檢驗中心培訓課件2 肖艷群-分子檢測實驗室設(shè)置、人員及質(zhì)量管理體系建立要求-上海市臨床檢驗中心

1、分子檢測實驗室設(shè)置、人員及質(zhì)量管理體系建立要求上海市臨床檢驗中心肖艷群醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法 衛(wèi)醫(yī)發(fā)200673號醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法總則第二條 臨床基因擴增檢驗實驗室是指通過擴增檢測特定的DNA或RNA，進行疾病診斷、治療監(jiān)測和預后判定等的實驗室，醫(yī)療機構(gòu)應當集中設(shè)置，統(tǒng)一管理。第三條 本辦法適用于開展臨床基因擴增檢驗技術(shù)的醫(yī)療機構(gòu)。第五條 以科研為目的的基因擴增檢驗項目不得向臨床出具檢驗報告，不得向患者收取任何費用。第二章 實驗室審核和設(shè)置醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法第三章 實驗室質(zhì)量管理第十四

2、條 醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室人員應當經(jīng)省級以上衛(wèi)生行政部門指定機構(gòu)技術(shù)培訓合格后，方可從事臨床基因擴增檢驗工作。第十五條 醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室應當開展實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制，參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心或指定機構(gòu)組織的實驗室室間質(zhì)量評價。室間質(zhì)量評價結(jié)果及時通報醫(yī)療機構(gòu)和相應省級衛(wèi)生行政部門。醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法第四章 實驗室監(jiān)督管理第十八條 省級以上衛(wèi)生行政部門指定機構(gòu)對室間質(zhì)量評價不合格的醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室提出警告。對于連續(xù)2次或者3次中有2次發(fā)現(xiàn)臨床基因擴增檢驗結(jié)果不合格的醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室，省級衛(wèi)生行政部門應當責令其暫停有關(guān)臨床 基因擴增

3、檢驗項目，限期整改。整改結(jié)束后，經(jīng)指定機構(gòu)組織的再次技術(shù)審核合格后，方可重新開展臨床基因擴增檢驗項目。醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法第二十條 醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室出現(xiàn)以下情形之一的，由省級衛(wèi)生行政部門責令其停止開展臨床基因擴增檢驗項目，并予以公告：（一） 開展的臨床基因擴增檢驗項目超出省級衛(wèi)生行政部門核定范圍的（二） 使用未經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的臨床檢驗試劑開展臨床基因擴增檢驗的（三） 在臨床基因擴增檢驗中未開展實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制的（四） 在臨床基因擴增檢驗中未參加實驗室室間質(zhì)量評價的（五） 在臨床基因擴增檢驗中弄虛作假的（六） 以科研為目的的基因擴增檢驗項目向患者收

4、取費用的（七） 使用未經(jīng)培訓合格的專業(yè)技術(shù)人員從事臨床基因擴增檢驗的（八） 嚴重違反國家實驗室生物安全有關(guān)規(guī)定或不具備實驗室生物安全保障條件的國家相關(guān)技術(shù)指南測序技術(shù)的個體化醫(yī)學檢測應用指南（試行）遺傳性相關(guān)個體化醫(yī)學檢測應用指南（試行）腫瘤個體化治療檢測應用指南（試行）孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范實驗室建設(shè)硬件 實驗室設(shè)置 實驗室設(shè)備軟件 人員資質(zhì)、能力 質(zhì)量管理體系建立 質(zhì)量管理體系實施實驗室信息管理系統(tǒng)實驗室設(shè)置普通PCR實驗室設(shè)置原則上分為四個區(qū)：試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動擴增分析儀，后兩區(qū)可合并如使用核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析一體化的全自動

5、分析系統(tǒng)，后三區(qū)可合并具體實驗室分區(qū)應根據(jù)其所使用的技術(shù)平臺及檢驗項目和工作量而定NGS實驗室設(shè)置原則：工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時普通PCR實驗室產(chǎn)物分析區(qū)緩沖區(qū)擴增區(qū)標本制備區(qū)緩沖區(qū)試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向注意事項：各區(qū)有獨立的緩沖區(qū)各區(qū)都有水池各區(qū)有獨立的通風系統(tǒng)（建議有窗戶的房間為PCR實驗室）標本制備區(qū)有沖眼器和生物安全柜產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測序技術(shù)）測序區(qū)緩沖區(qū)文庫擴增與檢測區(qū)標本與文庫制備區(qū)試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)工作流向標本與文庫制備區(qū)：血漿分離、DNA提取、末段修復與純化、加“A”與純化、接頭連接與純化文庫擴增與檢測區(qū)：PCR擴增與純化、文庫

