藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 王似錦 非無菌藥品的控制菌檢查與不可接受微生物的評估

1、非無菌藥品的控制菌檢查與不可接受微生物的評估中國食品藥品檢定研究院王似錦2019-11非無菌藥品的控制菌檢查與不可接受微生物的評估01非無菌藥品的控制菌檢查02無菌藥品中不可接受微生物的評估03案例分享一、非無菌藥品的控制菌檢查藥品本身的降對人的威脅解與破壞免疫力低下的病人、兒童與老人藥品中污染微生物被微生物利用致 菌與條件病菌被酶降解細(xì)菌與真菌毒素理化性質(zhì)改變反映藥品生產(chǎn)的衛(wèi)生質(zhì)量，一 程度上能夠體現(xiàn)藥品在生產(chǎn)的全過程中貫徹、執(zhí)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的情況一、非無菌藥品的控制菌檢查營養(yǎng)條件需氧菌總數(shù)指示菌：TSA上生長的所有菌指示菌致病菌大腸中國藥典對非無菌藥品污染微生物的控制微生

2、物限度檢查及限度標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)條件霉菌和酵母菌總數(shù)致病菌沙門指示菌：SDA上生長的所有菌指示菌致病菌耐膽鹽G-指示菌致病菌控制菌金葡銅綠指示菌致病菌其它具有致病菌梭菌潛在危害的微生物致病菌白念一、非無菌藥品的控制菌檢查中國藥典-非無菌藥品-微生物限度標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)非無菌藥品人體微生物限度標(biāo)準(zhǔn)給藥途徑與用藥部位不同劑型微生物的天然聚集體作用于人體的不同部位劑型（液體/固體）不同部位有其固有的微生物菌群胃腸道、粘膜、皮膚、腔道部位有其天然的免疫屏障一、非無菌藥品的控制菌檢查中國藥典2015年版1107微生物限度標(biāo)準(zhǔn)一、非無菌藥品的控制菌檢查是藥典各論/國家標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中是依照執(zhí)行，方法按否有微生物限度的

3、具體要求照藥典1105,1106否是限度按照制劑通則的要求，方法按照藥典1105,1106藥典各論/國家標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中是藥品的微生物限度要求應(yīng)如何執(zhí)行？否有微生物限度要求否是 限度按照制劑通則根據(jù)劑型 閱藥典制劑通則的要求，是否有微生物限度的要求的要求，方法按照藥典1105,1106可以不進(jìn)行微生物限度檢驗，但應(yīng)符合1107微生物限度的要求否一、非無菌藥品的控制菌檢查中國藥典2015年版二部各論的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)序號 品名1大豆油（供注射用）39參照通 1105,1106，11072去氫膽酸112參照通則1105,1106，1107,同時10g供試品中不得檢出沙門菌參照通則110 106,1g

4、供試品中需氧菌總數(shù)不得過10000cfu,霉菌和酵母菌總數(shù)不得過100cfu，不得檢出大腸埃希菌。10g供試品中不得檢出沙門菌參照通則1105，1106,110734567甲狀腺1992112164 3444甲酚甲硝唑克 霉素磷酸酯外用溶液克林霉素磷酸酯栓參照通則1105，1106,1 07參照通則1105，1106,1107參照通則1105，1106,1107取本品不少于1ml，經(jīng)薄膜過濾 處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30-35培養(yǎng)不少于五天，參照通則1105,1ml供試品中需氧菌總數(shù)不得過100cfu89純化水苯扎氯銨溶液579605參照通則1105，1106,1107參照通則1105，1

5、106,1107。1g供 品中需氧菌總數(shù)不得過1000個，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過100個，不得檢出大腸埃希菌，10g供試品中不得檢出沙門菌。10明膠6481112垂體后葉粉乳酸依沙吖啶溶液65768照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，參照通則1105 g供試品中需氧菌總數(shù)不得過10000cfu照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，參照通則1105，,1106,1107。取本品不少于100ml，經(jīng)薄膜過濾法處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30-35培養(yǎng)不少于5天，參照通則1105,100ml供試品中需氧菌總數(shù)不得過10cfu。照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，參照 則1105，,1106,1107。照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢

