基于CHO細(xì)胞的單抗生產(chǎn)2課件

1、基于CHO細(xì)胞的單抗生產(chǎn)（第一版） 汪洋2018/02CHO細(xì)胞的構(gòu)建CHO細(xì)胞的表達(dá)CHO細(xì)胞表達(dá)后的產(chǎn)物純化目錄第一節(jié) CHO細(xì)胞的構(gòu)建2022/8/203生物類似藥的開發(fā)周期表引言工程細(xì)胞構(gòu)建的流程概述2022/8/205細(xì)胞株篩選一般流程宿主細(xì)胞載體篩選CHO細(xì)胞系宿主的一般來源FUT8（ -1,6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因），負(fù)責(zé)將巖藻糖加入抗體的N-糖鏈上，形成巖藻糖修飾 （專利日本BioWa制藥，預(yù)計(jì)2028.07.09）。去除巖藻糖修飾可以增強(qiáng)百倍以上的ADCC作用。2. crispr/cas9原理是 ：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與 tracrRN

2、A （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引導(dǎo) Cas9 對 DNA 的定點(diǎn)切割。3.鋅指核糖核酸酶（ZFN） 由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。宿主細(xì)胞選擇的一般原則Regulatory-Host cell lineIND提供CHO已知具有明顯的致瘤性，一般可不再檢測宿主細(xì)胞選擇的一般原則載體的一般性構(gòu)成主要構(gòu)件：IRES起始

3、位點(diǎn)Promoters啟動子Enhancer增強(qiáng)子Signal peptide信號肽mAb Sequence 單克隆抗體序列Terminator終止子 Resistance markers 抗性標(biāo)記 Expression promoting element 促穩(wěn)定表達(dá)件載體的一般性構(gòu)成1、IRES：即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，是一段核酸序列，它的存在能夠使蛋白質(zhì)翻譯起始不依賴于5帽結(jié)構(gòu)，從而使直接從信使RNA（mRNA）中間起始翻譯成為可能。通常來講，真核生物翻譯只能從mRNA的5端開始，因?yàn)榉g起始必須依賴于5端的帽子結(jié)構(gòu)。2、Promoters：即啟動子，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達(dá)的程

4、度，啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor）的這種蛋白質(zhì)（proteins）結(jié)合而控制基因活動的 抗體序列需使用強(qiáng)啟動子如SV40啟動子等 而抗性基因需要使用削弱的啟動子3、Enhancer：即增強(qiáng)子，是指能夠使基因轉(zhuǎn)錄頻 率明顯增加的 DNA序列。增強(qiáng)子主要存在于真核 生物基因組中。 增強(qiáng)子能大大增強(qiáng)啟動子的活性。 增強(qiáng)子具有特異性載體的一般性構(gòu)成 4、Signal peptide：即信號肽（引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈） 不同的產(chǎn)物可能需要不同的信號肽，抗體一般可使用人血白蛋白信號肽，獲得較高表達(dá)量，且能被完全切除 一般需要

5、進(jìn)行信號肽預(yù)測優(yōu)化，選擇合適的信號肽， 在蛋白質(zhì)分泌到胞外之前正常情況下會被完全切除 信號肽假說認(rèn)為，信號肽的功能是引導(dǎo)多肽到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，同時信號肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAb Sequence 人源化IgG1恒定區(qū)（ CH和CL ）有EM和DL兩個版本，區(qū)別是兩個位點(diǎn)的氨基酸有突變 Biosimilar: 檢索原研藥專利獲得VH和VL序列，并購買原研藥進(jìn)行序列分析比對，進(jìn)行序列驗(yàn)證 Category1ofTherapeuticBiologicalProducts: Hybridoma technique 雜交瘤篩選 Phage display 噬菌體展示載體的一般性構(gòu)成6、 Te

6、rminator ：終止子，是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。在一個操縱元中至少在構(gòu)基因群最后一個基因的后面有一個終止子。7、 Expression promoting element:即促表達(dá)元件 例：UCOE:全稱為泛染色質(zhì)開放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element），加在外源基因啟動子5端上游，是一個小的DNA片段，源于看家基因的無甲基化CpG島。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不論整合到染色質(zhì)什么位置，目的基因都能持續(xù)穩(wěn)定、高水平地表達(dá)。 Merck KGaA 專利，預(yù)計(jì)2019.07.20到期 載體的構(gòu)建的一般性原則構(gòu)建完的細(xì)胞

7、篩選非擴(kuò)增基因擴(kuò)增基因：在一定程度上表達(dá)量隨篩選壓力而增加可選其中一種或選其中任意兩種，使用兩種需要關(guān)注HC和LC比例（LC形成二聚體可以分泌到胞外）篩選方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)的 篩選方法ClonePix /Cell Xpress TM 克隆篩選及細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)Limiting dilution 有限稀釋法 篩選方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening The cold capture

8、 method used in FACS where fluorescently labeled antibodies bind to secreted 將待測的細(xì)胞經(jīng)熒光染料(FITC、 PE和PerCP等）或熒光標(biāo)記物特異性染色, 用特定波長的激光束照射, 激發(fā)熒光。 前向角光散射(forward angle light scatter, FSC)和側(cè)向角光散射(side angle light scatter,SSC)分別表征細(xì)胞的相對大小和內(nèi)部顆粒度, 相對熒光強(qiáng)度值能反映細(xì)胞目標(biāo)的相對表達(dá)水平光源篩選方法ClonePix Semi solid media 篩選方法Limiting d

