LC480Software1.5中文說明書(簡易版)

1、LightCycler480 Software 軟件操作（中文版）第一部分基本界面及圖標概述：DlldhB&t 悔 COHVVHl n AtUdiUlHliwlMHiMiiL 始*。Liritlur q Iuhiii I Hot LuahkiidlIOverview 界面M廠LightCycler?480 Software release 1.5,0VttHM 1 5電特Exit:關閉LC480軟件Log off:從目前使用的數(shù)據(jù)庫中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫Overview：點擊該圖標進入“ Overview”界面Navigator：點擊該圖標進入“ Navigator”界面，可進行數(shù)據(jù)的導入

2、導出等操作，詳 見。OOOOOSave點擊該圖標進行保存Export:：導出當前打開的文件Close關閉當前打開的文件Print：打印當前打開的窗口Tools：打開“Tools”界面，可進行密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設置，查看 數(shù)據(jù)庫狀態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作Help：查看軟件版本，操作說明書等、New Experiment 界面Aaatyss arndeFIzg f&tBfl Ucll器 MF* ifcloi14s WsWfl，* 1U IMi:QvalUfariiWSrllHpte ftflKISAi 孫， l i.己即胃Hienf-Setop9WlWIJlilJB r Fili

3、alWireB0mt |Hww F |Mirlrn#MRn防 L1 ec74-BO 2iuf t viiEB- Etleg值 I. Si- D髭0。/ irweiruilHFil: Vmi ml I 國唱 i N1*d理 Cwumljr1 田如上 SitsCuloirnjqraim IN % 口 W WlntlfKh1MllH：rQAcqvifllHiH tliK1 amprwlir4 I arycfsHlikldl Ihhanrnsai Ramp Halt J AzcfUEihor-is ijhiit5，slJRtWkMI Vohxt -I5懵TratilkiCeS-ampleEditorR

4、un Module：編輯、運行或查看 PCR序及查看PCR實時數(shù)據(jù)Subset Editor點擊該模塊后可進行子集的編輯Sample Editor：點擊后進行樣品信息的編輯Analysis Module:點擊進行結果分析或查看已保存的分析結果Report Module :選擇需要的內容以報告的形式給出結果Summary Module :查看實驗的總體概況，包括實驗名稱，所用的程序，檢測模 式，濾光片組合等。概況的內容由系統(tǒng)自動生成Navigator 界面Import:導入一個文件 Export:導出一個文件Batch Import:導入一批數(shù)據(jù)Batch Export：導出一批數(shù)據(jù)New：新建

5、一個實驗或文件夾New Folder：新建一個文件夾Open：打開一個文件Rename：重命名Delete：刪除選中的目標Copy:拷貝選中的目標| NvwHHMDlMlNote：所有上述圖標在深藍色時為激活狀態(tài)，灰色時為滅活狀態(tài)也就是不可用狀態(tài) 各圖標的功能在不同狀態(tài)下以顏色來區(qū)分是否具備。軟件操作.打開軟件打開電腦，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator,密碼為LC480(區(qū)分大小 寫)，電腦操作系統(tǒng)啟動完畢，檢查電腦右下角是否有它圖標。如果沒有，點擊桌面“Exor4 for XDMS_R快捷方式文件。然后右鍵點擊 目圖標，左鍵點擊“ Show” 一欄, 如最后一句話顯示“ Ex

6、or 4 server is running表示數(shù)據(jù)庫加載成功。如果顯示“ Exor 4 failed to start”則表示數(shù)據(jù)庫沒有加載上，關閉該窗口，右鍵點擊 奇圖標，選 “Shutdown” 一欄，退出數(shù)據(jù)庫，重新點擊桌面“ Exor4 for XDMS_T文件，加載數(shù)據(jù) 庫。然后點擊桌面“ LightCycler480 Software快捷方式文件，運行該軟件。輸入用戶名和密碼。用戶名默認為 admin (管理者權限)，密碼為LightCycler480 (區(qū)分 大小寫)或Masters如用戶已經建立新用戶名，則可以按照新用戶名登錄。二.用戶管理為了實驗結果的有效管理，可以建立不同