6、查，參照通則1105，,1106,1107。參照胃蛋白酶項下方法131415161718注射用水藥用炭膠囊胃蛋白酶胃蛋白酶片胃蛋白酶顆粒含糖胃蛋白酶702719739739739740參照胃蛋白酶項下方法參照胃蛋白酶項下方法取 品0.3g，照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，參照通則1105,1g供試品中需氧菌總數(shù)不得過300cfu19重組人胰島素789一、非無菌藥品的控制菌檢查中國藥典2015年版四部通則0101片劑0106鼻用制劑一、非無菌藥耐膽鹽革蘭陰性菌耐膽鹽革蘭陰性菌是泛指在有膽鹽的條件下能夠生長的，利用葡 糖但不發(fā)酵乳糖的革蘭陰性菌，例如腸桿菌科的細(xì)菌，產(chǎn)氣單胞菌屬和假單胞菌屬等，除包括原

7、大腸菌群范疇的微生物外還包括諸如沙門菌屬、 賀菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬等非乳糖發(fā)酵類型微生物，是對需氧及兼性厭氧，可耐受膽鹽的革蘭陰性桿菌這一大類微生物的統(tǒng)稱。若在耐膽鹽革蘭陰性菌檢查體系中檢出，且經(jīng)革蘭染色判斷為革蘭陰性菌，則為耐膽鹽革蘭陰性菌。一、非無菌藥品的控制菌檢查耐膽鹽革蘭陰性菌培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時間CHP 2015 2025 約2h關(guān)于約2小時的預(yù)培養(yǎng)USP /EP/JP 2025usually 2 hours but not more than 5 hours在上世紀(jì)七八十年代，微生物學(xué)家在用EE進(jìn)行食品中腸桿菌檢驗時發(fā)現(xiàn)，如果直接將受傷injured/stressed的菌接種至

8、EE，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果，即EE 法使受傷的菌恢復(fù)生長，通過研究發(fā)現(xiàn)，先將受傷的菌在非選擇性培養(yǎng)基（如TSB、TSA）中預(yù)培養(yǎng)25小時，然后在用EE，即可達(dá)到能夠生長的目的，因此，EP從上世紀(jì)七十年代引入腸桿菌檢查時，就使用了25小時的預(yù)培養(yǎng)，在之后的藥典協(xié)調(diào)過程中，就形成了現(xiàn)在的耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查法。一、非無菌藥品的控制菌檢查大腸埃希菌 在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血動 的糞便污染，即可能污染腸道病原體。 大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健 ，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。 大腸埃希菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。 大腸埃希

9、菌既是病原菌又是指示 ！一、非無菌藥品的控制菌檢查大腸埃希菌 麥康凱液體培養(yǎng)基能夠抑制革蘭氏陽性球菌如金黃色葡萄球菌，而能夠使革蘭氏陰性桿菌如大腸埃希菌生長。培養(yǎng)溫度為4244，因為該條件是區(qū)分大腸埃希菌和大腸菌群其它種的關(guān) 條件，另外有文獻(xiàn)報道表明近期受到人和溫血動物糞便污染的大腸埃希菌在4244更容易生長。 大腸埃希菌在麥康 瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落形態(tài)特征：鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。一、非無菌藥品的控制菌檢查沙門菌 沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，根據(jù)最新版的伯杰氏系 細(xì)菌學(xué)手冊（第二版），沙門菌屬分為2個種 分別是腸炎沙門菌(S.ente

10、rica)和乍得沙門菌(S. bongori)，其中腸炎沙門菌又分為6個亞種，分別是腸炎亞種（Enterica）、薩 拉 姆 亞 種 (Salamae亞 利 桑 那 亞 種(Arizonae)、雙亞利桑那亞種(Diariaonae)、豪頓亞種(Houtenae)和印度亞種(Indica)。 在沙門菌的分類學(xué)研究和流行病學(xué)研究中，按照血清型進(jìn)行分類更為常見，一般 說，O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95，所以可以用沙門菌A-F O多價血清進(jìn)行沙門菌初篩試驗。一、非無菌藥品的控制菌檢查沙門菌 RV培養(yǎng)基通過氯化鎂和孔雀綠的共同作用可一定程度 抑制革蘭氏陽性菌、大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌

