基因工程抗體片段

1、關(guān)于基因工程抗體片段第一張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因工程抗體片段之前奏曲小分子抗體第二張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一代小分子抗體抗原結(jié)合片段( fragment with antigen binding，F(xiàn)ab) 和重組FabFab 片段由完整輕鏈和重鏈的VH + CH1構(gòu)成，其大小為完整抗體的1/3,約55KD；重組Fab 是將輕、重鏈可變區(qū)分別與人抗體的 鏈和重鏈CH1重組；第三張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 Fab 基因工程構(gòu)建方法及其性能通常是保留鼠源性的CDR區(qū), 其余換成人源化,通過(guò)大腸桿菌以分泌表達(dá)的方式表達(dá)L鏈和Fd鏈, 二者能在細(xì)

2、菌的外周質(zhì)腔中折疊成具有一定構(gòu)象的Fab；該Fab具有抗體的活性。因?yàn)槠洳缓蠪c段、分子量小、結(jié)合力高、抗原性低, 故在腫瘤治療上有其優(yōu)越性。目前已有多個(gè)片段藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市. 第四張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Fab的臨床應(yīng)用1）阿昔單抗( abciximab，ReoPro) 1994 年12 月FDA 批準(zhǔn)的第一個(gè)重組Fab 片段，該產(chǎn)品以血小板糖蛋白b /a 為靶點(diǎn)，用以防止血小板聚集及血栓形成，作為冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管插術(shù)時(shí)預(yù)防心肌缺血的輔助用藥，取得了巨大的成功；2）蘭尼單抗( lucentis)：治療黃斑變性， 2006 年獲得FDA 的批準(zhǔn)。3）賽妥珠單抗( cimz

3、ia)：克羅恩病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，2008 年獲得FDA 的批準(zhǔn)。在臨床研究中，F(xiàn)ab 占據(jù)了臨床研發(fā)抗體片段的大多數(shù)( 30 /54 種) 。第五張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二代小分子抗體單鏈抗體( single chain Fv，ScFv)ScFv指在重鏈V區(qū)cDNA5端與輕鏈V區(qū)cDNA5端之間用一寡聚核甘酸連接, 在大腸桿菌中表達(dá)成一單鏈多肽, 并在細(xì)菌體內(nèi)折疊成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的一種新型的抗體, 大小僅為完整Ig的1/6(約28KD);是含有完整抗原結(jié)合部位的最小抗體片段；第六張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ScFV的功能1）用于治療：可進(jìn)人一般抗體不

4、能達(dá)到的部位, 如蛋白偶聯(lián)受體、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；2）多肽接頭可設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)：多肽接頭是單鏈抗體的獨(dú)特組成,可設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)：如金屬贅合、連接毒素或藥物等, 用于影像和臨床治療；第七張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三代小分子抗體納米抗體和分子識(shí)別單位( molecular recognition unit，MRU)1. 納米抗體主要指僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體( VHH)，其體積約為完整抗體的1 /10，故稱為納米抗體；第八張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月納米抗體的來(lái)源1993 年Hamers 等偶然發(fā)現(xiàn)駱駝體內(nèi)存在一種僅具有重鏈的

5、抗體，被稱為重鏈抗體( heavy-chain antibodies，HCAbs) 。此后，在一些軟骨魚，如護(hù)士鯊體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)類似駱駝重鏈抗體結(jié)構(gòu)的新抗原受體( new antigen receptor，NAR) 。這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)VHH( variable domainof the heavy chain of HCAbs，VHH) 單結(jié)構(gòu)域形成，盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力；克隆這種抗體重鏈的可變區(qū)，構(gòu)建僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體( VHH)。第九張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月納米抗體

6、單域的性質(zhì)1）有高度水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性：盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。并且由于在框架FR2 區(qū)存在一些不同于常規(guī)抗體的親水性氨基酸，使得VHH 抗體在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性。在苛刻的條件中，如胃液和內(nèi)臟中仍能保持抗原結(jié)合活性，為口服治療胃腸道功能紊亂性疾病提供新的思路；第十一張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）納米抗體能識(shí)別獨(dú)特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互補(bǔ)結(jié)合區(qū)( CDR) 以及更高的組織穿透性和更小的分子，VHH抗體可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無(wú)法接近的抗原表位?？蛇M(jìn)入酶的活性部位及細(xì)菌或病毒表面受體裂縫中，可以利用其模擬藥物來(lái)設(shè)計(jì)小分子酶的抑制劑、受體的激動(dòng)

