免疫組化染色常見問題及解釋

1、一、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。在免疫組化最后結(jié)果的判斷時(shí)，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現(xiàn)象，經(jīng)多方研究認(rèn)為，它是一種假性非特異性的染色。因?yàn)槟[瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴(kuò)散彌散，腫瘤細(xì)胞無限制的生長和生長過速，導(dǎo)致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用，可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì)，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時(shí)的固定所引起的。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會自溶，抗原就會擴(kuò)散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標(biāo)本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時(shí)間，在這段時(shí)間里，有的

2、抗原就可以發(fā)生擴(kuò)散。雖然已浸入了固定液，但標(biāo)本較大，固定液的量又不足，當(dāng)然由于固定液的滲透需要時(shí)間，當(dāng)滲入到組織之中時(shí)，中間的細(xì)胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴(kuò)散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當(dāng)切除后標(biāo)本較大，雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達(dá)到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，當(dāng)固定液發(fā)揮作用時(shí)，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達(dá)到免疫組織化學(xué)染色的要求，對于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應(yīng)將其剖開，早取材，早固定。二、組織脫水必須徹底干凈組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時(shí)間內(nèi)脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟

3、不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導(dǎo)致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復(fù)操作，造成年人力物力的浪費(fèi)，造成病理報(bào)告的延期發(fā)出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外，即平整、外觀好看，還要求適中。三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的切片，對切片的質(zhì)量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí)，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在

4、鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引起混淆。四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。免疫組織化學(xué)染色前的前期準(zhǔn)備工作，就是必須對新的載玻片進(jìn)行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認(rèn)為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯(cuò)誤的想法。新出廠的載玻片，表面復(fù)蓋著開一層油脂樣的物質(zhì)，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí)甚至過夜，然后取出，經(jīng)自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達(dá)2小時(shí)以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了一氨基一三乙氧基一硅烷（一）的稀釋液（：用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化分鐘，后經(jīng)無水乙

5、醇洗次，烘干即可使用。五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。應(yīng)用于免疫組化染色的切片。由于整個(gè)過程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理，如抗原修復(fù)時(shí)抗原修復(fù)液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，的反復(fù)沖洗，有的甚至于C冰箱中孵育達(dá)十幾小時(shí)。因此,對切片的質(zhì)量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在C以下烘烤分鐘即可按此進(jìn)行結(jié)果是切片掉片嚴(yán)重，切片松動率占：00。%切片究竟烘烤多長時(shí)間才合適，既不脫片和適合各項(xiàng)要求，又不至于破壞抗原。幾組實(shí)驗(yàn)診斷認(rèn)為，切片在C的恒溫干燥箱中烘烤小時(shí)最為合適。這是因?yàn)椋嚎乖赡褪苋绱说臏囟?，病理科一般使用的石蠟，其熔點(diǎn)在0左右，組織

6、浸蠟時(shí)，浸蠟箱中的溫度，一般都調(diào)在C左右,組織在這樣溫度中要浸泡2小時(shí)以上，才能達(dá)到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65的溫度考驗(yàn)，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時(shí)間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達(dá)，保證了病理診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。特需要注意的是，不管是應(yīng)用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應(yīng)盡快進(jìn)行染色。如果切片切完后，遲遲不進(jìn)行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時(shí)間的延長而逐漸消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達(dá)更多的抗原。六、切片脫蠟必須干凈，否則將會影響免疫組化染色的最后結(jié)果。蠟

7、不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時(shí)間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長，分鐘或更長?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié),不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間，原則上

8、是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果更好。七、必須徹底抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。在各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過氧化物酶，尤其在紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細(xì)胞和組織如果在染色前不對其進(jìn)行處理和抑制，它們將會在底物的顯色時(shí)，與一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混

9、亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行抑制。當(dāng)然，對它們進(jìn)行徹底的消除是不行的，因?yàn)橐种铺珔柡?，對抗原也會有相同的抑制作用。氫在抑制?nèi)源性過氧化物酶時(shí)，也要注意對抗原的保護(hù)抑制也只能對它們中的大部分在顯色后，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽性物的區(qū)別。抑制劑常用的是的，也可將其稱為，因?yàn)槭惺鄣牡臐舛葹?，按其凈含量則為，如果按其溶液的用量則為關(guān)于的使用，有的使用是單純的稀釋溶，有的使用是甲醇混合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為甲醇較適合于大多數(shù)的情況，因?yàn)槌讼Σ?，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認(rèn)為在多數(shù)情況中，用甲醇已經(jīng)獲得令人滿意的結(jié)果。八、須適當(dāng)合理地