11、的生長 。 XLD培養(yǎng)基能夠支持腸道致病菌的生長，包括沙門菌、志賀氏菌、大腸埃希菌等。其中，木糖能夠支持除了志 氏菌外幾乎所有的腸道菌生長；賴氨 用于分別沙門菌與其他非致病菌；隨著木糖、乳糖和蔗糖被細(xì)菌發(fā)酵，會使培養(yǎng)基中的酚紅從紅色 黃色，從而區(qū)分不同的腸道細(xì)菌；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵銨的存在能夠指示使硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色。沙門菌CMCC（B）50094 沙門菌在XLD平板上的典型菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。XLD一、非無菌藥品的控制菌檢查沙門菌中國藥典收載 利用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面進(jìn)行菌種確認(rèn)的方法，若XLD平板上有疑似菌 生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅

12、色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判斷供試品未檢出沙門菌。在進(jìn)行該項試驗時，為 輔助判斷三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面和底層的顏色反應(yīng)，建議同時接種沙門菌、大腸埃希菌或其他類似腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)菌種作為對照菌。TSI血清學(xué)一、非無菌藥品的控制菌檢查沙門菌 根據(jù)中國藥典2015年版的1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行沙 菌檢查的包括以下4部分：1. 含臟器提取物的化學(xué)藥品、生物制品、不含藥材原粉的中藥制劑2.

13、 含動植物源成分或礦物的化學(xué)藥品或生物制品3. 口服含藥材原粉的中藥制劑4. 研粉口服貴系飲片、直接口服及泡服飲片 建議生產(chǎn)企業(yè)以中國藥典的要求為基礎(chǔ)，通過對產(chǎn)品的工藝評估后，特別是關(guān)注原輔料的來源是否存在動物來源、是否存在未經(jīng)提取的植物來源成分和礦物質(zhì)等，來判斷產(chǎn)品是否應(yīng)該進(jìn)行沙門菌檢查。一、非無菌藥品的控制菌檢查銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，習(xí)稱綠膿桿 ，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。 本菌是常見的化膿性 染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其 外科疾患中常引起繼發(fā)

14、感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的 度 國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為外用制劑的檢查項目之一。 銅綠假單胞菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。一、非無菌藥品的控制菌檢查銅綠假單胞菌溴 化 十 六 烷 基 三 甲 銨（cetrimide）為陽離子表面活性劑，有較強的抑菌性，能夠抑制革蘭氏 性菌、大腸埃希菌、假單胞菌屬的其它種，但銅綠假單胞菌 以在該培養(yǎng)基上生長，因此具有較強的選擇性。銅綠假單胞菌CMCC（B）10104一、非無菌藥品的控制菌檢查銅綠假單胞菌 氧化酶試驗過程簡述：取一小塊白色潔凈的濾紙置 皿內(nèi)，以無菌玻璃棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1滴新配制

15、的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30s ，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。 綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42生長試驗明和膠液化試驗，相關(guān)詳細(xì)內(nèi)容可以參考化妝品安全技術(shù)規(guī)范2015年版。氧化酶試驗一、非無菌藥品的控制菌檢查金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為葡萄球 屬中的一種，廣泛分布于自然界，空氣、水、土壤等，人和動物皮膚及與外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。 本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時可發(fā)展成為敗血 和膿毒血癥，是人類化膿性感染

16、中重要的病原菌。 本菌也是人皮膚常見菌之一，有一定的指示作用。一、非無菌藥品的控制菌檢查金黃色葡萄球菌 典型的金黃色葡萄 菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上呈黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落，而表皮葡萄球 則能使培養(yǎng)基呈紅色。 除了甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基以外，還可以將疑似菌落劃線至Baird-Parker平板和血瓊脂平板，進(jìn)行進(jìn)一步的對疑似金黃 葡萄球菌進(jìn)行鑒別。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。 在血平板上，形成菌落較大，圓 、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色 ，菌落周圍可見完全透明溶血圈

17、。Baird-Parker血平板一、非無菌藥品的控制菌檢查金黃色葡萄球菌確定為金黃色葡關(guān)鍵試驗為血漿凝固酶試驗，取無菌試管3支，各加入血漿和0.9%無菌氯化鈉溶液(11) 0.5ml， 加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其余2支作對照管：1支加入金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003培養(yǎng)物菌懸液或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽 對照；另一支加入營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。三管同時置37水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開始檢查，以后每隔適當(dāng)時間觀察一次，直至24h。檢查時，輕輕將試管傾斜 (動作勿大) ，仔細(xì)觀察，陰性對照管血漿 動自如，陽性對照管