9、ilution 有限稀釋法(limiting dilution cloning, LDC)是一種通過梯度稀釋以獲得單克隆的方法。 它的應(yīng)用范圍廣, 對于大多數(shù)細(xì)胞類型, 如雜交瘤細(xì)胞、 CHO細(xì)胞及干細(xì)胞等都有較好的克隆分離效果。 LDC的操作過程大致分為接種(鋪板)、 篩選和擴(kuò)增。 接種的細(xì)胞液經(jīng)過逐級稀釋后加到96孔板中, 每個孔所含的細(xì)胞個數(shù)理論上不大于1 有限稀釋法 Expression VectorHost cellTransfectionMinipoolStable poolSmall-scal BioreactorMonoclonalSubclone一二SubcloneSmall

10、-scal Bioreactor轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染后需要更換培養(yǎng)基。如Lipofectamine 3000 Transfection Reagent，一般用于瞬時轉(zhuǎn)染，因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率較高，也有部分企業(yè)用于穩(wěn)轉(zhuǎn)。 電穿孔轉(zhuǎn)染法：電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。因使用便捷且轉(zhuǎn)染（入核）效率較高， 大部分企業(yè)使用電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染有兩種方案：

11、方形波和指數(shù)波，根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的波形進(jìn)行優(yōu)化，選擇轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率較高的電轉(zhuǎn)條件。CHO細(xì)胞選用電轉(zhuǎn)較多。 病毒感染：對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。因操作難度高，使用較少?？寺『Y選一、Minipool 轉(zhuǎn)染24H后,使用含有壓力的培養(yǎng)基，以一定細(xì)胞密度接種到96WP,培養(yǎng)14-20天， 挑選出只有單簇細(xì)胞生長且匯合度超過30%的孔，ELISA檢測表達(dá)量，挑選表達(dá) 量較高的若干個克隆 96WP24WP6WPELISATPPSF125接種F125進(jìn)行Fed-Batch評估，檢測表達(dá)量和質(zhì)量，選擇產(chǎn)量和質(zhì)量最優(yōu)的

12、3-5個克隆MonoclonalELISA 、SDS(還原與非還原)表達(dá)量檢測還可用：Dot-blot、FortebioELISA克隆篩選二、 Stable pool 轉(zhuǎn)染24H后,使用含有壓力的培養(yǎng)基，以一定細(xì)胞密度接種到T75或F125,加壓 一定時間（根據(jù)使用的篩選壓力），得到若干個Stable pool，用ELISA（或 FACS ）檢測，選擇表達(dá)量（或陽性率和高表達(dá)）的1-2個Stable pool進(jìn)行單 克隆化 Stable pool96WP24WPTPPSF125接種F125進(jìn)行Fed-Batch評估，檢測表達(dá)量和質(zhì)量，選擇產(chǎn)量和質(zhì)量最優(yōu)的3-5個克隆Monoclonal以1-3

13、個/孔鋪板96孔板進(jìn)行單克隆化，一般不添加篩選壓力或者使用半壓6WPELISAELISAELISA 、SDS(還原與非還原)單克隆在細(xì)胞克隆中，對培養(yǎng)的細(xì)胞來說，從原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就是亞克隆。亞克隆的目的是獲得單克隆CFDA-目前來說只要理論上證明是單克隆FDA- Clonality Limiting dilution ：classic 0.5cell/well 2 roundsCSI/Cell Metric單克隆拍照系統(tǒng)FDA目前對于單克隆證明方法意見克隆性FISH不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基

14、因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。篩選檢定細(xì)胞代次的規(guī)定細(xì)胞庫的相關(guān)法規(guī)要求細(xì)胞庫的相關(guān)法規(guī)要求1、程序性降溫儀：可編程降溫程序，能夠準(zhǔn)確的達(dá)到設(shè)定的溫度，重復(fù)性。穩(wěn)定性好，適合于細(xì)胞建庫使用2、程序降溫盒：需在降溫盒夾層加入異丙醇，可實(shí)現(xiàn)-1/ min，每個凍存盒一般可放16支，比較適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序：為降溫速率-1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時，可增至-5-10/min；到-100時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。細(xì)胞庫的相關(guān)法規(guī)要求凍存容器：（供應(yīng)商:CBS、MVE、

15、Thermo Fisher Scientific ）普通液氮罐：直接凍存在液態(tài)液氮中，很容易引起交叉污染氣化液氮罐：液氮存于罐底部，通過底部液氮?dú)饣S持溫度隔氮型液氮罐：液氮貯存于夾層中，與樣品完全隔離，取用安全且將交叉污染的可能降到最低細(xì)胞庫的相關(guān)法規(guī)要求細(xì)胞庫的檢定細(xì)胞庫檢定-CHO細(xì)胞檢測項(xiàng)目MCPWCPEOPC細(xì)胞鑒別+(+)細(xì)菌、真菌檢查+分歧桿菌檢查+支原體檢查(+)(+)(+)內(nèi)、源病毒污染檢查細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)+體外不同細(xì)胞接種培養(yǎng)法+動物和雞胚體內(nèi)接種法+-+逆轉(zhuǎn)錄病毒檢查+-+種屬特異性病毒檢查（鼠源）(+)-牛源性病毒檢查(+)(+)(+)豬源性病毒檢查(+)(+)