7、劑或拮抗劑等；3）能有效地穿過(guò)血腦屏障：有望成為治療神經(jīng)性疾病和腦腫瘤的新藥第十二張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月VHH穩(wěn)定的機(jī)制傳統(tǒng)抗體的VH 和VL 區(qū)通過(guò)疏水作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而重鏈抗體則通過(guò)選擇性突變VHH 胚系基因中幾個(gè)功能位點(diǎn)，使其形成較高的親水性表面，可在缺失VL 條件下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；第十三張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月VHH 胚系基因序列特性1）對(duì)駱駝VHH 胚系基因序列分析發(fā)現(xiàn)，VHH 與人源VH 基因家族序列具有較高的同源性；第十五張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）比較人類和駱駝IgG 重鏈可

8、變區(qū)發(fā)現(xiàn)，在框架FR2 區(qū)的氨基酸組成中，有4 個(gè)氨基酸顯著不同。這4 個(gè)氨基酸在VH 和VHH 中分別是V42F 或V42Y，G49E，L50R 和W52G，第十六張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用這一特點(diǎn), 可以對(duì)人源抗體VH 結(jié)構(gòu)域FR2 中的一些氨基酸進(jìn)行VHH特征性改造, 所得到的駱駝化單域VH 抗體不僅保持原有的抗體的特異性和親和力, 而且溶解性好、穩(wěn)定性好。第十七張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 分子識(shí)別單位( molecular recognition unit，MRU)MRU 是由單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)組成的小分子抗體片段，約為完整抗體分子的1/80 1 /

9、70。 MRU 也具有與抗原結(jié)合的能力，且由于其穿透力強(qiáng)、半衰期短、顯像時(shí)本底低，在臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用前景。第十八張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因工程抗體片段之進(jìn)行曲抗體片段的改造和改型第十九張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月通過(guò)對(duì)小分子抗體基因的改造和修飾，改善其親和力、免疫原性及效應(yīng)，構(gòu)建出多種基因工程抗體片段.目前已有54 種基因工程抗體片段進(jìn)入臨床研究，其中30 種源自Fab ( 56%) 、19 種源自ScFv( 35%) 、5 種源自第三代小分子抗體( 9%)第二十張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.雙鏈抗體Diabody第二十一張，PPT共四

10、十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月設(shè)計(jì)背景由于單價(jià)抗體片段(如ScFv、Fab)與靶抗原作用后保留時(shí)間短且解離速度快, 所以在實(shí)際應(yīng)用中有必要設(shè)計(jì)多價(jià)抗體分子, 這種多價(jià)分子可顯示出與抗原更加強(qiáng)的親和力和慢的解離速度；第二十二張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Fab和ScFv片段能夠通過(guò)化學(xué)的或基因工程linker構(gòu)成二聚體、三聚體或四聚體。例如Fab就被用化學(xué)連成二價(jià)或三價(jià)的多聚體, 實(shí)驗(yàn)表明其與抗原的保持性有所提高；第二十三張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月最成功的設(shè)計(jì)縮短Linker二價(jià)雙鏈抗體ScFV05個(gè)氨基酸第二十五張，P

11、PT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.雙特異性抗體( bispecific antibody，BsAb)第二十六張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞上的特異性抗原另一個(gè)結(jié)合淋巴細(xì)胞或吞噬細(xì)胞等效應(yīng)物雙特異性抗體的2個(gè)抗原結(jié)合部位兩條抗原結(jié)合臂可分別來(lái)自FV段、Fab段、ScFV或dsFv導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞靶向殺滅腫瘤細(xì)胞有二價(jià)、四價(jià)、六價(jià)第二十七張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙特異抗體的設(shè)計(jì)和運(yùn)用化學(xué)交聯(lián)：分別分離純化兩種親本單抗，采用還原劑使其解鏈，獲得單價(jià)抗體，再