18、血漿呈凝固狀，試驗管呈凝固者為陽性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。也可使 商業(yè)化的凍干兔血漿，并按照說明書進(jìn)行操作，注意同時進(jìn)行陽性對照和陰性對照。血漿凝固酶試驗（凍干兔血漿）一、非無菌藥品的控制菌檢查梭菌梭菌屬（Clos ium）過去稱為梭狀芽胞桿菌屬，菌體15m左右的革蘭氏陽性桿菌，能形成芽胞。芽胞多大于菌體的寬度，細(xì)菌膨脹呈梭形，故名梭狀芽胞桿 。該菌屬中主要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌（C,p fringens）、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)和艱難梭菌(C.difficile)，均能產(chǎn)生強烈的外毒

19、素使人和動物致病。 因此，對于某些用于陰 、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。該檢驗項目需要微生物鑒別到“屬”水平。一、非無菌藥品的控制菌檢查梭菌 因此檢查時，將1：10的供試液在80加熱10分 后迅速冷卻，以殺死可能存在的雜菌繁殖體，使梭菌具有優(yōu)勢生長或在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中加入慶大霉素，抑制雜菌，利于梭菌的分離培養(yǎng)。 為了保證厭氧條件，可使用商業(yè)化的密閉容器和厭氧產(chǎn)氣袋實現(xiàn)厭氧條件，亦可使用真空干燥器、標(biāo)本瓶或其他適宜容器替代使用；在厭氧培養(yǎng)的同時，可以使用厭氧指示條以方便觀察是 達(dá)到厭氧條件。生孢梭菌CMCC（B）64941一、非無菌藥品的控制菌檢查梭菌陽性對照菌生孢梭菌(Clostrid

20、ium sporogenes)C CC(B)64941的生長 要厭氧培養(yǎng)，菌液的制備及計數(shù)方法為：取生孢梭菌接種 12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置3035 培養(yǎng)1 24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含10100cfu的菌液。生孢梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌液計數(shù)可取每ml含1001000cfu的菌液0.1ml 布于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板或血瓊脂平板置厭氧條件下培養(yǎng)4872小時計數(shù)；也可以取每ml含10100cfu的菌液1ml接種于50200ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，搖勻，置3035 培養(yǎng)1620小時計數(shù)其中的燈籠狀菌團(tuán)（觀察點計之前切 動培養(yǎng)基），一般情況下該燈籠狀菌團(tuán)數(shù)與平板計數(shù)菌落數(shù)相當(dāng)。生孢

21、梭菌菌種的保存可取其硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物混勻、凍存管分裝、超低溫保存（如-80 ），用時取出自然解凍、經(jīng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基復(fù)蘇、復(fù)壯，制備新 培養(yǎng)物使用。生孢梭菌的計數(shù)（FTM）一、非無菌藥品的控制菌檢查白色念珠菌 白色念珠菌（Candida albicans）又名白假絲酵母菌 Saccharomyces albicaus）屬假絲酵母菌屬（Saccharom yces）。白色念珠菌是條件致病菌，是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要組成之 ，一旦感染，?？梢鹦膬?nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。 白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國內(nèi)外的藥品、食品標(biāo) 已把白色念珠菌作為微

22、生物檢驗中 母菌的代表菌，因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。白 念珠菌檢查應(yīng)鑒定到“種”水平。一、非無菌藥品的控制菌檢查白色念珠菌 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有弄酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺?？捎媚钪榫@色培養(yǎng)基對疑似菌落進(jìn)行進(jìn)一步分辨。 如果平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，并且念珠顯色培養(yǎng)基呈陽性反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜 鑒定試驗，確證是否為白色念珠菌。白色念珠菌CMCC（F）98001一、非無菌藥品的控制菌檢查檢出菌的鑒別與鑒定 與中國藥典2005年版和2010年

23、版相比， 15年版的控制菌檢查法對檢出菌的鑒別方法及結(jié) 判斷的規(guī)定更為開放和靈活，只是提供了關(guān)鍵的、初步的鑒別方法，凡是懷疑為陽性結(jié)果的均要求“應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗”。 一般來說，微生物的鑒定包括表型鑒定方法和基因型鑒定方法，選用何種方法應(yīng)根據(jù)需要達(dá)到的水 視情況而定?？刂凭鷻z查中需要進(jìn)一步進(jìn)行的適宜的鑒定試驗，包括國內(nèi)外各種 括藥品、食品和化妝品在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范如GB、FDA、AOAC、ISO、EN等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，也可以使用國內(nèi)外被大家認(rèn)可的相應(yīng)的鑒定技術(shù)，包括手動、半自動化的鑒定試劑條、自動化的鑒定系統(tǒng)等。在選用相應(yīng)試劑條或鑒定系統(tǒng)時，應(yīng)對供應(yīng)商進(jìn)行充分的評 ，其中關(guān)鍵的因素包括方法的可