16、(+)其他特定病毒檢查(+)(+)(+)染色體檢查(+)(+)(+)成瘤性檢查(+)(+)-致瘤性檢查(+)(+)-( +) 表示要根據(jù)細(xì)胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)過程等情況要求的檢鏈項(xiàng)目。 細(xì)胞庫的穩(wěn)定性考察細(xì)胞穩(wěn)定性研究儲存條件下的穩(wěn)定性傳代/擴(kuò)增過程的穩(wěn)定性基因水平目的產(chǎn)物表達(dá)水平細(xì)胞自身穩(wěn)定性細(xì)胞庫的穩(wěn)定性考察儲存條件下穩(wěn)定性屬于原液放行檢定項(xiàng)目細(xì)胞庫的穩(wěn)定性考察傳代/擴(kuò)增過程的穩(wěn)定性通過細(xì)胞構(gòu)建減少表達(dá)雜質(zhì)的案例CHOK1 cell Expression of antibody A Acidic variants: NMT 14.0%Basic variants: NMT 30.0%US

17、P Acceptance criteriaAcidic variants: NMT 35.0%Basic variants: NMT 15.0% Originaldrugs Acidic variants: NMT 10.0%Basic variants: NMT 10.0%游離巰基、半胱氨酸殘基N-末端谷氨酰胺環(huán)化甲硫氨酸的氧化天冬酰胺脫氨基作用和天冬氨酸異構(gòu)化C-末端賴氨酸不完全截除糖基末端的唾液酸化抗體電荷異質(zhì)性的主要成因堿性峰堿性峰堿性峰酸性峰酸性峰酸性峰重鏈C-末端賴氨酸不完全截除堿性峰羧肽酶是移除C-賴氨酸的酶可用弱陽離子層析檢測分析降低賴氨酸變體的策略：降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度延長發(fā)酵時

18、間提高鋅離子濃度降低銅離子濃度重鏈和輕鏈 N-末端谷氨酰胺環(huán)化可被谷氨酰胺環(huán)化酶催化但在抗體儲存過程中，環(huán)化作用是自發(fā)的可用基于電荷的分析方法，如 IEF、CEXpH 4 6，pH升高環(huán)化減少pH 6 8，pH升高環(huán)化增加在中性條件下環(huán)化作用最少降低谷氨酰胺環(huán)化的策略：盡量選擇中性條件控制溫度（高溫條件可加速環(huán)化）甲硫氨酸的氧化堿性峰主要位點(diǎn)：M252、M428檢測：先還原成HC+LC，聯(lián)苯層析柱 加 UV215nm 加 質(zhì)譜降低甲硫氨酸氧化的策略：避免高溫、紫外線、叔丁基過氧化氫，溶氧不要過高堿性峰焦谷氨酸氨肽酶去環(huán)化，釋放自由氨基，可恢復(fù)基于Edman降解法的N-末端氨基酸測序糖基末端的唾

19、液酸化酸性峰常發(fā)生在糖鏈末端半乳糖殘基上可用唾液酸酶去除，用IEF、CEX檢測抗體生產(chǎn)追求NeuAc /NeuGc比例最大化最大化策略：+丁酸鈉，下調(diào)培養(yǎng)溫度NeuAc /NeuGc測定方法：HPLC、MS、IEF 唾液酸酶去除唾液酸前后的對比天冬酰胺脫氨基作用酸性峰可自發(fā)發(fā)生，無需酶催化檢測：人為加速脫氨基 （37C，pH8） 之后用 CEX，HIC降低脫氨基作用的策略：盡量避免熱點(diǎn)序列 Asn-Gly降低培養(yǎng)溫度，適當(dāng)下調(diào)pH游離巰基、半胱氨酸殘基酸性峰抗體的二硫鍵可能未配對或配錯對，導(dǎo)致抗體表面電荷分布的改變和酸性峰的出現(xiàn)用木瓜蛋白酶把完整抗體解離成Fab和Fc后，用RP-HPLC可檢測

20、到游離巰基降低游離巰基、半胱氨酸殘基的策略：在培養(yǎng)基中加適量硫酸銅（氧化劑）有研究發(fā)現(xiàn) ，單克隆抗體 的 C-末端殘留賴氨酸在靜脈注射至體 內(nèi)后 ，會被血清中的羧肽酶 B 快速降解 ，完整 C-末端賴氨酸的半衰期約為 62 min。另有研究發(fā)現(xiàn) ，從血清中獲得的抗體通常均缺少C-末端賴氨酸，也從另一方面證實(shí) 了C-末端賴氨酸殘基在體內(nèi)是受到限制的。 K H A W LI等 通過置換色譜法分別制備 出酸堿變體 ，并對其進(jìn)行評價 ，發(fā)現(xiàn) C-末端賴氨酸變體對抗體 的效價 、安全性均無影響。重鏈C-末端賴氨酸盡管 C-末端賴氨酸變體對單克隆抗體 的生物學(xué)活性無影響 ，但抗體的賴氨酸變體程度也反 映了

21、生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的一致性 ，尤其在生物類似藥的研發(fā)過程中和生產(chǎn)工藝改變后 ，更應(yīng)對產(chǎn) 品的賴氨酸變體進(jìn)行檢測和評價 。 因此 ，在生產(chǎn)工藝的研發(fā) 中 ，應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控 C-末端賴氨酸變體 ，并深入了解其與產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的關(guān)系。 單克隆抗體大規(guī)模生產(chǎn)時 ，賴氨酸變體應(yīng)控制在可行范圍內(nèi)，并評估是否需作為在產(chǎn)品放行 、穩(wěn)定性試驗(yàn)和工藝改變時的一項(xiàng)檢測指標(biāo)。 第二節(jié) CHO細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求細(xì)胞構(gòu)成的基本元素：碳、氫、氧、氮、鈉、鉀、鈣、鎂、磷，合適的培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的必要條件1.氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、

