CXP軟體中文簡易操作說明

1、 一、基本開機(jī)步驟與軟件主畫面說明1. 依常規(guī)模式進(jìn)入 Window20000 系統(tǒng)。2. 雙點(diǎn)桌面上 ，即可啟動(dòng)機(jī)器并進(jìn)入操作軟件。此時(shí)您可見到下面的畫面：3. 選取您自己的數(shù)據(jù)夾（請(qǐng)?jiān)?Password 處輸入密碼），并按下 Next 繼續(xù)。接著您能看到下面的畫面：1 4. 此時(shí)您能在左邊的窗口選取您即將使用的 Protocol，然后按下 Finish 進(jìn)入軟件，或不選取任何 Protocol，直接按下 Finish 進(jìn)入軟件，您即可見到軟件的工作區(qū)（workspace），如下圖：工作清單編輯區(qū)Resource ExplorerAcquisition Manager2 工作區(qū)分成三部份：a

2、. 工具列（CXP Toolbars）:各種功能的操作工具列，包含：1. 存取工具列提供開啟、儲(chǔ)存、打印及一般 Windows 操作系統(tǒng)下軟件的編輯功能。3 2. 繪圖工具列提供繪制各種分析圖形（Color dot plot、Histogram plot）及框選區(qū)域（Gating）的功能。4 3. 統(tǒng)計(jì)工具列設(shè)定各框選區(qū)域（Gate）的顏色、選擇統(tǒng)計(jì)數(shù)值、并可將數(shù)據(jù)輸出至 WindowExcel 軟件。4. 打印頁（FlowPAGE ）工具列提供編輯打印頁所需的各項(xiàng)功能。5 5. 機(jī)器操控工具列（僅在儀器操控軟件中）：操控機(jī)器的各項(xiàng)功能，包括：流速及機(jī)器的所有設(shè)定值。 點(diǎn)選icon 后，可開啟

3、儀器操控窗口，包含三個(gè)卷標(biāo)項(xiàng)目：1. Acquisition Setup Tab(Acq. Setup)2. Detector Tab(Detectors)3. Compensation Tab(Compensation)6 1. 在Acq. Setup 標(biāo)簽下可設(shè)定：Duration：收集Data 的時(shí)間Max. events：收集的細(xì)胞數(shù)目Acquisition mode：Setup mode：提供在線實(shí)時(shí)分析，不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。QuickCOMP：提供熒光補(bǔ)償滾動(dòng)條，幫助快速調(diào)整熒光補(bǔ)償值。QuickSET：提供電壓調(diào)整滾動(dòng)條，幫助快速調(diào)整每個(gè)Detectors的電壓值（Volts）。Dot：

4、開啟在線實(shí)時(shí)分 析模式（Setup mode）時(shí)，實(shí)時(shí)顯示的細(xì)胞數(shù)目。Discriminator（閥值）的設(shè)定紅光開關(guān)選項(xiàng)Parameters：點(diǎn)選進(jìn)入?yún)?shù)選取畫面，如下圖 依不同實(shí)驗(yàn)的需求，在此畫面選擇想要收取的參數(shù)項(xiàng)目。7 2. 在 Detectors 標(biāo)簽下可設(shè)定每個(gè)參數(shù)的電壓值（ Volts）及放大倍率值（Gain），或利用“ QuickSET ”提供的滾動(dòng)條快速調(diào)整電壓值。3. 在 Compensation 標(biāo)簽下可設(shè)定兩 兩參數(shù) 間的熒光補(bǔ)償 值，或 利用“ QuickCOMP ”提供的熒光補(bǔ)償滾動(dòng)條，幫助快速調(diào)整熒光補(bǔ)償值。8 工作清單編寫（僅在操控版中）6.供使用者編輯工作清單

5、的內(nèi)容（條件之設(shè)定請(qǐng)參考 p.33）。批次分析工具列（僅在分析版中）7.提供批次分析的各項(xiàng)設(shè)定及操控。9 8. 迭圖工具列（僅在分析版中）提供繪制迭圖（Overlay Plot）時(shí)所需的各項(xiàng)功能。10 b. 檔案總管（Resource Explorer）:利用鼠標(biāo)在做切換，讓您能夠看到您專屬數(shù)據(jù)夾中的 Worklists、Panels、Protocols、LMD Data 和 HSTData 等檔案。若要開啟檔案總管中的數(shù)據(jù)時(shí)，只需利用鼠標(biāo)將這些檔案直拖曳至軟件的桌面上，便可打開各式檔案或分析 Data。工作清單編寫區(qū)（Acquisition Manager :）c.利用工作清單工具列您可以在

6、此處編寫您即將要收集的樣本內(nèi)容，包括設(shè)定本次實(shí)驗(yàn)的染劑名稱參數(shù)名、List Mode Data 存盤的模式.等等（條件之設(shè)定請(qǐng)參考 p.33）。11 二、建立一個(gè)新的使用者在 CXP 軟件中，使用者可以設(shè)定自己專屬的數(shù)據(jù)夾，藉由這個(gè)數(shù)據(jù)夾的設(shè)定，計(jì)算機(jī)會(huì)自動(dòng)的將您在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)收集的 Data 儲(chǔ)存到您專屬的數(shù)據(jù)夾中，以避免不同使用者之間數(shù)據(jù)存取造成的混亂。以下步驟說明如何建立一個(gè)屬于您自己的數(shù)據(jù)夾：1. 開啟計(jì)算機(jī)進(jìn)入 Windows 2000 系統(tǒng)，雙點(diǎn)桌面上icon，即可啟動(dòng)機(jī)器并進(jìn)入操作軟件。此時(shí)您可見到下面的畫面：2. 點(diǎn)選程序管理員（ admin）數(shù)據(jù)夾后，左下角的“