24、靠性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性，該方法能夠鑒定的菌種數(shù)據(jù)庫等。無論是表型還是基因型的微生物鑒定方法，均有局限性，因此為了得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，建議根據(jù)中國藥典2015年版四部9204微生物鑒定指導(dǎo)原則，采用多種鑒定方 相互確認(rèn)。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估 中國GMP第一章 總 則 第三條： 本規(guī)范作為質(zhì)量管理體系的一部分，是藥品生產(chǎn)管理和質(zhì)量控制的基本要求，旨在最大限度地降低藥品生產(chǎn)過程中污染、交叉污染以及混淆、差錯等風(fēng)險，確保持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合預(yù)定用途和注冊要求的藥品。 中國藥典201 年版四部通則： 控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。供試品檢出控制菌或

25、其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。 中國藥典2015年版四 通則： “本限度標(biāo)準(zhǔn)所列的控制菌對于控制某些藥品的微生物質(zhì)量可能并不全面，因此，對于原料、輔料及某些特定的制劑，根據(jù)原輔料及其制劑的特性和用途、制劑的生產(chǎn)工藝等因素，可能還需檢查其他具有潛在危 的微生物?！逼渌哂袧撛谖：Φ奈⑸锸鞘裁矗咳绾螜z驗與評估？二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估什么是不可接受微生物？What are Objectionable Microorganisms？1）可在藥品中 殖，并對其化學(xué)、物理性質(zhì)產(chǎn)生不利影響，并破壞該藥品的功能及療效的微生物。2）在藥品中存在的數(shù)量以及致病性會導(dǎo)致特定給藥途徑下使

26、用該藥品治療的患者發(fā)生感染的微生物。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估USP以及美國cGMP對非無菌藥品的微生物檢驗和控制的歷史 USP had a test for the “Bacteriolog cal Examination of Gelatin” as earlyas 1942 In the l e 1960s several outbreaks of disease were traced back topath gen contaminated medications, and this prompted increasedattention to the microbial

27、content of non-s rile drugs However, most on-sterile medications in the US were not required toassay for micro iological quality attributes until the introduction of theMicrobial Li its Tests in 1970. Later in the 1980s there was a series of articles ap earing in theliterature describing c amination

28、 by P.cepacia (currently Burkholderia cepacia) This lead to the add tion of requirements in the 21 CFR to ensure thatthere are not objectionable organisms in product released to market二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估美國cGMP對不可接受微生物的要求 21 CFR 211.84(d)(6) “Each lot of a component, drug product container, orclosure

29、with potential for microbiologic l contamination that is objectionablein view of i ntended use shall be subjected to microbiological tests beforeuse.” 任何一批有潛在污染的原輔料和包材容器，其污染的微生物 可能通過預(yù)期用途而視為不可接受的，因此，在使用之前，均 進(jìn)行微生物檢驗。 21 CFR 211.113(a) “ ppropriate written procedures, designed toprevent objectio able m

30、icroorganisms in drug products not required to besterile, shall be established and followed.” 對于非無菌產(chǎn)品，需要建立并執(zhí)行 的書面程序以防止不可接受微生物的污染。 21 CFR 211.165(b) “Ther shall be appropriate laboratory testing, asnecessary, of each batch of drug product required to be free of objectionablemicroorganisms.” 在必要的情況下，對

31、于每一批次不應(yīng)存在不可 受微生物的藥品，應(yīng)建立適當(dāng)?shù)膶嶒炇覝y試方法。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估美國FDA的警告信Warning Letter Dated March 20, 2019: “Your firm f iled toconduct appropriate laborato y testing, as necessary, of each batchdrug product require be free of objectionable microorganisms(21 CFR 211.165(b) You released multipl batches of thes

32、e drugproducts withou conducting tests to ensure they were free fromobjectionable microorganisms. It is essen al that your drug productsare produced in a manner that is su ble for their intended uses and 沒有針對不可接受微生物制定適當(dāng)?shù)臋z驗方法（21 CFR 211.165（b）沒有進(jìn)行不可接受微生物的檢驗并且放行了多批產(chǎn)品。that each batch is tested for conf