22、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。小花絮：經(jīng)過幾萬年動物進(jìn)化，自然選擇的結(jié)果，動物體內(nèi)所有的氨基酸都左旋的，所以右旋的氨基酸是不能用于細(xì)胞培養(yǎng)的2022/8/2045細(xì)胞培養(yǎng)基單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。 體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)維系鍵是肽鍵，二

23、級結(jié)構(gòu)借氫鍵維系，三級結(jié)構(gòu)維系鍵主要是非共價鍵（次級鍵）：氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵等，也可涉及二硫鍵。這些鍵的形成主要依靠CHON，所以糖和氨基酸是細(xì)胞培養(yǎng)基中最重要組成部分2022/8/2046細(xì)胞培養(yǎng)基維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。2022/8/2047細(xì)胞培養(yǎng)基無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩、硫等。 微量元素雖然在細(xì)胞體內(nèi)含量非常非常少，卻是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中非常重要的維系鍵形成的關(guān)鍵元素，對于藥物而言該

24、四級結(jié)構(gòu)控制著藥代、藥理相關(guān)的過程2022/8/2048促生長因子及激素 已證實(shí)：各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。細(xì)胞培養(yǎng)基2022/8/2049細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求滲透壓 ：細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動

25、物細(xì)胞，滲透壓在260320mOsm/kg的范圍都適宜。 pH 、氣體 也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細(xì)胞于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7274在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定

26、，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。2022/8/2050CHO細(xì)胞性質(zhì)中華倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）是治療性重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的主要宿主細(xì)胞。較于其他細(xì)胞類型，CHO細(xì)胞是治療性蛋白生產(chǎn)的主要宿主細(xì)胞的原因如下：（1）能在化學(xué)成分限定和無血清懸浮培養(yǎng)中穩(wěn)定生長，（2）在人類致病病毒應(yīng)答方面表現(xiàn)出合理的安全性，（3）能夠表達(dá)與人相似的翻譯后修飾。此外，CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的最重要優(yōu)勢之一是能夠容易的得到基因改造的細(xì)胞克隆，這些克隆能夠表達(dá)產(chǎn)量充足和質(zhì)量可接受的人用目標(biāo)基因（GOI）蛋白。這些既可以通過將目的基因特異性位點(diǎn)整合插入到宿主細(xì)胞基因組中，也可以通過二氫葉酸還原酶（DH

27、FR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系統(tǒng)的基因擴(kuò)增方法將基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組中。然而，因?yàn)樘腔Ｊ脚c人類不完全相同，導(dǎo)致CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白在某些時候仍然表現(xiàn)出免疫源性。2022/8/2051單抗的性質(zhì)抗體是由B細(xì)胞分泌，具有識別外源性病原體并誘發(fā)免疫應(yīng)答的一類糖蛋白，人體內(nèi)有5種類型的抗體：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，其中IgG1 在血液中占主導(dǎo)地位2022/8/2052目前所有獲批的重組單抗藥物都是IgG 亞型FabFc鉸鏈區(qū)單抗的性質(zhì)2022/8/2053CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程細(xì)胞核中DNA轉(zhuǎn)錄成為信使RNA，信使RNA經(jīng)過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，被細(xì)胞質(zhì)中的核糖體發(fā)現(xiàn)，進(jìn)

28、入核糖體進(jìn)行翻譯，經(jīng)過原料氨基酸的合成為多肽，（cho細(xì)胞不能自身無合成脯氨酸的基因，需在培養(yǎng)基中加L-脯氨酸），核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，核糖體合成的多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著的大量的酶加工、剪切，最后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌囊泡將被加工過的多肽包裹運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，高爾基體進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，形成蛋白質(zhì)。然后高爾基體分泌囊泡包裹蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨?表達(dá)蛋白過程的概述2022/8/2054CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程2022/8/2055CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程真核細(xì)胞中染色質(zhì)分為兩部分，一部分為固縮狀態(tài)，如間期細(xì)胞著絲粒區(qū)、端粒、次溢痕，染色體臂的某些節(jié)段部分的重復(fù)序列和巴氏小體均不能表達(dá)，通常把該部分

29、稱為異染色質(zhì)。與異染色質(zhì)相反的是活化的常染色質(zhì)。真核基因的活躍轉(zhuǎn)錄是在常染色質(zhì)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前，常染色質(zhì)往往在特定區(qū)域被解旋或松弛，形成自由DNA，這種變化可能包括核小體結(jié)構(gòu)的消除或改變，DNA本身局部結(jié)構(gòu)的變化，如雙螺旋的局部去超螺旋或松弛、DNA從右旋變?yōu)樽笮?，這些變化可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，RNA聚合酶能夠發(fā)生作用，促進(jìn)了這些轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄2022/8/2056真核生物基因轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，而翻譯則在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。在轉(zhuǎn)錄過程中真核基因有插入序列，結(jié)構(gòu)基因被分割成不同的片段，因此轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的一個重要方面，首要的是RNA的加工、成熟。