7、Admin”按鍵會(huì)浮現(xiàn)，輸入Password 后，點(diǎn)選左下角的“Admin”，您能見到下面的畫面：Add user：新增一個(gè)使用者Delete use：刪除一個(gè)使用者M(jìn)odify user：修改已經(jīng)存在12 3. 點(diǎn)選“Add user”icon，您會(huì)看到下面畫面：User ID：在此鍵入使用者姓名Password：設(shè)定要進(jìn)入這個(gè)數(shù)據(jù)夾的密碼。Privilege：用來設(shè)定當(dāng)您使用這個(gè)使用者時(shí)存取的權(quán)限，建議您全部勾選。4. 點(diǎn)選 Paths 標(biāo)簽，您會(huì)看到下面的畫面：當(dāng)您建立一個(gè)新的使用者后，軟 件 會(huì) 自 動(dòng) 幫 您 在C:CytomicsCXPUser 這個(gè)路徑中建立一個(gè)您專屬的數(shù)據(jù)夾，并

8、在這個(gè)資要夾下建立數(shù)個(gè)用來儲(chǔ)存不同類型檔案的數(shù)據(jù)夾。13 5. 您也可以點(diǎn)選 鍵，將檔案儲(chǔ)存在您另外選定的數(shù)據(jù)夾中。例如：如果您想要把 LMD 檔案存在 D 槽的 Data 這個(gè)數(shù)據(jù)夾中，您便可以將 LMD數(shù)據(jù)夾的路徑指向 D:DATA（如下圖）。如此一來，您所收集的 LMD 檔案就會(huì)自動(dòng)存在 D:DATA中了。6. 設(shè)定好后，按下“確定”鍵，您會(huì)看到一個(gè)確認(rèn)的對(duì)會(huì)窗口。7. 最后按下“確定”，您便完成了一個(gè)新使用者的設(shè)定。14 三、設(shè)定一個(gè)新的 Protocol 基本觀念：Protocol 檔案（擴(kuò)展名為 *.pro）是 Cytomics CXP 這個(gè)軟件的中心骨架，您可以視它為一個(gè)空白的藍(lán)

9、圖。開啟一個(gè) Protocol 檔案后，可用來收取 List Mode Data（LMD），也可用來分析之前收下來的 LMD。一個(gè)完整的 Protocol 檔案包括：1. 您所選取的參數(shù)種類：FS、SS、FL15，Lin or Log。2. 您想要表現(xiàn)的圖形：包含利用選擇的參數(shù)所畫的點(diǎn)圖或直 方圖，以及圖上框選的區(qū)域與位置。3. 機(jī)器的設(shè)定條件：包含調(diào)整好的電壓值、熒光補(bǔ)償值、上樣流速、Data 儲(chǔ)存條件等。一般來說，設(shè)定一個(gè)新的 Protocol 分為以下幾個(gè)步驟：1. 開啟一個(gè)新的 Protocol：選擇 File / new / new protocol，即可開啟一個(gè)全新的 Protoc

10、ol。選擇您的實(shí)驗(yàn)需要收取的參數(shù)：開啟 Cytometer Control，點(diǎn)選Acq. Setup標(biāo)簽內(nèi)的“ Parameters”icon 勾選你需要的參數(shù)。你所選取的參數(shù)將會(huì)列在對(duì)話窗口的右手邊空白處。2.3. 利用您選擇的參數(shù)繪制您想要表現(xiàn)的 Flow圖形：利用繪圖工具列繪制雙參數(shù)圖（Color Dot Plot）或單參數(shù)圖（Histogram Plot），以及圖上可能需要的各式框選區(qū)間。4. 確認(rèn) Discrimination是否已設(shè)定完成：開啟 Cytometer Control，點(diǎn)選Acq. Setup 卷標(biāo)，檢查有對(duì)話窗口右手邊的 Discrimination 值是否已設(shè)定完成

11、（通常將 Discrimination 設(shè)為 FS=100）。5. 儲(chǔ)存此新的 Protocol檔名。6. 實(shí)際 Run樣本（Control or Negative Control）調(diào)整 Volts和 Gain 值：您可以開啟 Cytometer Control 中的 Detectors 標(biāo)簽，直接調(diào)整每個(gè)參數(shù)的Volts 和 Gain 值，也可以勾選 Cytometer Control 中的“QuickSET”選項(xiàng)，直接在圖形上的光標(biāo)滾動(dòng)條做調(diào)整。此時(shí)您必須完成下列的調(diào)整：15 a.b.c.調(diào)整 FS、SS 的 Volts 和 Gain 值，讓您在 FS/SS 的 Color Dot Plo

12、t 圖中能看到你想要分析的細(xì)胞族群。調(diào)整熒光參數(shù)的 Volts 和 Gain 值，使熒光參數(shù)的圖形中呈現(xiàn)出你預(yù)期的細(xì)胞分布狀況。根據(jù)細(xì)胞的分布狀況，調(diào)整各式框選區(qū)間的位置。7. 若您進(jìn)行的是多重?zé)晒馊旧膶?shí)驗(yàn)，則必須再逐一 Run 單一熒光染色的樣本，以調(diào)整出適當(dāng)?shù)臒晒庋a(bǔ)償值：您可以開啟 Cytometer Control 中的Compensation 標(biāo)簽，直接調(diào)整每個(gè)參數(shù)間的 Compensation 值；也可以勾選 Cytometer Control 中的“QuickCOMP”選項(xiàng)，直接在圖形上的光標(biāo)滾動(dòng)條做調(diào)整（若為單色熒光實(shí)驗(yàn)則不需調(diào)整此項(xiàng)設(shè)定否）。Note:1. 在進(jìn)行 Volts