12、采用異雙功能交聯(lián)劑，把兩種具有不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)起來(lái)；細(xì)胞工程：采用細(xì)胞融合的方法，將分泌單抗的雜交瘤與經(jīng)免疫的脾細(xì)胞結(jié)合，或者使兩種分泌不同單抗的雜交瘤細(xì)胞融合；基因工程：多采用抗體分子片段，F(xiàn)ab、ScFV等經(jīng)過(guò)基因操作修飾后，通過(guò)體外組裝成BsAb或者直接表達(dá)分泌型的BsAb第三十張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A majority of both bispecific diabodies and bis-scFv are designed to bind to the CD3 T-cell coreceptor and thereby recruit cyt

13、otoxic T-cells (CTLs) to the tumor site. 第三十一張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙特異抗體的臨床優(yōu)勢(shì)1）靶向性好：用高價(jià)BsAb 靶向目標(biāo)抗原可使藥物選擇性地結(jié)合到高抗原密度的腫瘤組織區(qū)，正常組織抗原密度低于BsAb 的結(jié)合域值，因而BsAb極少滲透入正常組織，從而提高了BsAb 的靶向性；。實(shí)例：Lu 等設(shè)計(jì)了3 價(jià)抗ErbB2 /CD16 的BsAb，它包括2 個(gè)結(jié)合ErbB2 的ScFv 形式結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)定位于NK 細(xì)胞的單價(jià)Fab 片段位點(diǎn)；第三十二張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）是一種有效的抗腫瘤策略：Michael

14、son 等將抗LTR 的ScFv 片段融合于抗TRAIL-R2 單抗的重鏈端，設(shè)計(jì)了以TNF家族膜受體TRAIL-R2 和LTR 為靶點(diǎn)的IgG 樣BsAb。該抗體血漿半衰期長(zhǎng)，體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在小鼠腫瘤移植模型中較之親本抗體能更顯著地減小腫瘤體積；第三十三張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3）具有更強(qiáng)的殺傷淋巴瘤細(xì)胞的功效，且對(duì)同體正常B 細(xì)胞的作用較弱：Rossi 等報(bào)道了一對(duì)來(lái)自抗CD20 IgG1)和依帕珠單抗( epratuzumab ) 的人源化6 價(jià)抗CD20 /22 的BsAb20-22 和22-20。它們無(wú)需第二抗體交聯(lián)即可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增

15、殖抑制第三十四張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.小分子抗體與其他分子連接成融合物第三十五張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與毒素的連接將抗體片段與細(xì)菌或植物毒素連接, 使其具有特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞的功能, 并利用毒素來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞；如Di Paolo等曾將人源化的抗Ep一CAM的單鏈抗體4D5MOCB與綠膿假單胞外毒素A融合, 發(fā)現(xiàn)其優(yōu)先定位在Ep一CAM陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞, 并能抑制多種腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng), 顯示了良好的應(yīng)用前景。第三十六張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與細(xì)胞因子連接將抗體片段與IL-2、 IL-12或GM一CSF等免疫刺激因子結(jié)合成融合蛋白后,

16、能刺激細(xì)胞增殖, 能促使自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生溶瘤細(xì)胞作用;第三十七張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月其他形式的免疫結(jié)合物1）放射性標(biāo)記的抗體片段：，通過(guò)抗體特異性的識(shí)別作用使放射性物質(zhì)有效地導(dǎo)向腫瘤組織局部，用于放射免疫治療;2）抗體-化療藥物結(jié)合物：通過(guò)化學(xué)方法使抗體和化療藥物的某些基團(tuán)偶聯(lián)，在特異的作用位點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用進(jìn)行免疫化療;第三十八張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3）抗體-酶連接物：利用抗體導(dǎo)向作用，將催化前體藥物的酶攜帶至腫瘤局部，待血液循環(huán)及正常組織中非特異分布的抗體酶藥物廓清后再注射前體藥物，在腫瘤局部造成高濃度化療藥物的微環(huán)境，從而高效率殺傷腫瘤細(xì)胞。第三十九張，PPT共四十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 細(xì)胞內(nèi)抗體將小分子抗體基因加上定位信號(hào)序列，使其在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)，可中和或調(diào)節(jié)位于特定亞細(xì)胞部位的活性分子或者觸發(fā)免疫反應(yīng)，即為細(xì)胞內(nèi)抗體( intrab