7、級別的用戶。如：標準用戶(Standard User)、專業(yè)用戶(Expert User)、管理者(Local Administrator)。一般實驗室建議建立專業(yè)用戶(Expert Usei)用戶名，然后以該用戶名 登錄軟件進行實驗操作。建立新用戶操作：打開LightCycler480操作軟件，點擊右側按鈕打開“Tools”工 具欄，選擇“ User Access/Users and Groups選項。在右邊窗口中點擊“ New User”鍵， 在右邊 “Enter the users full name” 一欄中填寫用戶的全名，在 Enter the name the user wants

8、 to log in as一欄填寫用戶登錄名，在 “ Enter the users password 一欄中輸入 密碼(密碼須含有6個以上字母，1個以上數(shù)字，其中有至少一個字母大寫)，在Tools”工具欄中的“Confirm the password 一欄中重新輸入一次密碼，加以確認，在“ Select the user role” 一欄中選擇用戶級別，然后點擊右下方“Close按鈕加以確認。System Settings界面中可以設置各用戶級的權限, 以及密碼的時效三.儀器自檢每次開機時，儀器會自動進行初始化自檢程序。自檢通過，儀器左側指示燈變綠 如放置了樣本，儀器右側指示燈變綠。在自檢時

9、，不能放置反應板，否則自檢無法通 過。四.建立實驗程序、Haw EKEierimerit打開LightCycler480操作軟件，成功登錄后點擊 -按鈕，進入New Experiment/Run Protocol 程序設置界面。在 “ Detection Format” 一欄中選擇所使用的熒光檢測技術，可選擇各類探針和染料，如常見的SYBR Green染料、Mono ColorHydrolysis Probe單色 TaqMan 水解探針、Multi Color Hydrolysis Probe 多色 TaqMan 水解探- SeUip針。吧吧里)按鈕選擇用戶所采用的熒光檢測通道,Reactio

10、n Volume 23在進行多色熒光PCR實驗時，須點擊 點擊確認?？?一欄中填寫反應體積。Doti9 cticm Format | Mijlt iColorHydro LysisPFcbi 卜|在“Programs”界面中設置實驗程序：在“ Program Name”下方命名程序，“ Cycles 一 欄內填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“ Analysis Mode” 一欄選擇該程序的分析模式。定量分析 選才? Quantification”，溶解曲線分析選擇 “Melting Curves ,顏色補償實驗選擇“ Color Compensation。而后在“Temperature Targets”

11、界面內設置所指定程序的內容，在“ Target(C)”處 填寫目標溫度，“Acquisition Mode”處選擇信號采集方式，“ Hold”一欄填寫該溫度所持 續(xù)的時間，“ Ramp Rate(C/s)”處填寫升降溫速率(注：如目標溫度為50c以下時，為了減少硬件的損耗，必須將降溫速率調至C /s以下)o如一個程序有多個步驟，則在 Temperature Targets界面的左側處點擊增加步驟；也可點擊上下箭頭 0N 一調整 各步驟的先后順序。如一個實驗中有多個程序，也可在“Programs”界面左側點擊，增加程序，也可點擊上下箭頭調整各程序的先后順序。實驗程度設置完成后，在下方“ Over

12、view”界面內會自動生成溫度隨時間變化的溫 控曲線，以及估計的運行時間，綠色點表示采集熒光信號的溫度和時間點?？梢砸勒赵?圖檢查一下程度設置是否正確。Itwlmmeni: Vlnudl LlghtCder 4凰1 圖 號泮型而 II； Mol QinnedEtllHun riciliieullroior Com| II)Wind *?!| Mm FMp創(chuàng) 1所81tmRun NulrB：Ddlubdse:Cowipudtr 斜史跑 a心JSwm AdminiPlate ID1牌0才,wlHtsivl0，時瑜；Sly I.Eie 朝M* 卜I n 1m力設置亞組可以在一塊反應板上實現(xiàn)多個檢測項