13、、Gain、Compensation 等儀器條件的調(diào)整時(shí)，您必須把Acq. Setup 標(biāo)簽內(nèi)的“Setup Mode”勾選起來，此時(shí)圖形中的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變動(dòng)，且軟件不會(huì)將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存起來。2. 當(dāng)您完成任何一項(xiàng)設(shè)定的動(dòng)作后，請(qǐng)別忘了點(diǎn)選 Save Protocol，以確保您辛苦的設(shè)定已做了儲(chǔ)存。3. 以上所有的設(shè)定，都會(huì)被儲(chǔ)存在 Protocol 這個(gè)檔案中，日后您若要進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)，僅需把以前設(shè)定好的 Protocol 叫出，就可以直接收取您實(shí)驗(yàn)的 Data。16 雙染（FITC / PE）Surface Markers 的 Protocol 設(shè)定 設(shè)定此 Protocol，你必須準(zhǔn)備下列

14、 4 管樣本，用以調(diào)整儀器的設(shè)定值：1. Negative Control：未染色的細(xì)胞，或以 Isotype 抗體染色的細(xì)胞2. 單染 FITC 的陽性樣本3. 單染 PE 的陽性樣本4. 雙染的陽性樣本 操作步驟：a. 開啟一個(gè)新的 Protocol：1. 進(jìn)入 EXPO32 的軟件后，點(diǎn)選 File/New/New Protocol（如下圖），您便可以產(chǎn)生一個(gè)新的 Protocol（此 Protocol 的設(shè)定值為軟件的原始設(shè)定值），以此為出發(fā)點(diǎn)，修改成為合乎您實(shí)驗(yàn)需求的 Protocol。2. 關(guān)閉工作區(qū)中軟件自動(dòng)畫好的兩個(gè)圖形。17 b. 選擇您想要收取的參數(shù)：1. 按下機(jī)器操控工具

15、列中的 Cytometer Control。2. 點(diǎn)選 Acq. Setup 標(biāo)簽中的“Parameters”鍵后，出現(xiàn)選擇參數(shù)的窗口。3. 如上圖方式，勾選您實(shí)驗(yàn)所需要的參數(shù)（在此實(shí)驗(yàn)中我們選擇了 FS Lin、SS Lin、FL1 Log 和 FL2 Log 等四個(gè)參數(shù)），按下 OK 鍵，軟件會(huì)問您是否要儲(chǔ)存這個(gè)新的 Protocol，輸入您想要的 Protocol 檔名后，即完成參數(shù)的選擇。此時(shí)在檔案總管您的數(shù)據(jù)夾的 Protocol 選項(xiàng)中會(huì)出現(xiàn)你鍵入的這個(gè)Protocol，如下圖：18 c. 繪制您想要分析的 Flow 圖形：1. 回到軟件工作區(qū)，在繪圖工具列中點(diǎn)選 Color Do

16、t Plot 鍵下面的對(duì)話窗口：，您會(huì)看到2. 依照上圖，將 X 軸的參數(shù)設(shè)為 SS Lin，Y 軸的參數(shù)設(shè)為 FS Lin，按下 OK；您便可以得到一個(gè)以 SS Lin 為 X 軸，F(xiàn)S Lin 為 Y 軸的雙參數(shù)圖（如圖一）。3. 點(diǎn)選繪圖工具列中的多邊形框選或矩形框選 ，在此圖中畫出一個(gè)區(qū)域，計(jì)算機(jī)會(huì)自動(dòng)將此區(qū)域命名為 A；您也可以利用鼠標(biāo)點(diǎn)選 A 處，將此區(qū)域名稱更改為您所希望的（如圖二）。（圖一）（圖二）19 4. 再次點(diǎn)選繪圖工具列中的 Color Dot Plot 鍵，繪制第二個(gè)雙參數(shù)圖。5. 依照上圖，將 X 軸的參數(shù)設(shè)為 FL1 Log，Y 軸的參數(shù)設(shè)為 FL2 Log，Ga

17、te處選為 A，按下“確定”，便可以得到一個(gè)以 FL1 Log 為 X 軸，F(xiàn)L2 Log 為Y 軸的雙參數(shù)圖。接著點(diǎn)選繪圖工具列中的十字線框選 ，將十字線訂在第一個(gè)對(duì)數(shù)方格（B3）內(nèi)，如下圖：6. 按下 Save Protocol，儲(chǔ)存您對(duì)這個(gè) Protocol 所做的修改。d. 確認(rèn)Discrimination是否已設(shè)定完成：開啟Cytometer Control，點(diǎn)選 Acq. Setup卷標(biāo)，檢查有對(duì)話窗口右手邊的 Discrimination 值是否已設(shè)定完成（SurfaceMarker 的實(shí)驗(yàn)中，我們通常將 Discrimination 設(shè)為 FS=100）。20 e. Run 陰

18、性樣本（可使用未染色的樣本，或以 Isotype 染色的陰性樣本），依下列方式調(diào)整各個(gè)參數(shù)的 Volts和 Gain 值：1. 將 Cytometer Control / Acq. Setup 中的“Setup Mode”選項(xiàng)勾起。2. 將陰性樣本放入上樣 轉(zhuǎn)盤中，在 Acquisition Manager 中輸入 轉(zhuǎn)盤號(hào)碼（Carousel No.）及樣品館所放的位置（Location）。3. 按下儀器操控工具列中的 Start Acquisition，此時(shí)機(jī)器開始收集 Data，并顯示在您剛畫好的圖形上，由于 Setup Mode 選項(xiàng)已勾起，此時(shí)所收集的Data 并不會(huì)儲(chǔ)存（圖形中的數(shù)據(jù)

19、呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變動(dòng)）。在 Cytometer Control / Detectors中，調(diào)整 FS、SS 的 Volts 和 Gain值，直到 FS-SS 雙參數(shù)圖形中能夠見到您想要分析的細(xì)胞族群。調(diào)整 Gate A 的位置，框選您有興趣的細(xì)胞族群。（左圖以血液樣本為例，A 框選的區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞）調(diào)整二：接著調(diào)整 FL1、FL2 的 Volts 值，使 FL1 / FL2雙參數(shù)圖形中的細(xì)胞落 在 十 字 線 左 下 角 的 方 格 內(nèi)（B3 對(duì)數(shù)方格），如左圖：4. 按下機(jī)器操控工具列中的放棄鍵結(jié)束此管樣本的收集，并按下存取工具列中的 Save Protocol，將剛剛所做的設(shè)定儲(chǔ)存起來。21 f