30、各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，無論rRNA、tRNA還是mRNA，必須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的加工才能成為有活性的分子蛋白質(zhì)合成翻譯階段的基因調(diào)控有三個方面： 蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)控； mRNA的識別； 激素等外界因素的影響。蛋白質(zhì)合成起始反應(yīng)中要涉及到核糖體、mRNA蛋白質(zhì)合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，這些結(jié)構(gòu)和諧統(tǒng)一才能完成蛋白質(zhì)的生物合成。mRNA則起著重要的調(diào)控功能。CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程2022/8/2057CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程真核生物mRNA的“掃描模式”與蛋白質(zhì)合成的起始。真核生物蛋白合成起始時，40S核糖體亞基及有關(guān)合成起始因子首先與mRNA模板近5端處結(jié)合，然后向3方向移行，發(fā)現(xiàn)A

31、UG起始密碼時，與60S亞基形成80S起始復(fù)合物，即真核生物蛋白質(zhì)合成的“掃描模式”。真核生物5末端可以有3種不同帽子：0型、I 型和 II 型。不同生物的mRAN可有不同的帽子，其差異在于帽子的堿基甲基化程度不同。帽子的結(jié)構(gòu)與mRNA的蛋白質(zhì)合成速率之間關(guān)系密切： 帽子結(jié)構(gòu)是mRNA前體在細(xì)胞核內(nèi)的穩(wěn)定因素，也是mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定因素，沒有帽子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會很快被核酸酶降解； 帽子可以促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成過程中起始復(fù)合物的形成，因此提高了翻譯強(qiáng)度； 沒有甲基化(m7G)的帽子(如GPPPN-)以及用化學(xué)或酶學(xué)方法脫去帽子的mRNA，其翻譯活性明顯下降。2022/8/2058翻譯后修飾如脫酰

32、胺、二硫鍵形成、末端賴氨酸處理（切除）和糖基化，后者是一種發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)復(fù)雜的翻譯后修飾。根據(jù)作用機(jī)理，生物藥物分子的糖型可能決定了其臨床療效，因此糖基化修飾被認(rèn)為是單抗藥物的一個關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）CHO細(xì)胞表達(dá)單抗的過程2022/8/2059 CQA：糖基化修飾N-糖位點(diǎn) (ASN-X-Thr/Ser, X非Pro)O-糖位點(diǎn) (任意 Thr 和 Ser)O-糖基化N-糖基化（Enbrel-etanercept）60最主要形式O-糖基化類型常見8種粘蛋白類型O-糖核心結(jié)構(gòu)常見粘蛋白類型O-糖質(zhì)譜分子量61N-糖基化類型Hybrid雜合型High mannose高甘露糖型治療性重

33、組抗體常見N-糖基化組成重點(diǎn)關(guān)注對Fc功能影響和存在免疫原性的糖型Complex復(fù)雜型62N-糖形成過程內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體各種剪切酶（減去單糖）及轉(zhuǎn)運(yùn)酶（加上單糖）作用下對糖基化形式進(jìn)行編輯63N-糖基化對蛋白功能影響增進(jìn)蛋白溶解度，一定程度防止蛋白聚集保護(hù)蛋白免受蛋白酶酶切可能引起免疫原性對ADCC、CDC等生物效應(yīng)造成影響對體內(nèi)循環(huán)半衰期有一定影響影響蛋白質(zhì)構(gòu)象變化64N-糖基化對蛋白構(gòu)象的影響鉸鏈區(qū)影響分子構(gòu)象“鉸鏈區(qū)”的存在為分子提供了柔性，使得Fab-Fc、Fab-Fab間可以有一定的擺動。進(jìn)而影響IgG的空間構(gòu)象，影響Fc片段活性區(qū)域與多種受體的結(jié)合。N糖基化同樣影響分子構(gòu)象N糖基化位

34、于Fc片段的CH2共有序列 （Asn-X-Ser/Thr）通過晶體X衍射發(fā)現(xiàn)蛋白與糖以對等方式相互作用而影響彼此構(gòu)象N-Glycosylation siteFcRs(FcRIIa、FcRIIb、FcRIIIa、FcRIIIb)FcRnC1q結(jié)合65ADCCAntibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity （抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）1、IgG抗體與靶細(xì)胞表面的抗原決定簇特異性地結(jié)合；2、之后NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等借助其表面受體與結(jié)合在靶細(xì)胞上的IgG Fc段結(jié)合；3、活化的NK細(xì)胞等釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒物質(zhì)殺傷靶細(xì)胞；4、靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，

35、抗體被肝處理。*與去巖藻糖化、唾液酸比例等相關(guān)66CDCComplement Dependent Cytotoxicity （補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用）補(bǔ)體參與的細(xì)胞毒作用，即通過特異性抗體與細(xì)胞膜表面相應(yīng)抗原結(jié)合，形成復(fù)合物而激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，所形成的攻膜復(fù)合物對靶細(xì)胞發(fā)揮裂解效應(yīng)*與末端半乳糖化比例相關(guān)67甘露糖受體功能甘露糖受體，屬于哺乳動物類C型凝集素超家族成員,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞表面, 可與末端甘露糖特異結(jié)合。高甘露糖型抗體由于可被巨噬細(xì)胞的甘露糖受體結(jié)合并發(fā)生吞噬作用，因此在體內(nèi)的循環(huán)時間減少，半衰期減短，因此應(yīng)盡量減少抗體中高甘露糖糖型的比例。*與高甘露糖型比例相關(guān)