13、目的實驗，前提是這些檢測項目的實驗運 行程序都一致（這在使用TaqMan水解探針時比較容易實現(xiàn)），由于各檢測項目均有各 自的質控對照，因而，設定亞組可以單獨對各檢測項目進行分析。按鈕設置樣本信息。在Workflow” 一欄在選擇2 .樣本屬性編輯點擊New Experiment界面左側實驗方案：Abs Quant：絕對定量或定性分析；Rel Quant相對定量；Scanning基因掃描;Color Comp：顏色補償；Tm：熔解溫度檢測；Melt Geno：熔解曲線法基因分型;Endpt Geno：終點法基因分型。-Step 1: Select Workflowr Abs Quant Rel

14、Ouant Scanning - Color CompC Tm- Melt Geno C Endpt Geno在Select Samples/Subse選項中選定待編輯的樣本亞組:-Step 2: Select SamplesSubset: HEV samples 在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等:Pos：樣本在96孔板或384孔板上的座標位置；Repl Of:重復樣本設置；Sample Name 樣本名稱； Quantification Sample Type 定量樣本類型； Concentration： 度；Target Name：檢測類型。-Selectill.F 483533sr Co

15、mbinellUllSMDSF 558-610nils |Z -Jk.PosColorRepl OfSample NameQuantificationSample TypeConcentrationTarget NameAlSTDlStandard1.00E2HBVA2STDZStandard1,00E3KE咪BlzSTD3Standard1.00E4HBVE2二STD 4Standard1.00E5HBVClNCM克gative Cont匚01HB7C2PositivePositive ControlHBVDiDi5ampLeiUnknownHBVD2口DlS amp Le 1Unkncun

16、HBV:EiElSajnpVnknavnHB712ELSampLe2UnkncunKBVFlFLUnknownHBVT2FlSampLe3UnknownHBVG1JG1SampledTJnlcnawnHB7G2GLSajpUritenosmHBVHl二HlSampledTJnknownHBFH2HLSamp le5Uft.tencwnHB7在進行絕對定量檢測實驗時，參與實驗的樣本有標準品（一般 4至5個）、陰性對 照、陽性對照、未知樣本。各樣本的名稱可參考以上“Sample Nam4中的命名習慣（STD表示標準品、NC表示陰性對照、Positive表示陽性對照、Sample表示待檢測的未 知樣

17、本），也可以自行編輯。在“ Quantfication Sample Typ3 一欄內需要對各樣本的類型進行明確地編輯（標準 品選Standard類型、陰性對照選 Negative Control類型、陽性對照選 Positive Control類 型、未知樣本選Unknown類型），此外標準品系已知濃度的陽性樣本，其設定為 Standard類型后還需在Concentration 一欄中對各標準品分別設定其相應的濃度，以及在 Abs Quant/Units填寫框中填寫相應的濃度單位，如 copies、pg等。在Target Name一欄中可以填寫該檢測實驗所要檢測的指標，如乙肝病毒、禽流感病

18、毒、 沙門氏菌等。如在實驗中需要設置重復樣本的，可在 Repl Of 一欄中填寫該樣本其所重復的樣本的 座標號（注意，只能填寫座標號，不能填寫樣本名）。如進行的是多色熒光PCR僉測實驗，則在Select Filter Combinations一欄中選定各檢 測通道，分別進行樣本編輯。相應較簡單，可參考以下設置-Select Filter Combitkaiions-F 48333 F 556-610rAbs Quant-在進行定性檢測實驗時，參與實驗的樣本有陰性對照、陽性對照、未知樣本。設置PosColorRepl OfSample NameQ uantification Sample Typ

19、eCon centra-tionTarget MameAlSampLe1UnknownaivA2SaKipleZUnknown丸ElSannp Le3UnknownaivSainpLetUnknownklVClSampLe5UatencwiiAIVC2S ainp Le 6UnknownAIVMZBSamp Le7UnknownilV12SampleaUnknownkTVElSainple7UnknownkTVE2SampL&8UnknownAIVFl3cgpUnknownALVT2Sainp LeiOUnknownaivG1S ainp LellUnknownAIVG2aSairip Lel

20、2nhrtcwnAIVHl口+Positive ControlAIVH2ZB一Megat ive Cont士才AI7Units六.運行實驗實驗程序和樣本均設置完畢后，即可運行實驗，具體操作：進入“ NewExperiment”界面，點擊左側安鈕，如反應板已經放入儀器，儀器主機正面右側的LED燈會由桔黃色變?yōu)榫G色，軟件界面右下邊的這時點擊“Start Run”按鈕，軟件界面跳出一對話框提示用戶給該實驗文件命名，以保存實驗結果。一般建設用戶以時間命名， 以方便日后查找實驗結果，如-HBV-1, -AIV-2等。命名后點擊確認鍵，儀器就開始運行 了，在運行過程中可觀察到溫度和熒光信號的變化曲線。如進