20、. Run 單染的陽性樣本調(diào)整光補(bǔ)償（Compensation）：包括兩管樣本：以 FL1 單染樣本調(diào)整 FL2-%FL1以 FL2 單染樣本調(diào)整 FL1-%FL21. 將 Cytometrer Control / Acq. Set中up的“QuickCOMP”選項(xiàng)勾起，此時(shí)可以在 FL1-FL2 Color Dot plot 的兩側(cè)看到調(diào)整熒光補(bǔ)償值的滾動(dòng)條，如下圖：2. Run FL1 單染樣本，直接拉動(dòng)垂直滾動(dòng)條，調(diào)整 FL2-%FL1 的熒光補(bǔ)償值，直到 FL1 陽性細(xì)胞群的高度跟陰性細(xì)胞群的高度等高為止，如下圖：陽性細(xì)胞群陰性細(xì)胞群( No Compensation )( Compe

21、nsation OK )3. 按下放棄鍵結(jié)束此管樣本的收集，接著按下Save Protocol ，將剛剛22 您所做的設(shè)定儲(chǔ)存起來。4. Run FL2 單染樣本調(diào)，直接拉動(dòng)水平滾動(dòng)條，調(diào)整 FL1-%FL2 的熒光補(bǔ)償值，直到 FL2 陽性細(xì)胞群的左右位置跟陰性細(xì)胞群相當(dāng)為止，如下圖：No CompensationCompensation set OK（Compensation OK）（No Compensation）5. 按下放棄鍵結(jié)束此管樣本的收集，并按下 Save Protocol，將剛剛您所做的設(shè)定儲(chǔ)存起來。此時(shí)你已完成這個(gè) Protocol 的設(shè)定。g. Run 雙染樣本，正式收取

22、 Data1. 去除機(jī)器設(shè)定值啟控窗口（Cytometer Control）中“Setup Mode”的勾選，并將Acquisition Limits 中的Duration設(shè)為300，Max. events設(shè)定為10000。2. 再按一次 Save Protocol，將剛剛您所做的設(shè)定儲(chǔ)存起來。3. 將陽性雙染樣本放入上樣轉(zhuǎn)盤中，在 Acquisition Manager 中輸入轉(zhuǎn)盤號(hào)碼及樣品管所放的位置。4. 按下儀器操控工具列中的 Start Acquisition，此時(shí)機(jī)器開始收集 Data，并顯示在您設(shè)定好圖形上，直到累積滿 10000 顆細(xì)胞時(shí)，機(jī)器會(huì)自動(dòng)停止，儲(chǔ)存 Data，并將此

23、管樣本退出。此時(shí)桌面上的圖形顯示如下：23 欲察看各個(gè)框選區(qū)間的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，可將鼠標(biāo)移至雙參數(shù)圖形的左下角， 按下出現(xiàn)的符號(hào)，您可以看到計(jì)算機(jī)對(duì)各個(gè)區(qū)間所做的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，如左圖：如果想看其它統(tǒng)計(jì)值，請(qǐng)點(diǎn)選統(tǒng) 計(jì) 工 具 列 中 的 SelectStatistics，您便可以選擇想要看的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，如左圖：24 附錄：Surface Marker 樣本之制備及染色方法一取白血球再染色1. 取得含抗凝劑(EDTA or HEPARIN)的血，放置室溫。2. 用等量的 PBS 和 Blood 混合來稀釋 (最大稀釋比 PBS:Blood = 2 : 1 )3. 取 3 c.c Ficoll-Hypaque

24、(density 1.077) 放入 15 mL tube(or 取 12 c.c Ficoll-Hypaque 放入 50 mL tube)4. 慢慢放入稀釋血 8mL (or 30mL)在 Ficoll-Hypaque 之上方，不要混淆到下層。5. 小心 balance 后，離心 400g，25min，RT6. 小心取得 mononuclear layer cells7. 加入 2 倍量的 PBS 來稀釋 mononuclear layer cells8. 200g，10min，去上清液9. 重復(fù) Step7、810. 計(jì)算細(xì)胞數(shù) and resuspend (細(xì)胞濃度調(diào)整到接近 1x10

25、7cells/ mL)11. 保存在 4，一直到使用12. 取 100uL cells20uL mAb，Mix13. Incubation 30 min14. Resuspend to 500uL1mL with PBS (含 0.5% paraformaldehyde)15. Run within 6 hours方法二直接全血染色法1. 100ul whole blood20ul mAb.2. Incubation 15-20 min3. 500ul OptiLyse C, Mix4. incubation 10 min, RT5. 500ul PBS, Mix6. After at lea

26、st 10 min7. Run on instrument25 Cell Cycle 的 Protocol 設(shè)定a. 開啟一個(gè)新的 Protocol：選擇 File / new / new protocol 開啟一個(gè)全新的Protocol。b. 關(guān)閉工作區(qū)中軟件自動(dòng)畫好的兩個(gè)圖形。c. 選擇您的實(shí)驗(yàn)所需要收取的參數(shù)：開啟 Cytometer Control，點(diǎn)選 Acq. Setup標(biāo)簽內(nèi)的“Parameters”鍵，勾選需要的參數(shù)，如下圖：26 d. 繪制您想要分析的 Flow 圖形：Cell Cycle 實(shí)驗(yàn)的 Protocol 需要的圖形及框選區(qū)間如下：（請(qǐng)注意每個(gè)圖形選擇的 Gatin