36、68舉例Additional Terminal ResidueEffect on receptor bindingEffect on ADCCEffect on C1q bindingEffect on CDCEffect on Half-life in Serum巖藻糖減弱減弱無影響無影響無影響唾液酸減弱減弱無影響無影響增強(qiáng)半乳糖無影響無影響增強(qiáng)增強(qiáng)無影響高甘露糖增強(qiáng)增強(qiáng)減弱減弱減弱N-乙酰葡糖胺增強(qiáng)增強(qiáng)減弱減弱未知末端寡糖對抗體活性的影響Current Opinion in Immunology 2008, 20:471478細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響補(bǔ)料成分抗體糖型取決于培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物

37、質(zhì)濃度，營養(yǎng)物質(zhì)中的糖分子作為糖基化所需的糖-核苷酸前體存在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中葡萄糖水平變化明顯影響聚糖異質(zhì)性，在流加模式中更為重要，產(chǎn)品糖型的一致性是獲得臨床預(yù)期結(jié)果的保障。已發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的提高，CHO細(xì)胞及新近構(gòu)建的細(xì)胞系（如F2N78）所表達(dá)的抗體半乳糖和唾液酸糖基化水平會提高葡萄糖合適的操作區(qū)間濃度（2-8g/L）。葡萄糖饑餓程度在培養(yǎng)早期對細(xì)胞影響最大2022/8/2070細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響二價陽離子如Mn2+（4-40M）可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的半乳糖苷化和唾液酸化提高。因?yàn)镸n2+是高爾基體中-1,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的輔助因子。二價陽離子在分泌路徑將寡糖連接至目的物中發(fā)揮作

38、用，沒有它們N型連接寡糖鏈過程將會受到抑制。補(bǔ)料成分2022/8/2071細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響丁酸鈉可以通過將細(xì)胞周期滯留而增加特定mAb的產(chǎn)率，然后，在培養(yǎng)基中加入丁酸鈉觀察到會降低半乳糖修飾水平并增加mAb的堿性電荷異構(gòu)體。添加丁酸鈉也觀察到會降低mAb唾液酸修飾水平補(bǔ)料成分2022/8/2072細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響單糖連接至正在成長的天線寡糖鏈結(jié)構(gòu)中需要核苷酸糖作為供給者，其效率對最終糖型影響極深。尿苷被認(rèn)為是合成糖-核苷酸結(jié)合體的主要前體之一，因此影響產(chǎn)品質(zhì)量。補(bǔ)料成分2022/8/2073細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響培養(yǎng)基中補(bǔ)充的氨基酸對唾液酸修飾的影響已被很好地證明。氨基

39、酸的消耗直接與表達(dá)的抗體所序列所含氨基酸種類相關(guān)。因此為了獲得最佳產(chǎn)品質(zhì)量，在培養(yǎng)過程中補(bǔ)充關(guān)鍵氨基酸并進(jìn)行濃度分析是勢在必行的。這些還引導(dǎo)出了新的詞匯如“fermentanomics”的出現(xiàn)，利用1D1HNMR技術(shù)實(shí)時或近似實(shí)時監(jiān)控補(bǔ)料成分與細(xì)胞代謝。利用多重變量數(shù)據(jù)分析評估m(xù)Ab糖基化與過程變量及諸如氨基酸等原材料的關(guān)系，從而對復(fù)雜糖基化過程產(chǎn)生更為深入的了解。補(bǔ)料成分2022/8/2074細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響對細(xì)胞最優(yōu)的培養(yǎng)溫度可能不一定是細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的最優(yōu)溫度。低些的培養(yǎng)溫度（從37降至30-35）發(fā)現(xiàn)可以使細(xì)胞滯留在G0/G1期，具有更高的細(xì)胞活力和更少的細(xì)胞凋亡。在低的溫度下

40、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc數(shù)量減少。研究者證實(shí)mRNA水平的提高（而非生長周期的滯留）是低溫下獲得高產(chǎn)率的背后原因。最近，通過關(guān)鍵糖分支酶的研究對低溫條件下的mAb產(chǎn)品有了更好的了解。發(fā)現(xiàn)這些酶下調(diào)導(dǎo)致終產(chǎn)品糖鏈結(jié)構(gòu)的異常。細(xì)胞活力和溫度2022/8/2075細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響溶氧的影響所有代謝過程都需要氧氣，所以溶氧控制對優(yōu)化細(xì)胞生長很重要。細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白/抗體糖型的隨溶氧（DO）水平變化而改變。在鼠CC9CC10細(xì)胞表達(dá)的IgGmAb1時發(fā)現(xiàn)半乳糖基化水平的差異，低溶氧條件下半乳糖糖基化水平也低。這個似乎是因UDP-Gal低水平所致，因?yàn)槠咸烟欠纸馔緩綄?dǎo)

41、致半乳糖利用率下降。另外一個解釋是早期形成的重鏈間二硫鍵對要加入正在生長的寡糖鏈的半乳糖產(chǎn)生了空間位阻。不同型號的生物反應(yīng)器，即使達(dá)到相似的過程控制和溶氧條件，依然會對糖型有影響。利用雜交瘤細(xì)胞系（BCF2）進(jìn)行一室縮小規(guī)模模擬溶氧張力（DOT）波動培養(yǎng)，研究生物培養(yǎng)環(huán)境的差異對mAb糖型影響。據(jù)報道，10%DO水平下培養(yǎng)三天線結(jié)構(gòu)和唾液酸數(shù)量會增加。DOT對鼠雜交瘤細(xì)胞系HFN7.1生產(chǎn)的IgG1的糖型影響極深，DOT在10%-90%空氣飽和度變化時，半乳糖和唾液酸最大變化量分別達(dá)20%和30%。短暫的DOT變化對終產(chǎn)品質(zhì)量有著顯著影響。2022/8/2076細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響氨和P