21、行多重熒光PCR驗，可在熒光歷史“Fluorescence History/界面內上的下拉菜單中切換不同的檢測通道，以分別 觀察其擴增情況。在實驗運行過程中，用戶可以根據(jù)需要，點擊“+10 Cycles按鈕增加正在運行的程序10個循環(huán)，也可以點擊“End Program”按鈕終止正在運行的子程序，直接進入下一 個子程序。七.數(shù)據(jù)分析（定性和定量）實驗運行完畢后，點擊界面左側的按鈕分析數(shù)據(jù)。或者打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側II已完成的實驗文件，點擊下方L圖標,Open”進入Navigator導航界面，在目錄樹內選定之前 按鈕，或雙擊文件名打開實驗文件，點擊左側Arid

22、lysis按鈕，進入分析界面。在“Create new analysis窗口內顯示了可使用的分析方法，在“ Open existing analysis窗口內顯示已經進行分析的結果內容。要進行定性和定量分析可以選擇 Abs Quant分析功能，具有兩種分析模式，2ndDerivative Max二階最大求導法和Fit Points點擬合法。選定分析功能類型后會跳出對話 框，用戶可以自行選擇分析類型、選擇要分析的亞組（Subset）,以及命名分析結果（Name）。點擊按鈕確認。在 Analysis界面中選擇 Abs Quant/2nd Derivative Max,點擊 “Calculate”

23、按鈕，生成方法在反應體系優(yōu)化得比較成熟，信號噪音比較低時使用較好MhHom I Dr m& Ah fluspi wish SYPR finrnvi IOI-晶田町址 u u-stt iDid Dexiv at ive Beu.nrrrrrrrrrn rrrrrrrrl rr;nrrnmrrrri-lrrr1 I rrn|Jtzfresults OtfiEilwRypllLAtB 5MWUu里qh4DQ 電*.*； 1sm a # Sr*4idrd13 241142413割1 工西I二 T EH-GqE-K* WCftiSrty 中白即UHD”keit.慎 OCTOlint MBIB j -m

24、1-GaCp值，如實驗中有標準品，則同時生成標準曲線，并且計算出各未知樣本的濃度值。該有時從原始熒光曲線能觀察到有個別樣本的曲線不正常，信號噪音比較高，則可選 用Fit Points點擬合法加以人工調整。具體操作如下：在 Analysis界面中選擇 Abs Quant/Fit Points,在 “Cycle Rang+First Cycle和 Last Cycle兩欄分別設置分析數(shù)據(jù)的起始和終止循環(huán)數(shù)。選定具體數(shù)據(jù)后，軟件只分析該區(qū)間 內的實驗曲線。“ Background一欄設置熒光信號本底的區(qū)域，一般將熒光值呈S形曲線增長前趨于水平的循環(huán)區(qū)域作為背景本底區(qū)。點擊“Noise Band按鈕，

25、上下移動紅色的噪音本底線來消除個別樣本由于信號噪音較高而對結果造成的影響。般將紅線置于盡可能低，但又要足以蓋過陰性線和曲線不-lojx平的噪音線，與熒光信號曲線交于線性增長區(qū)。軟件只分析紅色噪音本底線上方的曲線 數(shù)據(jù)，所以要確保其上方無曲折不平的噪音信號。 LhjilCY0ur74eHSL4lMTt：Ek*i： LL,D&aita6w 耽 Copnpirter (Tf ceWirlfl &wt InmD Ahi viih YTIR ISiihivt:rr.Circle 14,電電AhdlWYrHAmpI VicaUofl Cumfi& a ID 12 I* IESTI? rinluplierH