6、濃度檢測、pooling 、pooling后文庫定量測序區(qū)：測序前準備（乳液PCR及磁珠富集）、測序上機、信息分析、報告審核及發(fā)放植入前胚胎遺傳學診斷（全基因組低拷貝測序）電泳區(qū)緩沖區(qū)測序區(qū)緩沖區(qū)文庫檢測區(qū)緩沖區(qū)擴增一區(qū)緩沖區(qū)WGA制備區(qū) 試劑準備區(qū)緩沖區(qū)工作流向緩沖區(qū)WGA制備區(qū)：全基因組擴增電泳區(qū)：DNA檢測及結(jié)果反饋、DNA打斷擴增一區(qū)：末端修復及純化、加“A”與純化、接頭連接與純化、pooling 、缺口平移文庫檢測：測序區(qū)：擴增前準備（乳液PCR及磁珠富集）、測序儀上機數(shù)據(jù)分析、報告發(fā)放遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測序技術(shù)+Sanger測序驗證）電泳區(qū)緩沖區(qū)測序區(qū)文庫檢測區(qū)

7、文庫擴增區(qū)雜交鋪獲區(qū) DNA打斷區(qū)標本與文庫制備區(qū)試劑準備區(qū)（擴增二區(qū)） （擴增一區(qū)）緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)標本與文庫制備區(qū)：DNA提取及檢測、純化測OD、末端修復與純化、加“A”與純化、Adapter連接與純化雜交捕獲區(qū)：Pre-Captured-PCR與純化 、OD值檢測及pooling、雜交、洗脫與純化文庫擴增與檢測區(qū)：Post-Captured-PCR與純化、Pooling及文庫定量檢測測序區(qū)：測序前準備（C-Bot制備)、測序儀上機數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀、Sanger驗證、報告發(fā)放Sanger測序驗證標本與文庫制備區(qū)：DNA提取與檢測、目的片段PCR反應準備擴增一區(qū)：

8、目的片段擴增與純化、測序PCR前準備電泳區(qū)：電泳擴增二區(qū)：測序PCR擴增與純化測序儀上機、結(jié)果分析與解讀、報告發(fā)放NGS實驗室設(shè)計注意事項電泳區(qū)：DNA提取、DNA純化后大小檢定等步驟需用電泳，單獨成區(qū)，但不同的檢測項目可共用測序區(qū)：應根據(jù)使用儀器要求設(shè)定溫、濕度分區(qū)設(shè)置可根據(jù)自動化儀器設(shè)備做適當區(qū)間整合無創(chuàng)產(chǎn)前篩查實驗室，因血漿提取為胎兒微量DNA，為防止污染，不能與其他項目的標本制備區(qū)共用其他：實驗室通風、生物安全柜等要求參照普通PCR實驗室空間要求實驗室空間足以保證：標本處置符合分析前、后樣本分區(qū)放置、儀器放置符合維修和操作要求、打印檢驗報告時交叉污染的控制標本接收區(qū)建議放在四個區(qū)域以外

9、的房間開展基于組織的分子病理項目宜有獨立的切片制備和前處理（脫蠟、水化）區(qū)域 。脫蠟、水化應在通風設(shè)施中進行。有防止切片時造成標本污染措施（有獨立的前處理區(qū)、不同患者標本更換新的刀片）工作區(qū)域要求實驗室各分區(qū)應配置固定和移動紫外線燈，波長為 254nm，照射時離實驗臺的高度一般為 6090cm樣品制備區(qū)應配置二級生物安全柜和洗眼器，實驗室附近應有噴淋裝置儲存設(shè)施要求用以保存臨床樣品和試劑的設(shè)施應設(shè)置目標溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應有溫度失控時的處理措施并記錄實驗室環(huán)境各工作區(qū)域應有明確的標記進入和使用實驗室各區(qū)域應有明確的限制和措施，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進出實驗室應根據(jù)所用儀器和