33、once to appropriate icrobial 雖然企業(yè)提供了按照USP進(jìn)行的微生物計數(shù)檢驗資料，但是企業(yè)無法證明之前的已經(jīng)放行的產(chǎn)品其微生物指標(biāo)的情況。quality specifications. In your esponse, you provided examples ofrecently tested batches utilizing the USP method for microbialenumeration testing. Your response is inadequa e because you didnot provide your verificati

34、on studies includita to show thesuitability of the compendial method being used. Your response alsofailed to provide data to show that all pre ously released products,that remain on the U.S. market, were tested and found to meet yournewly implemented USP microbial release specificatio二、非無菌藥品中不可接受微生物

35、的評估企業(yè)未建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制措施，負(fù)責(zé)授Warning Letter Dated March 20, 2019: “Your firm failed to establish an adequate quality control unit with the responsibility and authority to approve orreject all components, drug product cont ners, closures, in-pro ess materials,packaging materials, labeling, and dru products (

36、21 CFR 211.22(a ). Over權(quán)批準(zhǔn)或拒絕所有成分、容器、密封件、中間控制產(chǎn)品、包裝材料、標(biāo)簽以及產(chǎn)品。（21 CFR 211.22（a）multiple years, your firm obtain d recurring test results for water usedcomponent of your drugs as well as results for finished redacted drugproducts, outside of mi logical limits. This t sting revealed extremelya 企業(yè)對作為產(chǎn)品原料

37、的水以及終產(chǎn)品進(jìn)行微生物檢測，得到多次超標(biāo)的結(jié)果，并檢測到了條件致病菌。high levels of microbiolog al contamination, including results that were TooNumerous to Cou (TNTC), and identified the presence of significantopportunistic pathogens in your drugs. Furth rmore, your tests of retainedsamples and customer complaint bottle ound objec

38、tionable microbiological 在留樣和投訴的樣品檢測到了不可接受微生物。企業(yè)沒有采取有效措施防止被污染的產(chǎn)品流入市場。contamination in already distributedSignificantly, you fa ed to takeactions to prevent consumer exposure to marketed drug product lots known byyour firm to contain microbiologi l contamination. In addition to these totalcount failu

39、res, you identified objectionable microo ganisms (suchas Burkholderia multivorans) in multiple drug roducts but lacked 除了需氧菌總數(shù)超標(biāo)，在多批次產(chǎn)品中檢測到了多噬伯克霍爾德菌。investigations. You did not take effective actions to inate root causes, andcorrect flaws, in your manufacturing operation and quality managementsystem

40、s to prevent recurrence of these serious q ality failures. Ultimately, youdid not ensure timely and effective corrective and preventative actions to未進(jìn)行有效的調(diào)查，未能夠找到根本原因，沒有采取糾正和預(yù)防措施，采取有效的措施。在FDA發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的問題之前，未進(jìn)行主動召回。prevent exposure of consumers to contaminated product. While youto obtain microbiological t

41、est results outside of acceptable limits ontinuedurringbasis, you did not initiate recalls until the FDA identified these se ous issues inour inspection and relayed safety concerns to you.”4二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估美國藥典USP 針對每一個產(chǎn)品都列出其不可接受微生物是不現(xiàn)實的。什么樣的微生物能夠被確定 不可接受的，取決于產(chǎn)品特性、給藥途徑和用藥人群等。藥品企業(yè)有責(zé)任確 分離微生物是否為不可接受。

42、一般認(rèn)為，不可接受微生物是通過用藥途徑使人致病的微生物。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估非無菌藥品潛在的微生物污染風(fēng)險中國藥典的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)高風(fēng)險給藥途徑吸 劑需氧菌總數(shù)/霉菌和酵母菌總數(shù) 控制菌102/101102/101102/101102/101102/10大腸、金葡、銅綠、G-鼻用制劑大腸、金葡、銅綠金葡、銅綠耳用制劑陰道用藥金葡、銅綠、白念、梭菌金葡、銅綠外用制劑直腸用藥10 /102102/101102/101103/102金葡、銅綠口服液體大腸、（沙門）大腸、（沙門）大腸、（沙門）低風(fēng)險液體膠囊口服片劑和固體膠囊美國藥典，中國藥典四部1107二、非無菌藥品中不可接受微生物的