27、g 區(qū)間）OITe. 設(shè)定 Dot Plot 中的細(xì)胞顏色：點(diǎn)選統(tǒng)計(jì)工具列中的 Create/ modify Color GatePrecedence Setup ，將框選區(qū)間的順序及顏色設(shè)定為下列模式：27 f. 確認(rèn) Discrimination 是否已設(shè)定完成：開啟 Cytometer Control，點(diǎn)選 Acq.Setup，檢查對(duì)話窗口右手邊的 Discrimination 值是否已設(shè)定完成，Cell Cycle的實(shí)驗(yàn)中，我們通常將 Discrimination 設(shè)為 FS=100 或 FL3 =20。g. 實(shí)際 Run 樣本（已固定且以 PI 染色的健康細(xì)胞）：依下列方式調(diào)整每個(gè)參

28、數(shù)的Volts 和 Gain 值。調(diào)整 FS 和 SS 的 Volts 和 Gain 值，使大部分的細(xì)胞（主細(xì)胞群）落于FS 和 SS 的雙參數(shù)圖中，并調(diào)整Gate A，將主群細(xì)胞框選起來。調(diào)整 FL3 Lin 和 AUX 的 Volts和 Gain 值，把 RATIO讀值最大的細(xì)胞落于圖形最上面，并調(diào)整 Gate B 將最上層的細(xì)胞群框選起來。Note：RATIO 的調(diào)整包含分 子G0G1 Phase，一般常將G0G1 Phase 調(diào)整至Mean= 200300 間。（AUX）及分母（FL3 Lin），如 RATIO 值太大，可將分子（AUX）調(diào)小，或?qū)⒎帜刚{(diào)大（FL3 Lin）。28 此時(shí)

29、即可得到 Cell Cycle 的直方圖，如下圖：G0G1 Phase此外，檢視 Double Check 的圖形（FL3 Lin vs. AUX），單顆細(xì)胞（紅色的點(diǎn)）應(yīng)該分布在由左下到右上的 45 切線上。這代表您在第二個(gè)圖形中的框選是正確無誤的，如下圖：29 Note：1. 步驟中切記觀察細(xì)胞是否有群聚現(xiàn)象，若細(xì)胞無法拍散，則重新置備樣本。2. 結(jié)果評(píng)估：Data 收取后，我們通常會(huì)檢視 G0G1 Phase 的變異系數(shù)（CV 值），用以評(píng)估細(xì)胞的固定、染色過程是否完善。一般來說， 我們會(huì)要求 G0G1Phase 的 CV 值必須小于 8，代表細(xì)胞的固定過程良好，并具有均一的染色結(jié)果，如

30、下圖。CV 值大于 8 的數(shù)據(jù)，必須舍棄不用。 CV 值不好的結(jié)果可能肇因于：細(xì)胞固定步驟不良 改善固定步驟，請(qǐng)教有經(jīng)驗(yàn)者。使用了不當(dāng)?shù)墓潭ㄔ噭?更換固定試劑。染色時(shí)間不足 增加染色時(shí)間。RNase 處理時(shí)間不足 增加 RNase 處理時(shí)間。有時(shí)候可將 CV 值太高的樣本再放入 37 中反應(yīng) 10 分鐘，即可改善結(jié)果。30 3. Cell Cycle 數(shù)據(jù)分析：要分析細(xì)胞周期中的各個(gè)時(shí)其所占的比例，可以下列兩種方法進(jìn)行：a. 利用可分析 List Mode Data 的軟件（如 EXPO32、CytomicsCXP、WinMDI等），依照上述 Protocol 所設(shè)定的圖形及框選區(qū)域來分析 D

31、ata 后，在FL3 Lin 的直方圖中，由人為判斷劃分三個(gè)區(qū)間，軟件即可算出三個(gè)區(qū)間所含細(xì)胞的比例，如上圖。b. 先以 EXPO32 或 Cytomics CXP 軟件分析 List Mode Data，得到 FL3 Lin直方圖后，點(diǎn)選 File / Save Histogram Data As，將 FL3 Lin 直方圖另外存成一圖形文件（擴(kuò)展名為 *.hst），將此圖形文件利用 Cell Cycle 分析專用的軟件（如 Multicycle、ModFit等）開啟并分析，這類的軟件會(huì)輔助判讀 Cell Cycle 的各個(gè)區(qū)間，并計(jì)算比例。附錄：常用的固定染色法（酒精固定法及 染色）：PI

32、Cell Cycle1. 置備懸浮細(xì)胞液，最后濃度調(diào)整約為 5106 cells/ mL。若細(xì)胞株為 Attachedcell Line，先以 Trypsin 將細(xì)胞打下，再調(diào)整濃度（注意 Trypsin 處理不可過頭）。2. 取 1 mL 細(xì)胞液，以冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞一次，離心后，倒除上清液。3. 以剩余的上清液將細(xì)胞打散（必須確定細(xì)胞已完全打散）。4. 在震蕩器上（轉(zhuǎn)速不可開太快）一邊震蕩一邊逐一滴入 3 mL 70% 冰冷的酒精，（注意觀察細(xì)胞，不要讓細(xì)胞發(fā)生 aggregate 現(xiàn)象）。5. 置于20冰箱中固定至少一小時(shí)。6. 染色前，將細(xì)胞從20冰箱取出，300 g 離心 5

33、分鐘，去除上清液。7. 以剩余的上清液將細(xì)胞打散，加入 5 mL PBS，靜置 3 分鐘后離心，去除上清液。8. 重復(fù)步驟 7，以 5 mL PBS 再清洗細(xì)胞一次。9. 加入 1 mL PI / Triton X-100 (Final Conc. P I20 g /mL, Triton-X 100 0.1%,RNase A 0.2mg/ml )，均勻打散細(xì)胞，避光染色至少 30 分鐘。10.上機(jī)前打散細(xì)胞并以 35 m 尼龍篩網(wǎng)過濾樣本。31 四、List Mode Data 的收集1. 開啟合適的 Protocol：利用檔案總管（Resource Explorer）直接將你事先設(shè)定好的 P