26、oiie Barird西。1話Bm4H 01Uter： 學網erti MimiiFI Irin Oirgrd Cunw “ riiftl ill l i ll| 進n ju-sii-t it Point a圜因rr-JhFELrrrrFrrrrFTTTTTFFFrrrrLUIrr rrr且d-延BTCSV.ltap，叫SlMdaidlRe|pllcdE& tuGlutfEMApply點擊“Analysis按鈕，再點擊“ Threshold”按鈕，使用顯示“ Auto”字樣，然后點擊下方，Calcuil 日加）按鈕，生成各樣本的CP值O若是定量分析，則會生成各標準曲線,以及各樣本的濃度值。.網*

27、IlWumcnl： Vlrliiil liqhKyclv 我中就眉N別 CflMgEedWiild-aw： |口5日 AM Q|airi 喇iih SVPR Cpkhu IE 即 Efi*An j lyius | ifc b Su-sujt .|! Fit Pp mt s趨旺 W Cflunpirtier (TrscfliinlCMiriaOtinBublerfc |u ii Elgmn1山上iggg!SubadHUhULHSjtHkpk Editor1十十十十十LLL_ i -rrr rrramPhsdIive Mcgalive fl 號 iawddMS.n甲I前.MaineIOAmplif

28、HaliQviii CurvKCycle &i型Uund !/|皿白蚪春3皿工1。1 JL1 方1皿1。1 SL1 S 1 Al箏柏而I* -MR麻咻*| LancBhnatioinM-ar lb 0215Effidano 19B? ： nJ!Ilr -lhk 01c30M：ilhuK一士-RuiMkiin 國前XI存界酩由,巾Q寫TO msM-TV jT tinplateLm CiCwantEHieSrd Cwrw4EISBlBCt) ,川 II點擊軟件右側的 置。圖標，將分析結果保存入實驗文件，或在目錄樹中另找保存位在進行多色熒光PCR實驗時，同時使用相鄰兩個檢測通道進行檢測需要通過顏色補

29、 償功能來校正相鄰通道的熒光信號干擾，詳見顏色補償一章。八.報告生成(nupur 打開一個分析完結果的文件，或者剛分析完結果并貯存后，點擊左側工具欄中按鈕，進入結果報告的界面。可在“ General”和“ Detailed”兩欄中選擇實驗報告所要包 含的內容。“ General” 一欄中顯示的選項為本次實驗結果均需要顯示的報告參數(shù)；“Detailed” 一欄則顯示本次實驗多次分析中所要的報告參數(shù)的明細。點擊“Generate”按鈕，生成報告預覽。點擊右上方“ PDF按鈕可將報告保存為*.pdf文件。報告顯示所包括的內容可以保存成模板文件，同類報告要求的實驗可以調用相同的 言;。t SwB 瓜！

30、報告模板。在“ General”和“ Detailed”兩欄中選定了內容后點擊下方 訂叫舊禰按鈕右側的下拉箭頭，點擊“ Save As Template將其保存至Templates/Report Templates目錄 下，點擊“V”按鈕確認。調用報告模板時點擊“Apply Template”按鈕，選定模板文件，點擊”按鈕確認。九.數(shù)據(jù)導由與導入該軟件所產生的實驗數(shù)據(jù)均保存在其自帶的數(shù)據(jù)庫中，從Windows操作系統(tǒng)中無法找到其實驗數(shù)據(jù)的文件。這樣可以很好地保護實驗文件不被誤刪和竊取。如用戶希望將 實驗結果備份保存，可以將數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫中導出生成可見的文件，保存于其它電腦中或 本電腦的其它目錄下

31、。同時，也可以將實驗文件導入數(shù)據(jù)庫查看文件內容或對文件進行 分析。導出單個實驗文件的方法：打開 LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側圖標，進 入Navigator導航界面，在目錄樹內選定實驗文件，點擊下方 一上吧一按鈕，選擇保 存文件的目錄位置，點擊“ Save按鈕將文件導出。導出整個文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側望.圖標，進入Navigator導航界面，在目錄樹內選定要導出文件所在的文件夾，點擊I 斌昂以即按鈕,在“Select FolderS 欄中選定保存預導出文件的目錄，點擊 歷)按 鈕，將所要導出的文件目錄均選至右側對話