10、使用封閉試劑為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認(rèn)為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分無特異性地結(jié)合（如膠原）。由于這種非特異性結(jié)合，將導(dǎo)致標(biāo)記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標(biāo)記的抗體無特異性結(jié)合。以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.或2%1：.5、1：10、和1:20.必須選擇合適的抗體以及對作適當(dāng)?shù)谋４婧团渲?。九、選擇合適的抗體至今為止，應(yīng)用于臨床的常用抗體有幾十種，在這

11、當(dāng)中又可分為兩種類型。濃縮型抗體根據(jù)近幾年來使用的情況認(rèn)為，它有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處：可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時(shí)很長時(shí)間才遇到一例，這就給抗體的應(yīng)用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時(shí)購買，則需較長的時(shí)間，這樣就會延誤診斷。實(shí)踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測抗體。當(dāng)購買抗體后，根據(jù)檢測病例的數(shù)量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟?zāi)し馄饋?，于一C的低溫冰箱中保存，臨用時(shí)取出一支，用指溫促其回升至室溫,然后用稀釋即可使用，這種抗體

12、可保存年左右。成本低，價(jià)格較便宜。它與即用型的抗體相比較，價(jià)格要便宜好多，如以某公司年年的為例，濃縮型的抗體1價(jià)格元，該抗體可稀釋為，以每張切片所需抗體為計(jì)，可標(biāo)記例，每例一抗體所需元，而即用型抗體5價(jià)格元，可標(biāo)記例,每例一抗體需元。需要稀釋抗體，手續(xù)較為復(fù)雜。對于新購入的濃縮型的抗體，使用時(shí)必須將稀釋為工作液，才能使用，對于從未用過的抗體，還必須實(shí)驗(yàn)其實(shí)際的稀釋度，因?yàn)楦鞣N抗體，廠家都做了相應(yīng)的稀釋度的實(shí)驗(yàn)，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對抗體的稀釋度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如等，如果結(jié)果在：上是最佳結(jié)果，這就是最佳的稀釋點(diǎn)，如果在這范圍內(nèi)找不出最佳稀釋點(diǎn)，則應(yīng)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)直到找

13、出最佳稀釋點(diǎn)為止。需要配置各型號的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。需要具備一定的英語水平，因?yàn)闈饪s型的抗體多為進(jìn)口試劑，其使用書都以英文為主，其中涉入抗體的來源，適應(yīng)讓稀釋對什么組織或細(xì)胞可起反應(yīng)等。即用型抗體。近幾年來，免疫組化技術(shù)應(yīng)用的推廣，即用型抗體的應(yīng)用越來越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來的使用，認(rèn)為它有許多優(yōu)點(diǎn)和不足：使用方便。對于初學(xué)者來說，它是一種最好的抗體，不管什么樣的病例和切片，只要有抗體，不需要自己摸索稀釋度，拿起試劑瓶一滴即可，極不方便。對于不具備或基本不懂免疫組化技術(shù)的人，只要按照說明書的方法使用，也能獲得理想的結(jié)果。不需要配置多種昂貴的微量加樣器?，F(xiàn)今的微量加樣器，如

14、為進(jìn)口貨，貴者多達(dá)兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋，即買即用，無需配備其余器械。特別適合于基層單位。基層單位，無需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對于提高診斷的準(zhǔn)確率，極有好處。價(jià)格較濃縮型抗體貴。即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位,對于一個(gè)包裝的抗體，一年需要用幾支，這對抗體來說，不會造成浪費(fèi)。但如果為較小的單位，一年中標(biāo)記的病例較少，購買抗體時(shí)也盡量選小包裝的抗體，女口5如果碰上罕見的病例，有時(shí)一年也標(biāo)記不了幾例，這樣就應(yīng)采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年，因?yàn)榭贵w從生產(chǎn)商到銷售商的手里，需要

15、一定的時(shí)間，如果運(yùn)氣好的話，你購買到的抗體，是剛交到銷售商的手里，那么，使用的時(shí)間可能長些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時(shí)間，抗體的有效使用期就可能不會太長，五個(gè)月、六個(gè)月或者三個(gè)月。如果在有效的時(shí)間內(nèi)不能使用完。稍為超過一些時(shí)間還可以，如果時(shí)間過長，就應(yīng)當(dāng)丟棄，因?yàn)闀绊憳?biāo)記的質(zhì)量。有人抱怨，剛買的抗體標(biāo)記很好，后來就漸漸不好了。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，抗體的活性會逐漸失去生物活性，導(dǎo)致了標(biāo)記質(zhì)量的下降。（2）抗體的適應(yīng)癥。在眾多的抗體中，按它們的實(shí)際使用范圍，把它們分為兩個(gè)類：適合于冰凍切片，涂片，細(xì)胞培養(yǎng)片。適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細(xì)胞培養(yǎng)片。（3）選擇合適的單克隆或多克隆抗體