10、檢測過程對環(huán)境溫、濕度的要求，規(guī)定實驗室溫、濕度允許范圍，有效實施監(jiān)控，并有記錄實驗室工作要求進入各工作區(qū)域應按照單一方向進行不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服，工作人員離開各工作區(qū)域時不得將工作服帶出工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進行消毒?？墒褂每梢苿幼贤鉄粼诠ぷ魍瓿珊笳{(diào)至實驗臺上6090cm內(nèi)照射實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行有消毒和清潔相關(guān)的記錄實驗室工作要求實驗室所有操作應符合實驗室生物安全通用要求標本處理需在生物安全柜內(nèi)進行，對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋所有經(jīng)過檢測的反應管不得在擴增區(qū)打開

11、凝膠電泳、雜交、測序等應在產(chǎn)物分析區(qū)進行，應注意此區(qū)擴增產(chǎn)物的污染實驗室應嚴格管理實驗標本，醫(yī)療廢棄物應按醫(yī)療廢棄物管理條例進行管理實驗室信息系統(tǒng)建立信息系統(tǒng)管理制度，制訂計算機（辦公用除外）和計算機網(wǎng)絡(luò)使用權(quán)限、登陸密碼、維護的規(guī)定，有計算機安全保密和病毒防范的要求，并定期備份計算機數(shù)據(jù)，保證信息安全和完整。包括標本接收、報告發(fā)放流程定期評估檢驗項目、檢驗結(jié)果輸入、輸出一致性人員資質(zhì)實驗室負責人：至少具有中級專業(yè)技術(shù)職稱、醫(yī)學檢驗或相關(guān)專業(yè)背景。有從事分子診斷工作的經(jīng)歷實驗室操作人員：具備相關(guān)資質(zhì)并經(jīng)過有資質(zhì)的培訓機構(gòu)培訓合格取得上崗證后方可上崗簽發(fā)分子病理報告的醫(yī)師：至少具有中級病理學專業(yè)

12、技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷簽發(fā)分子遺傳報告的醫(yī)師：至少具有中級遺傳學專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子遺傳工作的經(jīng)歷NGS實驗室人員要求NGS檢測實驗室管理和技術(shù)人員：專業(yè)、學術(shù)水平、教育培訓情況需符合要求NGS實驗室技術(shù)人員：需有PCR上崗證，且應接受NGS技術(shù)的理論與實驗培訓，經(jīng)考核合格后方可上崗NGS數(shù)據(jù)分析人員：應參與NGS數(shù)據(jù)分析培訓，并考核合格后方可上崗；或有NGS技術(shù)服務(wù)行業(yè)從事數(shù)據(jù)分析工作經(jīng)驗（有詳細記錄或證明資料）崗位描述實驗室應至少具有 2 名本單位在職檢驗/檢查人員。開展遺傳性疾病或基于組織、細胞等分子病理并出具診斷報告的實驗室，應至少具有1名具備出具相

13、關(guān)診斷報告資質(zhì)的醫(yī)師。人員管理應建立分子診斷技術(shù)人員相關(guān)的教育背景、專業(yè)資格、培訓、經(jīng)歷及能力記錄檔案，并定期更新，內(nèi)容包括：a)證書或執(zhí)照復印件b)教育或以前的工作資料c)職務(wù)說明d)繼續(xù)教育記錄e)能力評估等質(zhì)量管理體系質(zhì)量管理體系如何建立？文件和記錄如何管理？質(zhì)量管理體系建立作用質(zhì)量手冊建立并保持質(zhì)量管理體系有效運行的重要基礎(chǔ)規(guī)范各項工作，保證工作質(zhì)量程序文件操作規(guī)程內(nèi)容：質(zhì)量手冊、程序文件、操作規(guī)程、記錄依據(jù)：基于標準文件、實驗室實驗工作經(jīng)驗積累記錄質(zhì)量體系建立1.組織和人員管理方面的文件，應包括實驗室各類人員的崗位職責、崗位培訓、繼續(xù)教育以及定期考核2.環(huán)境、設(shè)施及安全管理3.儀器、

14、設(shè)備的采購、驗收、使用、維修、校準4.檢驗試劑及其他相關(guān)消耗品的采購、驗收、保管、領(lǐng)用及使用5.樣品的采集、運送、接收、處理及保存6.檢驗方法的選擇、確認或驗證7.檢驗項目及儀器設(shè)備標準操作程序的建立和管理8.檢驗結(jié)果質(zhì)量保證Why：目的Where：范圍Who：職責What：做什么When：何時做How：如何做9.檢驗報告管理的規(guī)定。10.記錄的管理文件或程序11.對差錯事故及不符合工作的糾正及預防措施12.對服務(wù)對象投訴處理注意：適合自身實際情況，可操作性現(xiàn)行有效做、寫、記一致操作規(guī)程項目：（1）項目名稱、檢驗方法名稱；（2）方法學原理；（3）試劑品牌、代號、包裝規(guī)格、內(nèi)含物；（4）儀器品牌

