌后，4保存。10TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml1 mol/LTri

6、s-HCl 緩沖液(pH 8.0) 100ml500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，4保存。苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）三、操作步驟1.菌體的培養(yǎng)和收獲 (1）將510 ml含有氨卞青霉素（AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml

7、的三角瓶中，然后接入一單菌落，并保持通氣良好，于37 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)接一次，于37 220 rpm振搖培養(yǎng)34 h。 (2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm離心3 min。棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。2.質(zhì)粒DNA提?。▔A裂解法）（1）加100 ul 溶液 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。（2）加200 ul溶液 ，蓋緊管口，輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置5 min（溶液變透明，粘稠）。（3）加150 ul溶液 ，輕微振蕩混和10 sec，置冰上10 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀)。（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）。（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一離心管。（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。（7）加200 ul 70乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干（或在5060的烘箱中也可）。（8）沉淀加20l TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒DNA充分溶解，20保存。四、常見問題