43、評估非無菌藥品的微生物檢驗方法的ICH協(xié)調(diào)方法61 Microbiological examination of nonsterile products:USP 61EP 2.6.12JP 4.05Microbial enumeration tests非無菌藥品微生物限度檢查：微生物計數(shù)ICH協(xié)調(diào)的微生物檢驗方法及限度標(biāo)準(zhǔn)62 Microbiological examination of nonsterile products:tests fo specified microorganisms非無菌藥品微生物限度檢查：特定微生物的檢驗USP 62EP 2.6.13P 4.051111 Micr

44、obiological examination of nonsterile products:Acceptance criteria for pharm ceutical preparation and substances forpharmceutical useUSP 1111EP 5.1.4JP 4.05非無菌藥品微生物限度檢查：藥品及原輔料的可接受標(biāo)準(zhǔn)二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估美國藥典2000年之前的微生物限度檢查方法-USP23,1995Total aerobic microbial count需氧菌總數(shù)Total comb ned molds and yeasts cou

45、nt61 Microbial limit tests霉菌和 母菌總數(shù)微生物限度檢Test for S. aureus and P. aeruginosa; Test forSalmonella sp. and E. li控制菌檢查：金葡和銅綠；沙門和大腸USP23,1995二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估1999年美國藥典論壇USP Pharm Forum25（2）USP PF 25 77617791（1999）Total aerobic microbial count需氧菌總數(shù)Total combined molds and yeastscount61 M crobial enumera

46、tion te ts霉菌和酵母菌總數(shù)Coliform count微生物計數(shù)大腸菌群計數(shù)61 Microbial limit testsEnterobacterial count微生物限度檢查腸桿菌計數(shù)62 Micr ological procedur s forabsence of objectionablemicroorganismsTest for S. aureus, P. aeruginosa,Salmonella sp., E. coli, C. albicans,Clostridium, Burkholderia cepacia控制菌檢查：金葡、銅綠、沙門、大腸、白念、生孢、洋蔥伯

47、克霍爾德菌不可接受 生物二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估USP PF 25 77617791（1999）USP PF 25 77617791（1999）二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估USP PF 25 77617791（1999） 不得檢出不可接受微生物 在各論中規(guī)定了有一種或多種不可接受微生物不得檢出。 但是，藥典中各論的規(guī)定并不能保證原料或輔料的微生物指標(biāo)能夠可接受。 生產(chǎn)商有責(zé)任了解物品的生物負(fù)載，包括不可接受微生物的種類。 對于非無菌藥品，除非各論中有相應(yīng)規(guī)定，不可接受微生物的判別可參考圖1的決策樹。但應(yīng)注意的是有害的以及不可接受微生物不僅限于圖1所示。二、非無菌藥品中不可接

48、受微生物的評估USP PF 25 77617791（1999） 吸入劑：高風(fēng)險品種，不得含有任何不可接受微生物。 粉劑和局部用軟膏劑：不得檢出梭菌屬。 鼻用液體制劑以及陰道用制劑：局部損傷、感染和炎癥皮膚以及粘膜使用時，應(yīng)引起注意。 液體口服制劑：常用于兒童、老年以及身體虛弱等不能適應(yīng)固體劑型的人群，因此應(yīng)關(guān)注假單胞、克雷伯、伯克霍爾德以及腸桿菌科的菌，還包括一些酵母菌如白色念珠菌或霉菌。 固體制劑：該劑型微生物的污染風(fēng)險較低，但是應(yīng)關(guān)注低免疫力人群，如潰瘍患者以及囊性纖維患者。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估藥品質(zhì)量控制微生物實驗室檢查指南1993GUIDE TO INSPECTIONS

49、 OF MICROBIOLOGICAL PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL LABORATORIES For a variereasons, we have seen a number of problems associated with the microbiological contamination oftopical drug p oducts, nasal solutions and inhalation produ ts. The USP Microbiological Attributes Chapter provide little specific

50、 guidance other than The significance of microorganisms in non-sterile pharmaceuticalproducts should be evaluated in terms of the use of the product, the n ure of the product, and the potential hazard tothe user.“ 由于種種原因，局部藥品、滴鼻劑和吸入劑存在許多微生物污染方面的問題。美國藥典“微生 指標(biāo)”章節(jié)指出:“應(yīng)該從藥品用法、性質(zhì)及對患者的潛在危害等方面評價微生物在非無菌藥品中的