34、rotocol 拖曳到工作區(qū)中。2. 此時(shí)軟件下方的工作清單編寫區(qū)（Acquisition Manager）中會(huì)同時(shí)出現(xiàn)一列上樣數(shù)據(jù)（Tube），如下圖： 此處提供您下列的信息及設(shè)定空間32 a.b.：顯示你剛剛拖曳出來的 Protocol 名稱，也就是你即將用來收取 List Mode Data 的 Protocol。：在此鍵入您即將分析的樣品的染色名稱，你在此設(shè)定的染色名稱，會(huì)在 LMD 儲(chǔ)存時(shí)一起存到 List Mode Data 中。日后當(dāng)你分析這個(gè) LMD 時(shí)，染色名稱就會(huì)一并出現(xiàn)在圖形的 X 軸和 Y 軸上。c.d.e.：在此鍵入這個(gè)樣本所放置的轉(zhuǎn)盤號(hào)碼和位置，錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)盤號(hào)碼和位置

35、會(huì)導(dǎo)致樣本無法正常上樣。：在此鍵入樣本的名稱，您在此設(shè)定的樣本名稱，會(huì)出現(xiàn)在 List ModeData 檔名的最前方，成為 LMD 檔名的一部份，：在此顯示的是這管樣本即將儲(chǔ)存的文件名稱，你可以按一下左上角的，進(jìn)入 Workspace Preferences 中的 LMD File Name 做修改，如下圖：在此對(duì)話窗口中，你可以依照你的喜好設(shè)定 LMD 檔案的存盤檔名。建議使用者勾選：1. Sample ID 12. Y2K Date (YYYY-MM-DD)3. Tag NumberStart At 001這代表軟件會(huì)以分析樣品的 ID 名稱、分析當(dāng)天的日期以及分析的 是第幾 支樣品作為

36、 LMD 的檔名。例如：2004 年 3 月 13 日分析的第 1 管Negative control 樣品的檔名會(huì) 是：Negative control 2004-03-13 001.LMD33 3. 利用工作清單編寫工具列和上述的工作清單編寫區(qū)（Acquisition Manager）編寫以下的資料：a. 你打算 Run 幾支樣本：利用 Insert Tube一管一管加入工作清單。b. 每支樣本的染色名。c. 你打算儲(chǔ)存的 LMD 文件名稱。d. 樣本轉(zhuǎn)盤的號(hào)碼、樣本管放置的位置。4. 開啟儀器操控對(duì)話窗口 Cytometer Control：在 Acquisition Limits 中設(shè)

37、定收集Data 的時(shí)間（Duration）和打算收集的細(xì)胞數(shù)量（Max. Events），并確定“SetupMode”已取消勾選后，再按一下 Save Protocol。5. 按下儀器操控工具列中的 Start Acquisition ，儀器就會(huì)依照你剛剛編輯的工作清單，逐一分析并收取每個(gè)樣本的 List Mode Data，儲(chǔ)存在您專屬的 LMD 數(shù)據(jù)夾中。利用桌面上Protocol的儀器設(shè)定條件以工作清單鍵入的染色名和文件名34 五、Flow Check Run Flow-Check 的意義與目的：Flow-Check 是一種大小一致（10m）的熒光小珠，表面批附一層熒光物質(zhì)，被雷射激發(fā)后

38、，能發(fā)出均一且穩(wěn)定的熒光，跑 Flow-Check 的目的，是用來確認(rèn)機(jī)器的流路是否順暢，雷射光是否準(zhǔn)確的掃瞄到每一顆細(xì)胞。當(dāng)機(jī)器穩(wěn)定時(shí)，F(xiàn)low-Check 被雷射激發(fā)出的 FS 讀值和每個(gè)熒光參數(shù)讀值的HP X-CV 值必須在 3 以下，而每次所測得 X-mean 值的差異應(yīng)在+/-5%之間。如下圖： Run Flow Check 的時(shí)機(jī)：a. 每次開機(jī)后、Run 樣本前。b. 當(dāng)您懷疑儀器有問題或不穩(wěn)定時(shí)。 Flow Check 的種類：a. 標(biāo)準(zhǔn)的 Flow Check（P/N 6605359）：使用 488 nm 藍(lán)光雷射時(shí)，用以評(píng)估FS、FL1、FL2、FL3、FL4 等 5 個(gè)參

39、數(shù)的 HP-CV 值與 Mean 值。b. Flow Check 770（P/N 6607121）：使用 488 nm 藍(lán)光雷射時(shí)，用以評(píng)估FS 和 FL5 這 2 個(gè)參數(shù)的 HP-CV 值與 Mean 值。c. Flow Check 675（P/N 6607120）：使用 633 nm 紅光雷射時(shí)，用以評(píng)估FS 和 FL4 這 2 個(gè)參數(shù)的 HP-CV 值與 Mean 值。35 Run Flow Check：a. 依常規(guī)模式進(jìn)入 Cytomics CXP 軟件，開啟一個(gè) 合適的 Flow CheckProtocol，你可以自己編寫一個(gè)專門用來 Run Flow Check 的 Protoco

40、l，也可以借用軟件內(nèi)建的 Flow Check Protoco（l 你可以在 Common 的 Protocol數(shù)據(jù)夾中找到）。b. 依正常模式收取一個(gè) 3000 顆細(xì)胞的 List Mode Data，開啟統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)欄，記下 FS、FL1、FL2、FL3、FL4、FL5 等參數(shù)的 HPX-CV 和 X-mean 值。c. HPX-CV 值應(yīng)在 3 以下，每次所測得 X-mean 值的差異應(yīng)在+/-5%之間，以確保機(jī)器處于穩(wěn)定狀態(tài)。d. 若 HPX-CV 和 X-mean 值不在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，請(qǐng)進(jìn)行 Prime 和 Cleanse 的動(dòng)作后，再重新跑一次 Flow check，若無法改善，請(qǐng)即刻通