32、框，點擊 眄*初進入“Target”界面，點 擊“Browse”按鈕選定導出的文件所要存放的目錄，點擊“ Next”按鈕進入“ Options” 界面，去除不需要導出的文件前的“，”，用戶也可設定導出文件的限制。點擊“Next”按鈕，進入“ Start”界面，點擊“ Next”按鈕，軟件顯示文件導出的過程和狀 態(tài)，完成后進入“ Done”界面，顯示導出文件的報告。點擊“ Done”按鈕確認。導入單個文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側1”夕，圖標， 進入Navigator導航界面，在目錄樹內選定實驗文件，點擊下方“ Import”按鈕，選定所 要導入的文件，點擊

33、“ Open”按鈕，即導入該文件。導入整個文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側圖標，進入Navigator導航界面，在目錄樹內選定實驗文件，點擊下方“ BatchImport”按鈕，進入“ Source”界面，點擊“ Add”按鈕選定待導入的文件所在的文件 夾，點擊“ Next”按鈕，進入“ Target”界面，選定放置導入文件的文件夾，點擊“Next”按鈕進入Start”界面，點擊“Next”按鈕，進入“ Status”界面，開始導入文 件，最后進入“ Done”界面，生成導入文件報告，點擊“ Done”確認。十.單點定標同一種同一批號的試劑盒以相

34、同的反應程序進行多輪定量檢測實驗時，無須每次都 做四至五個標準品來作標準曲線。第一輪檢測實驗成功完成后，可以將該實驗產生的標 準曲線保存下來，下一輪檢測實驗時，只需選與第一輪實驗對應的一種濃度的標準品參 與實驗即可。在分析數(shù)據(jù)時可以調用第一輪的標準曲線進行定量。標準曲線的保存：使用四至五個標準品以及多個未知樣本進行檢測實驗后，分析數(shù) 據(jù)，最終得到數(shù)據(jù)結果后，點擊標準曲線下方“ Std Curve (In run)”右側下拉前頭&BVQ 匕I：, .flirltnujl.Sid OurviSpecial1、PCR擴增效率均為時進，PCR手冊規(guī)定，靶基S-dlhplEEd 忖。f,選中“Save

35、as externall選項。命名標準曲線，并將其保存于DataStd Curve文件夾下，點擊按鈕確認已有標準曲線的調用：在使用單點定標的檢測實驗中，所選用的一個標準品仍然定 義為“Standard”類型，并且其濃度在已有的標準曲線濃度范圍之內。在分析數(shù)據(jù)時，一 開始無標準曲線生成，點擊“ Standard Curve(In Run)按鈕右側下拉箭頭，選中“ Std Curve(external)”選項，雙擊所要調用的標準曲線文件，點擊“Calculate”按鈕，即可調用先前實驗中的標準曲線進行本次實驗的定量分析。注意：保存標準曲線文件時所采用的分析模式必須與調用標準曲線時的分析模式一 致才

36、能成功調用標準曲線。十一.相對定量實驗設計和分析進行相對定量實驗時要注意，一般而言，每個樣本均做三個重復，以得到標準誤的 數(shù)據(jù)，進行相對定量實驗時樣本編輯最關鍵，樣本編輯正確了，分析數(shù)據(jù)完全可以一鍵 完成。相似相對定量所謂相似相對定量是指默認看家基因和靶基因這兩對引物的 行的相對定量的算法，其主要是以 Cp值的差值來推算濃度的差異。因和看家基因這兩對引物的 PCRT增效率差異不超過的情況下，可進行相似相對定量計 算，看一下某基因mRNA水平表達量變化的趨勢，如果其擴增效率差異超過，則不能使 用相似相對定量算法(否則在很多期刊發(fā)文章時會被要求補實驗或重新做定量實驗)。 出現(xiàn)這種情況時，方法一：重

37、新設計引物，優(yōu)化反應體系，使擴增效率差異小于；方法 二：采用準確相對定量算法，見下第 2。進行相似相對定量時，可同時設定多個靶基因跟同一個看家基因進行比較。如下 圖：三個樣本，分別用一個看家基因 Reference Gene兩個不同靶基因Target A和TargetB進行相對定量。在建立了含有所有本次實驗中檢測樣本孔位的Subset后，點擊鈕，在Rel Quant相對定量界面內設置樣本信息。1! 03ColarUepl 01Sample NameCoimbined Sample mnd Target TypieCori cemtrati anl arge! blametHidencyJlIA