15、、型號；（5）具體操作步驟（包括主要的儀器測定參數(shù)）；（6）質(zhì)控品使用方法、使用水平和頻率、質(zhì)控規(guī)則；（7）操作性能概要，如精密度、正確度、線性范圍、可報告范圍、靈敏度、特異性、方法的局限性（如干擾物質(zhì)等）、操作注意事項；（8）參考值或參考范圍；（9）臨床意義；（10）病人準備、標本要求；（11）參考文獻；（12）編寫者和日期；（13）科主任對每個項目操作規(guī)程的簽字認可，確定生效日期。儀器設(shè)備：使用、維護保養(yǎng)、校準等內(nèi)容NGS項目SOP編寫要求實驗室必須為每一個NGS檢測項目建立齊全和規(guī)范的SOPSOP源于一些標準文件和實驗室實驗工作經(jīng)驗的積累SOP應包括試劑準備（試劑來源及配制）、樣品采集、

16、樣品接收與預處理、核酸提取、測序方法和參數(shù)、測序儀器操作、生物信息學算法/軟件包和流程、結(jié)果分析和報告、實驗室安全措施等NGS項目SOP編寫要求描述檢測項目分析靶區(qū)域（例如，多基因組合、外顯子組、全基因組、染色體非整倍性等）描述檢測項目可以適用的樣品類型（例如外周血、血漿、FFPE石蠟標本），并指明本項目建立和驗證過程中所采用的樣品類型核酸提取和文庫構(gòu)建的方法和試劑靶區(qū)域（例如多基因組合、外顯子組）捕獲的方法和試劑濕實驗分析過程的對照與設(shè)置方法測序平臺、測序反應的試劑或耗材的版本（例如反應池/flow cells、芯片）測序設(shè)備上用于產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)及輸出格式（如fastq文件）的軟件和版本號監(jiān)控

17、和評估測序過程的指標和質(zhì)量控制參數(shù)分析流程的接受和拒絕標準（例如，如果測序覆蓋度不能達到特定檢測項目的最低要求，采用NGS進行靶向區(qū)域測序的結(jié)果就可能存在假陽性或假陰性，從而與后續(xù)的Sanger測序驗證結(jié)果不符，因此就需要對于這類項目建立可以接受的靶向區(qū)域覆蓋度標準 ）NGS生物信息分析SOP編寫要求詳細描述NGS數(shù)據(jù)的整個生物信息分析流程輸入文件、輸出文件及每步分析內(nèi)容每部過程中的質(zhì)控條件及參數(shù)(read的質(zhì)控、堿基質(zhì)量、測序深度、覆蓋度)數(shù)據(jù)篩選的流程及依據(jù)記錄管理原始記錄和質(zhì)量記錄應完整、清晰，電子記錄應定期備份。實驗室所有質(zhì)量管理記錄均應按相關(guān)規(guī)定保存（如分子病理、遺傳病、NIPT等）

18、注：質(zhì)量管理記錄，應包括但不限于標本接收、標本儲存、標本處理、儀器和試劑及耗材使用情況、校準、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評、檢驗結(jié)果、報告發(fā)放等內(nèi)容無儀器打印結(jié)果的檢驗項目應有原始記錄，記錄信息至少應包括檢測日期、方法、試劑品牌、批號、有效期、檢驗結(jié)果、檢驗者注：凝膠圖像和斑點雜交原始記錄可通過掃描、拍照等方式保留所有檢測的原始記錄和導出數(shù)據(jù)均應包括足夠的信息以保證其能夠再現(xiàn)標本檢測過程中，應及時、準確、如實記錄，包括操作人員、儀器、試劑及原始數(shù)據(jù)、計算和/或?qū)С鰯?shù)據(jù)、質(zhì)控信息等分子遺傳、分子病理、產(chǎn)前篩查與診斷等相關(guān)記錄的保存期限按相關(guān)要求執(zhí)行實驗記錄（NGS）實驗條件、步驟、計算軟件試劑、引物、測序反應、平臺檢測的目標區(qū)域