41、知 Beckman Coulter公司的工程師。e. 當(dāng) Flow check 完成后，即可進(jìn)行您樣本 Data 的收集。36 六、CXP Analysis1. 開啟 Windows 2000 后，點(diǎn)選桌面上的啟動(dòng) CXP Analysis離線軟件。2. 選取你專屬的數(shù)據(jù)夾，輸入 Password 后，即可進(jìn)入軟件主畫面，如下圖：主畫面與 CXP Cytometer 極為相似，操作方法也雷同，但在 Analysis 中多了數(shù)個(gè)特殊的圖形可供繪制、也增加了批次分析工具列與迭圖工具列。批次分析工具列Note：CXP Analysis 和 CXP Cytometer 的數(shù)據(jù)夾是共享的，也就是你在其中

42、一個(gè)軟件設(shè)立的專屬數(shù)據(jù)夾，也可以在另一個(gè)軟件中看到。37 單一 List Mode Data 的分析：用鼠標(biāo)點(diǎn)選檔案總管（Resource Explorer）中的 Protocol或 LMD，您能看到在你專屬數(shù)據(jù)夾中所有的的 Protocol 或 List Mode Data。分析單一個(gè) List Mode Data 有兩種方法：1. Run Time Protocol analysis：利用“ 收取這個(gè) Data 時(shí)所用的 Protocol ”來分析這個(gè) LMD。將檔案總管中的 List Mode Data 直接拖曳到空白工作區(qū)中即可完成分析，如下圖：直接將 LMD 拉到工作區(qū)內(nèi)2. 利用其

43、它的 Protocol來分析：a. 在檔案總管中選取您要用來分析 Data 的 Protocol，并將它拖曳至工作區(qū)中。b. 再將 List Mode Data 拖曳到這個(gè) Protocol 中，即可完成分析，這時(shí)軟件變會(huì)利用工作區(qū)中 Protocol 的設(shè)定來分析你拉出來的 LMD，如下圖：c. 接著，您可以再拖曳其它的 LMD Data 到這個(gè) Protocol 中，舊的 Data 便會(huì)被新的取代。38 先將 Protocol 拉到工作區(qū)中，再將 LMD 拉到 Protocol 中d. 點(diǎn)選存取存取工具列中的打印打印，如下圖：功能，你可以選擇您想要打印的模式進(jìn)行Print Statisti

44、cs：只印統(tǒng)計(jì)數(shù)值Print FlowPAGES：打印打印頁Note：在分析 Data 時(shí)，我們常采用第一種方法分析，但通常我們會(huì)對(duì) Protocol 做一些修改，例如：加入打印頁（FlowPage），或?qū)?Protocol 修改成能同時(shí)分析數(shù)個(gè) Data 的模式。建議您將修改過的 Protocol 另外存成一個(gè)分析專用的Protocol，以方便日后使用。39 離線熒光補(bǔ)償調(diào)教（LMD Compensation）傳統(tǒng)上，熒光補(bǔ)償值在 Data 收集的同時(shí)就必須做妥善的調(diào)整，當(dāng) List ModeData 儲(chǔ)存完成后，若發(fā)現(xiàn)熒光補(bǔ)償不恰當(dāng)，則必須重新收集 Data。然而 FC 500采用較先進(jìn)的

45、 FCS 3.0 檔案存取模式，儲(chǔ)存的 List Mode Data 仍然可在離線狀況下利用軟件做熒光補(bǔ)償值的修正。在 CXP Analysis 中進(jìn)行分析時(shí)，若發(fā)現(xiàn) Data 的熒光補(bǔ)償值需要修正，可點(diǎn)選主要工具列的 Analysis / LMD QuickCOMP，此時(shí)工作區(qū)內(nèi)熒光雙參數(shù)圖的 X 軸和 Y 軸上會(huì)出現(xiàn)調(diào)整熒光補(bǔ)償值的滾動(dòng)條，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)一個(gè) Compensation Matrix的對(duì)話窗口，針對(duì)需要調(diào)整熒光補(bǔ)償值的參數(shù)，拉動(dòng)適當(dāng)?shù)臐L動(dòng)條，就可進(jìn)行離線熒光補(bǔ)償調(diào)教：未做熒光補(bǔ)償調(diào)整40 繪制等高線圖（Contour Plot）、密度圖（Density Plot）、島嶼圖（Sur

46、face Plot）、透試圖（Tomogram）CXP Analysis 中增加多種在 CXP Cytometer 中無法繪制的圖形，您可以利用繪圖工具列簡單地繪制這些圖形：等高線圖 Contour Plot密度圖 Density Plot島嶼圖 Surface Plot透視圖 Tomogram41 編寫打印頁（FlowPAGE）:在 CXP 這個(gè)軟件中進(jìn)行打印時(shí)，圖形（Plots）和統(tǒng)計(jì)數(shù)值（Statistics）是被分開來打印的。使用者若想要讓統(tǒng)計(jì)數(shù)值伴隨著圖形來打印，則需要編寫一個(gè)打印頁（FlowPAGE）。打印頁（FlowPAGE）好比一張 A4 的打印紙，我們可以在 Protocol

47、 中預(yù)先編寫排版好的打印頁。當(dāng)需要打印時(shí)，您只要打印這張打印頁，便可以得到您想要的排版模式。1. 點(diǎn)選打印頁工具列中的 New flowpage，您會(huì)得到一個(gè)空白的打印頁。點(diǎn)選您想要放在打印頁中的圖形，直接將它拖曳到打印頁中，這個(gè)圖形就會(huì)出現(xiàn)在打印頁中，如下圖：42 2. 利用打印頁工具列，您可以在打印頁中插入文字、圖片，并將分析圖形加以排版，成為您想要的樣子。注意：打印頁上的圖形和工作區(qū)中的圖形是同步的，所以當(dāng)您拖曳一個(gè)新的 LMD Data 到工作區(qū)時(shí)，打印頁中的圖形也會(huì)隨之更新。3. 按下存取工具列中的 Save Protocol，您編寫的打印頁便會(huì)儲(chǔ)存成 為Protocol 的一部份，