38、LSamp LeiHm 七 P 0 3C a LILti r atd reTerer.ce Gen=z_nn12il.LS：3mp Leikef PosCs1ihraterteterercfe Gena2.OQA3ALS-smplelRef PosCaLUaratcrPfiiereRce Gene203AlMSamplesRuf UnJmownM上已三口工0 Gene2：. 00A5Aigup LKRef UnSaiova夫之交u二匚心目 Cum之2,0DASMSzuup le2.Re. CTnkiLuircjReei-eiic：e Gen=2.03A7%Mn口 Le3FJ.eC UnFtno

39、wnReference Gen=2.05ASJft75 日mp Le3Rer oni-oiounel erer.ee Gen=才.口口ii.7Sp le3Ret 口nkqwirntefereirep Gene2, 口口A.1QV.-f gat2.口 AILA1CIJCRu Hanative=fercnac Gann2.00A12AIDNCRef lie gat IveeEEuec C-cn2,0331BLSsiuple.1Target PosCalitu-aiL口rT=ll get Gene, k2.01332EL3：=iinplelTargeL FosCallbraLorTaxaeL Gei

40、ie kz.ooBLS；=HipleTarget PoscalIbratorTarget Gene AB4H412TsirijPt UnkMirnTa-GpinF *BSB4Simp L*2Tftirget UnteneirnTarget Qma A.2.0IJ36B4S 而pL2Target UnknaunTarget Gene A2,033 7B7Saiapi Le37arget UnfcaotrnTarget Gene k2.03B6B7ScLiijpleSTarget UnkuiaunT-3J： get Gunu A2. OD35E7號曰口口 Le5Taraet Un或皿unTarge

41、t Gene 強2,00BIDBIDNCTargrtTarget Gene *Z .口口目1 1BLD所TAirQfPt NPrfSt ivs=TRT(J*t GPT1R aZ.OQBIONCTarget NegativTarget Gene k2.0JClCLS-anp Lei7ar get PoaCali.brQ.orTarget Gene B2.03C2CL臺1PliU3Tazrget PosCa 1 ibi:a*oizT-sr get Geiie. Ra.onC3CLS-amplelTarget PosCa1ibcatorTax get Gene B2. DIDClClLuE二口ut

42、Un-kciounT-mqcC Gunc B2.0UC5C43Mli pd 37Tairaei. unJcrwunTiir(jec Oene B OOC6S-amp lezlarger UnirnairnTarget Gene- B2 * DOC7c?SangWTarget UnJEavnT-argst Gen& B2. 0 jCBC7 zmp LsSTarget UaknaTrnTarget Cene B2.013C9c?Saivp Le2Target UaknairnTar get Gene. B2.00CIOCIONCTdrerc t Necrot ivcTm qet Gems B3.0

43、3C1LCIONCTaraet Ifca-at IveT-Muet Gene DZ.,00CIScirNCTraet工工veTar gee flene Bsa.ip 口在Repl of一欄中填寫其所要重復試驗的樣本的座標號，如在 A2和A3位進行A1位 樣本的兩次重復試驗，則在 A2和A3位的Repl of 一欄填寫A1即可。在Sample Name一欄填寫樣本名，注意，只要是加同一模板的反應孔位，均給其命 名為相同的樣本名。例如A1、B1、C1孔位，雖然是用不同的引物分別擴增不同的基 因，但所加的樣本模板是相同的，所以在 Sample Name一欄中填寫相同的樣本名，可以 用鍵盤“ Ctrl

44、+C復制Reference Gene的樣本名，然后用鍵盤“ Ctrl+V粘貼至Target Gene A和Target Gene B的樣本名中，以確保所命名一致。另外， 一定要設置陰性對照實 驗組，即其它反應體系均不變，只是不加 PCR模板的質控，一般命名為 NC或NTC (No Template Control)在Sample Type一欄中分別選擇各樣本的不同類型?？醇一虻臋z測孔位均選擇帶有 Reference的類型，靶基因的檢測孔位均選擇帶有 Target的類型，如上圖。其中將 Sample1的類型選為Calibrator即標準樣本，在相對定量計算時，其它樣本均與該標準樣 本進行比較，