51、重要性”，但是沒有提供具體的指導(dǎo)。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估藥品質(zhì)量控制微生物實驗室檢查指南1993GUIDE TO INSPECTIONS OF MICROBIOLOGICAL PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL LABORATORIES As a generae for acceptable levels and types of microbiological contamination in products, Dr. Dunnigan of theBureau of M dicine of the FDA commented on the he l

52、th hazard. In 1970, he said that topical preparationscontam ated with gram negative organisms are a probable moderate to serious health hazard. Through the literatureand through our investigations, it has been shown that a variety of in ctions have been traced to the gram negativecontamination of to

53、picalducts. The classical example being the Pseudomonas cepacia contaminat on of PovidoneIodine products reported b a hospital in Massachus tts several years ago. 作為非無菌藥 對微生物污染的可接受程度及類型的般性指導(dǎo)，美國食品和藥品監(jiān)督管理局藥品分局的鄧尼根博士曾強調(diào)其對健康的危害性。 970年他提出被革蘭氏陰性細(xì)菌污染的局部制劑可能 起中度至重度的健康危害。文獻(xiàn)和調(diào)查表明，許多感染都源于局部用藥的革蘭氏陰性細(xì)菌污染。幾年前馬薩諸塞

54、州的家醫(yī)院就報道過宗聚維酮碘(Povidone Iodine)的洋蔥假單孢菌(Pseudomonas cepacia)污染的典型病例。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估藥品質(zhì)量控制微生物實驗室檢查指南1993GUIDE TO INSPECTIONS OF MICROBIOLOGICAL PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL LABORATORIES Therefore,ompany is expected to develop microbial specifications for their non-st rile products. Likewise, theU

55、SP Microbi l Limits Chapter provides metho ology for selected indica or organisms, but not allobjecti able organisms. For example, it is widely recognized that Pseudomonas cepacia is objectionable if found ina topical product or nasal solution in high numbers; yet, there aretest methods provided in

56、the USP that willenable the identification e presence of this microorganism. 因此，每家公司都應(yīng)該為自己的非無菌藥品制訂出一套關(guān)于微生物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。美國藥典中“微生物限度”章節(jié)(USP Chapter 61)提供了檢驗幾種指示微生物的方法， 并末涵蓋所有有害微生物。例如醫(yī)藥界普遍認(rèn)為，洋蔥假單孢菌在局部藥品或滴鼻劑中若大量存在則是有害的，但美國藥典并沒有提供鑒定該微生物是否存在的檢驗方法。二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估藥品質(zhì)量控制微生物實驗室檢查指南1993GUIDE TO INSPECTIONS OF MICR

57、OBIOLOGICAL PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL LABORATORIES A relevantple of this problem is the recall of Metaproterenol Sulfate Inhalation Solution. The USP XXIImonograph re uires no microbial testing for this product. he agency classified this as a Class I recall because theproduc was contaminated wi

58、th Pseudomonas gladioli/cepacia. The health hazard evaluation commented that the riskof pulmonary infection is especially serious and potentially life-th atening to patients with chronic obstructiveairway disease, cystic fiis, and immuno-compromised patients. Additionally, these organisms would not

59、havebeen identified by testing ocedures delineated n t e general Microbial Limits section of the Compendia. 間羥異丙腎上腺素硫酸鹽吸入劑的召回就是這方面的個例子。美國藥典第X版各論部分沒有要求對該藥品進(jìn)行微生物檢驗。當(dāng)局將其列為一級召回，因為此藥受到了洋蔥假單孢菌的污染。健康危害評估表明，這種微生物對肺部感染的風(fēng)險很大，特別是對某些患有慢性氣管阻塞、囊性纖維變性和免疫缺陷等疾病的患者具有潛在的生命危險。此外，藥典的微生物限度部分所描述的檢驗程度不能鑒別這些微生物。二、非無菌藥品中不可接受

60、微生物的評估評估二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估FDA的觀點和考慮Absence ofobjectionablemicroorganisms不可接受微生物USP 的控制措施Absence of pecifiedmicroorganisms控制菌檢查二、非無菌藥品中不可接受微生物的評估微生物限度檢查出現(xiàn)微生物生長YES是否在OOE或OOS范圍內(nèi)？NO鑒定及風(fēng)險評估鑒定及OOE/OOS調(diào)查，以確認(rèn)污染原因。若排除實驗室操作或取樣錯誤，產(chǎn)品不放行未通過風(fēng)險評估不可接受微生物通過風(fēng)險評估產(chǎn)品放行OOE= out of Exation; OOS= out of S