42、H值氨是CHO細(xì)胞代謝谷氨酰胺或天冬酰胺時釋放到培養(yǎng)基中的有毒副產(chǎn)物。據(jù)知，氨水平的增加會改變CHO細(xì)胞表達(dá)的IgG的糖型，因?yàn)殇@根離子會升高高爾基體的pH值并抑制與寡糖鏈相關(guān)的酶的酶活。對mAb生產(chǎn)而言，理想的胞內(nèi)氨濃度低于2mM，胞外濃度4-10mM。高爾基體pH的微小上升會導(dǎo)致-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶定位錯誤，維持pH近中性會改變高爾基體的形態(tài)。高pH會影響UMP的電離狀態(tài)，UMP是一種UDP-GlcAc轉(zhuǎn)運(yùn)子的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，從而影響UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)高爾基體。氨水平的增加同樣顯示出：高爾基體高pH時，引起半乳糖和唾液酸修飾的降低，從而引起甘露糖修飾的增加。氨也通過補(bǔ)償胞內(nèi)核苷酸糖

43、庫的平衡而影響抗體糖型（圖 3）。已有推論因?yàn)镃MP-SiaT酶水平的降低，氨水平的提高阻止了唾液酸從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體。更進(jìn)一步，從可用文獻(xiàn)獲知pH（理想pH6.8-7.8）對糖型的顯著影響與不同表達(dá)細(xì)胞系有關(guān)，另有結(jié)果表明pH在不同細(xì)胞系中對糖型的微觀異質(zhì)性有影響。還有些研究者報道稱人細(xì)胞系中高pH會引起半乳糖修飾水平下降，另外一些人發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞系中高pH引起IgG3的半乳糖修飾水平增加。2022/8/2077滲透壓細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響滲透壓是另外一個影響mAb生產(chǎn)、細(xì)胞生長和細(xì)胞活力的關(guān)鍵過程參數(shù)。一定范圍的高滲（300-400mOsm/kg）有益，并被用來提高重組蛋白在CHO細(xì)

44、胞中的表達(dá)。添加堿、葡萄糖或其他補(bǔ)料會提高滲透壓，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量和特殊mAb產(chǎn)品。長時間的培養(yǎng)和培養(yǎng)基的高滲透壓會產(chǎn)生高甘露糖型的抗體藥物。2022/8/2078因素正向影響負(fù)面影響錳離子在Mn2+濃度高時，IgG的N-聚糖修飾具有高甘露糖型；IgG的 Man5糖型減少在有尿苷和半乳糖的補(bǔ)充下，半乳糖修飾水平高。葡萄糖高濃度葡萄糖與可產(chǎn)生的前體相關(guān)，導(dǎo)致高水平的半乳糖修飾和唾液酸修飾耗盡時，減少IgG的位點(diǎn)占據(jù)；限制葡萄糖水平導(dǎo)致低水平的糖基化。丁酸鈉丁酸鈉存在時，唾液酸水平微小下降；減少半乳糖修飾。氨/谷氨酰胺隨著氨水平的增加，抑制半乳糖和唾液酸修飾。氨基酸隨著色氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸的

45、補(bǔ)充唾液酸修飾水平增加。培養(yǎng)基中高濃度的天冬酰胺導(dǎo)致低半乳糖型修飾。血清無血清培養(yǎng)中糖型異質(zhì)性低；無血清培養(yǎng)基中唾液酸修飾高&半乳糖類修飾低。細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響小結(jié)因素正向影響負(fù)面影響氧DO水平波動會增加三天線型和唾液酸修飾。在低DO水平下IgG的半乳糖修飾減少；在低DO水平下半乳糖修飾減少而唾液酸修飾增加。pH低pH時，葡萄糖修飾&唾液酸修飾水平提高。隨著pH上升，末端半乳糖修飾減少&巖藻糖修飾增加；高pH時，半乳糖修飾水平下降。溫度低溫時，由于基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致mAb糖鏈結(jié)構(gòu)的成熟度下降。滲透壓高滲時，增加Man5修飾水平。在高滲（420mOsm/Kg）時對糖型無明顯影響；在較高滲

46、透壓時會減少巖藻糖修飾水平（在285mOsm/Kg時70%，345mOsm/Kg時40%）。細(xì)胞系由于二等分GlcNAc的加入使得ADCC活性增加。在CHO細(xì)胞中缺少相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)運(yùn)酶，缺失a-2,6-唾液酸；NS0細(xì)胞系增加a-1,3-半乳糖表位。細(xì)胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響小結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE一般在藥物進(jìn)入臨床II期研究，產(chǎn)品開始進(jìn)行商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的時候，過程定性研究就要啟動。這部分工作至少需要1215個月。完成過程定性研究工作后，才能開展的工藝放大，技術(shù)轉(zhuǎn)移和工藝驗(yàn)證等后續(xù)工作。過程定性（process characterization）是對生物制藥生產(chǎn)過程進(jìn)行系統(tǒng)的研究，旨在建立具有較

