磁珠法核酸提取及常見的6種誤區(qū)

1、Word文檔 磁珠法核酸提取及常見的6種誤區(qū) 人類對核酸物質(zhì)的了解始于1869年，這一年Friederich Miescher從白細胞的細胞核中分別出一種他稱之為“核素”的化學(xué)物質(zhì)，這是人類歷史/上/第一次有目的地提取細胞內(nèi)的核物質(zhì)，然而當時采納的方法非常簡潔，僅僅是通過轉(zhuǎn)變?nèi)芤旱乃釅A度，核酸便從酸性溶液中沉淀出來。這也是最早對核酸性質(zhì)的描述，即是一種溶于堿性溶液，但不溶于酸性溶液的物質(zhì)。 1953年，Watson和Crick闡明白DNA的結(jié)構(gòu)，從今開啟了分子生物學(xué)的元年。此后不久，消失了分別核酸的標準試驗室程序。1958年，發(fā)覺DNA半保留復(fù)制原理的Meselson和Stahl開創(chuàng)性地應(yīng)用密

2、度梯度離心法獲得DNA。這種方法利用離心力場中各組分的浮力密度差不同的原理進行DNA純化。由于銫離子（Cs）相對于水的密度更大，施加到CsCl溶液的超高離心力導(dǎo)至形成密度梯度。核酸在這個梯度上遷移，直到達到中性浮力，即等密度點。該方法具有以低成本供應(yīng)特別純的高產(chǎn)DNA的優(yōu)點。其它的液相純化方法還包括經(jīng)典的苯/酚-氯仿法、CTAB法等。但直到二十世紀90年月，DNA提取仍舊是耗時、繁瑣、低效率的操作。1989年，McCormick建立了一種用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白質(zhì)的基因組DNA提取方法。它類似經(jīng)典的酚/氯仿提取法，即用酚化的二氧化硅酚代替酚，這是最早消失的固相吸附提取方法。相比起液相抽提，

3、固相吸附法的優(yōu)勢很明顯，因此傳統(tǒng)的液相分別提取核酸方法漸漸被以固相吸附支持物為基礎(chǔ)的新方法所取代。目前常見固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但固相法通常需實行數(shù)次快速離心、真空抽濾等步驟來實現(xiàn)分別，而且對于樣本需求量大，耗費樣品較多，不便于高通量、自動化操作，嚴峻限制了在臨床基因診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。抱負的核酸提取方法應(yīng)當滿意以下4個條件：1）靈敏、快速、簡潔、重復(fù)性好；2）產(chǎn)物純度較高，不影響后續(xù)步驟3）環(huán)保、無毒害4）無交叉污染風(fēng)險磁珠法提取 為了適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測試驗高通量、高靈敏度、自動化操作的需要，磁珠法應(yīng)運而生。第一個利用磁珠法提取DNA的并且在美國勝利申請專/利的

4、商品化試劑消失在1998年。磁珠法先通過裂解細胞，將游離出來的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面，而蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)則留在溶液中；在外加磁場的作用下，磁性顆粒與液體分開，棄除液體后，再經(jīng)洗脫即得到純化的核酸分子。磁珠法利用了磁性顆?；钚曰鶊F在肯定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，盡可能地避開了提取過程中核酸的丟失，還能很好地去除標本中存在的干擾物質(zhì)（如血紅蛋白、膽紅素及脂血等因素）影響，獲得質(zhì)量較高的核酸模板。隨著磁珠法提取技術(shù)的進展，DNA提取才真正開頭實現(xiàn)標準化、快速化和自動化。而基于磁珠法提取的商業(yè)試劑盒也得到廣泛應(yīng)用。這種試劑盒不需要任何有機溶劑，無需重復(fù)離心，目前可以從全血、血清、血漿

5、、唾液、尿液、糞便、腦脊液、組織和細胞中提取高質(zhì)量的DNA和RNA，且耗時更短、回收率更高。最顯/著的優(yōu)勢是可以通過機械設(shè)備實現(xiàn)提取過程自動化和無人源干擾。近年來分子診斷技術(shù)快速進展，隨著基因測序等技術(shù)的成熟，成本進一步降低，在臨床上的應(yīng)用也越來越普遍。分子診斷檢測的樣本類型多達數(shù)十種，而處理后產(chǎn)物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片、生物質(zhì)譜等各類分子生物學(xué)技術(shù)平臺。然而，無論是哪一類檢測項目，精確的檢驗結(jié)果無疑依靠于高質(zhì)量的標本及標本前處理過程。因此臨床分子診斷自動化趨勢將逐步在國內(nèi)臨床試驗室成為主導(dǎo)，而自動化首先將在目前手工操作較普及且對結(jié)果影響最大的核酸提取上實現(xiàn)。