48、當(dāng)您下次再將這個(gè) Protocol 叫出時(shí)，這個(gè)打印頁會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在工作區(qū)中。4. 此外，您可以進(jìn)一步將打印頁轉(zhuǎn)存為我們常用的 PDF 檔案格式：點(diǎn)選主要工具列中 Files / Print to PDF f，il便e可以將 FlowPAGE 儲(chǔ)存成為 PDF 文件形式。43 多檔案分析有時(shí)候我們會(huì)同時(shí)將數(shù)個(gè) LMD Data 放在同一個(gè) Protocol 中分析比較，這時(shí)我們必須將原來只能分析一個(gè) LMD Data 的 Protocol 修改成同時(shí)能分析數(shù)個(gè) LMD 的Protocol。在此我們以建立一個(gè)能同時(shí)分析 4 個(gè)檔案的 Protocol 為例子，作為說明：1. 將只能分析一個(gè) LMD

49、 Data 的 Protocol 拖曳至工作區(qū)。2. 拖曳第一個(gè)要分析的 LMD Data 到這個(gè) Protocol 中。3. 點(diǎn)選 FL1/FL2 的雙參數(shù)圖形，選擇 Plot / Duplicate Plot，此時(shí)會(huì)復(fù)制一個(gè)和 FL1/FL2 完全相同的雙參數(shù)圖形，利用鼠標(biāo)直接將原來雙參數(shù)圖形中的十字線區(qū)域拖曳至新的雙參數(shù)圖形中，復(fù)制位置完全相同的十字線區(qū)域，但軟件會(huì)自動(dòng)將您新的區(qū)域附上新的名字。如下圖：4. 按著鍵盤上的 Ctrl 鍵不放，同時(shí)利用鼠標(biāo)將第二個(gè)要分析的 LMD Data 拖曳至上一步驟中復(fù)制出來的雙參數(shù)圖形中，這時(shí)我們會(huì)在新的雙參數(shù)圖形中看到第二個(gè) LMD Data 的分

50、析結(jié)果。44 5. 重復(fù)步驟 35，您便可以在一個(gè) Protocol 中，同時(shí)看到四個(gè)不同檔案分析的結(jié)果，如下圖：45 6. 點(diǎn)選 File / Save Protocol A s，將這個(gè)修改過的 Protocol 另存新檔，現(xiàn)在這個(gè) Protocol 便能用來同時(shí)分析 4 個(gè) LMD Data。Note：因?yàn)檫M(jìn)行多檔案分析的 Protocol無法再用來收取 Data，我們通常將這樣多檔案分析專的 Protocol 存在（Analysis）這個(gè)數(shù)據(jù)夾用 Protocol中以資區(qū)別。7. 重新開啟這個(gè) Protocol，這時(shí)您可以直接（不需再按 Ctrl 鍵）將您要分析的 4 個(gè) LMD Dat

51、a 分別拖曳到各個(gè) Color Dot Plot 中。如下圖：46 迭圖（Overlay Plot）細(xì)胞在處理 前和處理后的熒光 變化，我們 常以迭圖的 方式表現(xiàn)。在 CXPAnalysis 軟件中，有三種方法可繪制迭圖：1. 凍結(jié)法a. 在工作區(qū)中，先開啟一個(gè) List Mode Data。b. 進(jìn)入直方圖的修改對(duì)話窗口，在 Histogram 選項(xiàng)下方勾選凍結(jié)選項(xiàng)，凍結(jié)這個(gè)直方圖，如下圖：在此圖中按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選 Format 進(jìn)入修改窗口。在 Histogram 選項(xiàng)中，將凍結(jié)選項(xiàng)勾起，以凍結(jié)這個(gè)圖形。c. 從檔案總管中拖曳另一個(gè)檔案到這個(gè) Protocol 中，即可完成這兩個(gè)檔案的迭圖

52、，如下圖：Note：凍結(jié)法操作容易，但最多只可同時(shí)重迭三個(gè)檔案。d. 可重復(fù)上述方法，進(jìn)行第二個(gè)檔案的凍結(jié)。47 2. 在多檔案分析的 Protocol 中繪制迭圖a. 編寫一個(gè)多檔案分析的 Protocol。b. 點(diǎn)選繪圖工具列中的 Overlay plot，此時(shí)會(huì)在軟件工作區(qū)中出現(xiàn)一個(gè)空白的迭圖，利用鼠標(biāo)直接將想要重迭的單參數(shù)圖（*.HST）直接拖曳至這個(gè)空白的迭圖中，如下圖：c. 點(diǎn)選迭圖工具列中的 Overlay mode即可完成迭圖，如下圖：你可以進(jìn)一步利用迭圖工具列中的工具，插入統(tǒng)計(jì)數(shù)值、或說明文字來修飾這個(gè)迭圖。48 3. 將要重迭的單參數(shù)圖（Histogram）另外存檔，再進(jìn)行迭圖a. 依正常方式分析第一個(gè) List Mode Data。b. 點(diǎn)選打算進(jìn)行迭圖的單參數(shù)圖后，點(diǎn)選File / Save Histogram File A，s將這個(gè)直方圖單獨(dú)以 Hst 檔案格式儲(chǔ)存到 HST 的數(shù)據(jù)夾中，如下圖：將這個(gè)直方圖以 Hst 檔案模式存在 HST 這個(gè)數(shù)據(jù)夾中c. 重復(fù)上述步驟，將要重迭的單參數(shù)圖都存在 HST 數(shù)據(jù)夾中。d. 在任何一個(gè) Protocol 中點(diǎn)選點(diǎn)選繪圖工具列中的 Overlay plot，開啟一個(gè)空白的迭圖，利用鼠標(biāo)將你剛剛存在 HST 數(shù)據(jù)夾中的 Hst 檔案拖曳到這個(gè)空白的迭圖中，即可得到如