45、以得到基因表達量更多或更少的數(shù)據(jù)。一般可以將實驗中的空白對照樣本 選為標準樣本，例如用不同的藥物 A、B、C處理一批細胞，其它有一批細胞是正常培養(yǎng)，沒有處理的，則沒有用藥物處理的細胞可設為標準樣本Calibrator,其它用藥組樣本均與該樣本進行比較。而這些處理組的樣本類型均可以選定為Unkown,檢測看家基因的孔位類型選為Reference Unknown,檢測靶基因的孔位類型選為 Target Unknown。陰性對 照樣本可根據(jù)其所用引物的不同選定類型為Reference Negative和Target Negative在Target Name一欄中填寫檢測的基因名，如以 B-actin

46、作為看家基因的話，在所有 看家基因樣本的Target Name一欄均填寫B(tài)-actin；而靶基因以此類推，如上圖。Efficiency認為。將以上樣本編輯完成后，設置 PCRS應程序，即可運行儀器，進 行實驗。由ml時（實驗結束后，可點擊左側的I一口按鈕，進入分析界面，選擇 Relative Quantification 分析數(shù)據(jù)，點擊 8曲J按鈕即可生成相對定量的數(shù)據(jù)。注意，如果陰性對照Negative樣本產生了擴增曲線，軟件會判定該實驗失敗，采用 SYBR Green進行實驗時，由于不可避免地產生一些非特異擴增和引物二聚體現(xiàn)象，往往 會導致軟件無法計算出結果，這個時候可以將陰性對照樣本的類

47、型改為Target Unknown或Reference Unkown來看一下實驗的分析結果。但出現(xiàn)陰性對照樣本產生陽性擴增曲線 的現(xiàn)象時，一定要進行Tm Calling分析，看一下熔解曲線峰，以進一步分析所造成的原 因。如果其熔解曲線與PCR目標擴增產物峰的Tm值一致，即試劑被陽性PCRT增片段 污染，所得定量結果不準確，要解決該污染問題后重新進行實驗；如果陰性樣本的熔解 曲線峰與PCR目標擴增產物峰的Tm值不一致，則有可能是引物二聚體或非特異擴增產 物的原因，其同樣影響定量結果，要想辦法優(yōu)化實驗排除其影響。另外，如果Calibrator標準樣本的看家基因和靶基因無擴增的話，也會導致軟件無法

48、計算出結果。2、準確相對定量所謂準確相對定量是指采用PCRT增效率校正的相對定量算法，其將看家基因和靶 基因的PCRT增效率的具體值計算出來后參與至定量計算中去，因而其結果更能夠體現(xiàn) 實際的情況。其設置大致與相似相對定量相同，只是樣本類型處多了標準品，如下：PdsColorRepl OfSample NameCombined Sani|jle aod Target TypeCancentratiDiiiTarejel NameAlAlSainplelRe土 PosC&l;bratorReference Gene*Alf anpl&lRe PosCal ibuatoi:Reference Gen

49、eA311jamplelRef PosCalikraLarReference GeneA4Ret LrnKnonfceterence (ieneAz.A4jamplEiRef UnknownReference Gene1614f amplerRe UnknownReference GeneA717ample ；iRef JnKnownFefe rente CieneABA7aampiejher LTnKnown:ererence GeneA73城口 pl已3Rer ijuKnDumReterence Gene111 A1Q5 TilRei 3%日口Emel.ODLQBeierence Gene

50、111A105TT1Rc 3 dial id aid1.0DEQRu工cuim Gene上1A103TD1LRef 2JLajjduldi.oocaEefeteliiE Gclik1 Bi.BlSTT2Ref Strand3Li:d1.OOElRefezencc GeneBEBl5TD3Ref Standard1,ODE1Bcfcecncc GcncB3DI5TT2Ref Standard1.ODE1Reference GurrB4B4STI3Ref Standard1.ODE3Referense GeneGEB4STD3Ref fEandmrdl1.OOE3Peference GeneB6B45TD3Ref St andard1.ODE3E7B7STIj4Standard1.ODE4PfifGstn&EBB7STI4P.ef Standar