6、磁珠法提取試劑加自動核酸提取儀，就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的完/美組合。然而，使用生物磁珠提取核酸的過程中，也存在著一些誤區(qū)。誤區(qū)1：磁珠越多，提取效果越好有許多老師喜愛在提取效果不佳的時候，增加磁珠的用量，認為磁珠多加一點，就能吸上更多的核酸，不得不說這種想法是不行取的。磁珠的主要特點是既可以分散于液體中，也可以在外加磁場作用下以固態(tài)方式和液相分別，任何試劑體系，磁珠和液體的比例都應(yīng)當是有肯定閾值的，超過肯定的比例，過多的磁珠將由于無法勻稱分散于液體中，而丟失其分散的特性，也使得洗滌過程中無法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率。而過量的磁珠也會吸附更多的雜質(zhì)，對于除雜的效果影響特別大。甚

7、至有些時候，過多的磁珠會吸附蛋白酶、溶菌酶等在液體體系中起主要作用的功能成分，導(dǎo)至整個試劑盒效率低下。有許多時候，在提取效果不佳的時候，削減磁珠使用量，反而是提升提取效果的最優(yōu)途徑。通常狀況下，磁珠法試劑盒給出的參考磁珠用量都是略微過量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的狀況并不多，但假如確定是磁珠用量不足導(dǎo)至的提取效果不好，是可以在肯定范圍內(nèi)通過增加磁珠用量來改善提取效果的。誤區(qū)2：試劑使用的越多，提取效果越好裂解效果不好?多加點裂解液。洗滌效果不好?多加點洗滌液。這是許多客戶在使用試劑盒中的慣性思維。但是對于磁珠法而言，每增加一部分液體體積，就削減了更多的磁珠碰撞幾率，而降低磁珠碰撞幾率

8、，會導(dǎo)至吸附率的大幅度下降。所以許多時候，雖然增加裂解液和洗滌液的確能夠起到增加裂解和增加洗滌的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，無法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的，所以單純增加試劑使用量改善提取效果并不肯定完全有效。誤區(qū)3:洗滌次數(shù)越多，提取效果越好提取得到的核酸雜質(zhì)過多時，使用者會考慮多進行幾次洗滌，以得到更為純潔的核酸。增加洗滌次數(shù)的確有利于提純核酸，但考慮到每次洗滌都會損失肯定量的核酸，且增加了核酸斷裂水解的可能性，所以一般來說洗滌次數(shù)掌握在24次為宜。誤區(qū)4:樣本取用的越多，提取效果越好在樣本不夠新奇或者核酸含量本身就很少的狀況下，往往核酸提取效果不好，許多老師

9、就會采納多取樣本的方式增加核酸提取量。但簡潔地增加樣本取樣量，有時會引入過多的雜質(zhì)，超出裂解液裂解力量，也會使提取效率降低，所以并不推舉通過簡潔的增加樣本取樣量的方式來達到增加提取量的目的。假如的確是由于樣本量不足而引起的提取量過低，建議在前處理先經(jīng)過富集或者濃縮步驟再開頭提取?；蛘咴黾恿呀獾耐耆?，使更多的核酸暴露出來也是一種解決方法。誤區(qū)5:某一種磁珠好，就應(yīng)當在全部試驗中效果都好磁珠的種類是多種多樣的，粒徑大小不同，分散性不同，磁響應(yīng)時間不同，包被基礎(chǔ)基質(zhì)不同，外層修飾官能團不同，包被密度不同，官能團臂長不同，會導(dǎo)至磁珠特性千差萬別。所以不同磁珠所適應(yīng)的試驗和體系也是不同的。就像同樣是核酸提取的試劑，配方也并不完全相同，同樣應(yīng)用于核酸提取的磁珠，性質(zhì)也并非完全全都。有的磁珠在常量核酸提取中表現(xiàn)出了更高的吸附效率，有的磁珠更適用于微量核酸提取。有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系，有的磁珠適合偏堿性系列的試劑體系。有的磁珠磁響應(yīng)性好但是沉降速度快，更適合磁棒式自動提取儀;有的磁珠沉降速度慢但是磁響應(yīng)時間長，更適合移液式自動提取儀。很少有一種磁珠能適用于全部試驗的狀況，除了固定的試劑盒協(xié)作，多數(shù)狀況下