16、。抗體除了分為上述的兩個(gè)類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當(dāng)中，大部分都是單克隆抗體。這要?dú)w功于生物技術(shù)的不斷提高。在早些時(shí)候，應(yīng)用于臨床的抗體，大多數(shù)為多克隆抗體。多克隆抗體，在臨床應(yīng)用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。（4）抗體的加入。這看似很簡單的問題，如果處理不好也可導(dǎo)致不同的結(jié)果，如果應(yīng)用自動免疫組織化學(xué)染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問題：當(dāng)沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上存留過多,將會稀釋加入的抗體，影響加

17、入抗體的濃度，同時(shí)也將影響最后的結(jié)果，如假陰性等。加入的抗體以一滴為佳。當(dāng)擦干組織塊周邊多余的后，切片保持著一定的濕潤度，此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候，滴入抗體以一滴為好，加入后，輕微地?fù)u勻地覆蓋于切片上，使最后的結(jié)果穩(wěn)定均衡，不至于有的地方有反應(yīng)，有的地方無反應(yīng)。3加切片沒擦好將會影響加入抗體的質(zhì)量，切片沒沖洗干凈，沒擦試好，當(dāng)加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時(shí)你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個(gè)切片，便會使勁地加入抗體，此時(shí)的結(jié)果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒達(dá)到目的，還浪費(fèi)抗體，正確的做法就是徹底地用沖洗，摔干切片擦干切片周邊的，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。（5）選擇合適

18、的孵育時(shí)間。第一抗體的孵育時(shí)間，有較多的使用范圍，應(yīng)用于臨床檢測抗體的孵育時(shí)間。一般室溫下孵育在30-分6鐘0，12分0鐘，對于研究性質(zhì)的抗體孵育時(shí)間，也可按照上述的時(shí)間，但也有人提出于C冰箱中過夜孵育，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)一般不主張于C冰箱中過夜，原因是：長時(shí)間的孵育可以使一些非特異性的物質(zhì)沉淀下來，或者被吸附，造成背景的染色。目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強(qiáng)，不需要長時(shí)間的孵育，也能夠結(jié)合得很好。3長.時(shí)間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。4.長時(shí)間的孵育，不利于臨床病理報(bào)告的發(fā)出。十、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。免疫組化染色方法較多，如法，法和二步法等，如果

19、使用的是法，或者法，這時(shí)就必須要仔細(xì)地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進(jìn)行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人*抗體，連接抗體也要選擇相應(yīng)的免抗鼠，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔(dān)心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時(shí)間可在10分鐘，分鐘或者分鐘，一般在室溫中進(jìn)行，如果室溫低于0以下，則可在7的孵育箱中進(jìn)行。十一、復(fù)合物的使用及孵育時(shí)間的確定。各種方法有各自的復(fù)合物，如法，復(fù)合物是卵白素和生物素結(jié)合的復(fù)合物，再帶有

20、，法，（法）的復(fù)合物是鏈雪菌素蛋白復(fù)合物，再帶有，二步法的復(fù)合物則是二抗和三抗連接在一起的復(fù)合物，再帶上，除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有的酶，水解的底物一般為產(chǎn)生黃棕色，帶的酶，水解的底物一般為產(chǎn)生紅色。十二、的沖洗免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在的沖沖洗洗中度過，沖洗的正確與否，也是導(dǎo)致最后結(jié)果的關(guān)鍵。單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會。溫

21、柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將從上輕輕地沖洗，讓自上而下流下來，不要拿起切片將對準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導(dǎo)致切片的脫落。沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入，持續(xù)分鐘左右就完全足夠了。的和離子強(qiáng)度的使用和要求。劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（一）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)

22、度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解?？诿庖呓M化我們目前常用的的在濃度是，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格便宜配制方面，使用效果好。常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。下面將介紹有關(guān)方面的內(nèi)容：（1）緩沖液的配制TOC o 1-5 h z磷酸鹽緩沖液（）I液：貯存液（）取一個(gè)具的容量瓶，稱量倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足0放于冰箱保存，配制時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：在配制時(shí)，要先確定的用量，因?yàn)樵撛噭┯性S多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如含單個(gè)水分子時(shí)，配制時(shí)要稱取，而當(dāng)含有個(gè)水分子時(shí)，則需要稱取。配制時(shí)根據(jù)要求選取蒸餾水。因?yàn)檎麴s水有數(shù)種，單蒸餾