47、強(qiáng)穩(wěn)健性（robust），柔順性（compliance）的生產(chǎn)工藝，滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)對工藝開發(fā)的要求。這部分工作包括，對大規(guī)模生產(chǎn)過程進(jìn)行預(yù)先的風(fēng)險評估，研究過程操作參數(shù)對性能指標(biāo)的影響, 區(qū)分關(guān)鍵參數(shù)與非關(guān)鍵參數(shù)，確定操作參數(shù)的控制范圍,了解各操作參數(shù)之間的交互作用等。進(jìn)行過程定性研究，如果在實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模上進(jìn)行試驗(yàn)，不僅成本昂貴，而且不具操作性。目前主要采用“規(guī)?？s小模型”（sale down model），在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)利用小型化生物反應(yīng)器完成過程定性研究。2022/8/2081細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE在實(shí)驗(yàn)室里利用“規(guī)?？s小模型”完成商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)過程定性研究，需要遵循嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的程序。首先，

48、要對以往批次數(shù)據(jù)的進(jìn)行充分的挖掘、分析，在此基礎(chǔ)上，完成生產(chǎn)過程的風(fēng)險評估，根據(jù)各操作參數(shù)對過程性能指標(biāo)的影響程度，對其進(jìn)行優(yōu)先級別排序。建立能夠充分模擬大規(guī)模生產(chǎn)過程的“規(guī)?？s小模型”2022/8/2082細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE在進(jìn)行過程定性研究之前，首先需要對以往批次數(shù)據(jù)進(jìn)行充分的挖掘分析。在此基礎(chǔ)上，對生產(chǎn)過程的不同環(huán)節(jié)（培養(yǎng)基、種子鏈及生產(chǎn)期）進(jìn)行風(fēng)險評估，這其中包括：潛在風(fēng)險發(fā)生嚴(yán)重程度，風(fēng)險發(fā)生的幾率，風(fēng)險是否具有可檢測性等。通常使用危害分析與關(guān)鍵點(diǎn)控制(HACCP) 、失敗模式和影響分析（Failure mode and effects analysis）、因果圖（cause-a

49、nd-effect diagrams）等工具對以上過程要素進(jìn)行的風(fēng)險評估。這其中FMEA是利用數(shù)字（1到10）對過程風(fēng)險進(jìn)行量化分級。MPN是綜合評價風(fēng)險的嚴(yán)重程度，發(fā)生的幾率，以及風(fēng)險是否具有可檢測性進(jìn)行綜合評判。2022/8/2083細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE2022/8/2084進(jìn)行過程定性研究，首先需要建立一個能夠充分反映商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過程特點(diǎn)的“規(guī)模縮小模型”。該模型能夠在參數(shù)評價，工藝開發(fā)中，起到模擬商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的效果。當(dāng)然，建立好一個“規(guī)?？s小模型”后，需要對其的“等效性”進(jìn)行驗(yàn)證。開展此工作的流程，首先確定需要進(jìn)行規(guī)?？s小的操作參數(shù)，找出其中的關(guān)鍵參數(shù)，確定參數(shù)的可以接受的變化范圍。

50、進(jìn)行規(guī)?？s小模型試驗(yàn)，判定該模型是否與其代表的大規(guī)模培養(yǎng)工藝具有等效性。細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE2022/8/2085細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE細(xì)胞培養(yǎng)所涉及到的參數(shù)在進(jìn)行規(guī)?？s小時，根據(jù)其縮小策略的不同，通常可以分為兩類。一類與體積密切相關(guān)的，如工作體積、流加體積，攪拌和通氣。一類是獨(dú)立于體積的參數(shù)，如pH、溶氧和溫度。對過程參數(shù)進(jìn)行規(guī)模進(jìn)行體積縮小時，非體積依賴型參數(shù)保持不變，體積依賴型參數(shù)則按照培養(yǎng)體積縮小的比例，進(jìn)行線性遞減。但在實(shí)際工作中，受反應(yīng)器的幾何尺寸，液體的表面體積比，以及操作可控能力等因素影響，某些體積依賴參數(shù)如反應(yīng)器攪拌速率、通氣流量又不能簡單的理解為線性遞減2022/8/20

51、86體積非依賴型參數(shù)過程溫度pH 接種體積(v/v) for each step 流加策略氧氣傳遞速率二氧化碳去除速率消泡策略細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE2022/8/2087體積依賴型參數(shù)培養(yǎng)基滅菌前后體積變化流加速率空氣流量氧氣流量細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE2022/8/2088細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE舉例：2L Applikon 生化反應(yīng)器模擬2,000L發(fā)酵罐時，各操作參數(shù)進(jìn)行規(guī)模縮小時所采取的策略。 2022/8/2089完成操作參數(shù)的規(guī)?？s小，建立了整個培養(yǎng)過程的“規(guī)?？s小模型”后，就需要對此模型進(jìn)行驗(yàn)證，以判定該模型與其所代表的商業(yè)培養(yǎng)規(guī)模是否具有等效性。驗(yàn)證的方法是比較兩過程性能參數(shù)是否一致。據(jù)此來判定，建立的“規(guī)?？s小模型”是否成功。細(xì)胞培養(yǎng)過程的性能指標(biāo)常被用來當(dāng)做判定的依據(jù)。細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE2022/8/2090細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE細(xì)胞生長情況可以通過比較生長曲線，或者直接比較細(xì)胞比生長速率，來考察不同培養(yǎng)規(guī)模下細(xì)胞的生長情況。這部分工作也可以通過測定培養(yǎng)液光密度、固形物體積，細(xì)胞干重、細(xì)胞濕重等方法進(jìn)行。模擬效果好的“規(guī)模縮小模型”可以與大規(guī)模培養(yǎng)過程具有相同的細(xì)胞比生長速率和細(xì)胞得率。2022/8/2091細(xì)胞培養(yǎng)條件研究DOE氧氣消耗比較細(xì)