蛋白相互作用

1、研究蛋白相互作用的方法：酵母雙雜交1酵母雙雜交的缺點(diǎn)1) 相互作用必須在酵母中進(jìn)行,許多外源目標(biāo)蛋白在酵母中表達(dá)天然活性已經(jīng)發(fā)生變化;2) 各種原因造成的假陽(yáng)性,例如一些受試蛋白本身可能激活了報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄或在酵母雙雜交系統(tǒng)中相互作用的蛋白在其天然環(huán)境中處于不同細(xì)胞器,并不發(fā)生相互作用;3) 必須通過(guò)酵母細(xì)胞培養(yǎng)才能觀察到結(jié)果,耗時(shí)較長(zhǎng).2Identifying Protein-ProteinInteractions: FRET3Identifying Protein-ProteinInteractions: FRET青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、

2、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）為目前蛋白-蛋白相互作用研究中最廣泛應(yīng)用的FRET對(duì)。CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜相重疊。將供體蛋白CFG和受體蛋白YFG分別與兩種目的蛋白融合表達(dá)。當(dāng)兩個(gè)融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，則供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP吸收，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光，此時(shí)通過(guò)測(cè)量CFP熒光強(qiáng)度的損失量來(lái)確定這兩個(gè)蛋白是否相互作用。兩個(gè)蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測(cè)器所接收到的熒光就越少。 FRET 和BRET 技術(shù)對(duì)儀器的要求高,需要復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析. 同時(shí),這類方法檢測(cè)的是供體和受體的熒

3、光強(qiáng)度的變化.4Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC)2000 年, Ghosh 等首次報(bào)道了1 個(gè)借助反向平行的亮氨酸拉鏈介導(dǎo)的GFP 重組實(shí)驗(yàn). 該實(shí)驗(yàn)選用了易被檢測(cè)的GFP 蛋白,將其從氨基酸Gln157-Lys158 位切開(kāi),把1 組反向平行的亮氨酸拉鏈分別連接到GFP 的N 端和C 端.,將1 個(gè)亮氨酸拉鏈(NZ) 通過(guò)1 個(gè)連接肽連接到GFP 的N 片段的第157 個(gè)氨基酸上,另1 個(gè)亮氨酸拉鏈(CZ) 連接到C 端片段的第158 位氨基酸. 在體外和體內(nèi)(大腸桿菌BL21 中) 分別證明了,只有借助亮氨酸拉鏈的相互作用,GFP

4、 的2 個(gè)多肽片段才能夠靠近,重新形成完整的GFP 蛋白,并發(fā)射熒光.52003 年, Hu 和Kerppola29 系統(tǒng)地研究了GFP 及其3 個(gè)不同顏色的突變體藍(lán)色熒光蛋白(BFP) ,青色熒光蛋白(CFP) 以及黃色熒光蛋白( YFP) 的BiFC 現(xiàn)象. 他們把GFP ,BFP ,CFP ,YFP 從氨基酸155 位和173 位分別切開(kāi),把切開(kāi)的N 端片段用其顏色和位點(diǎn)命名,如NY155 ,NG173 等6BiFC 技術(shù)正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，在環(huán)結(jié)構(gòu)的特異位點(diǎn)將熒光蛋白切成N 端片段和C 端片段兩部分后，再由一小段氨基酸序列(linker)分別與目標(biāo)蛋白連接. 重組好的基因

5、構(gòu)建入載體，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞. 兩段重組基因在細(xì)胞中融合表達(dá)，若目標(biāo)蛋白間存在相互作用，通過(guò)linker 牽引熒光蛋白的N 端片段與C 端片段就能夠相互靠近，進(jìn)而形成熒光蛋白生色團(tuán)重新發(fā)出熒光. 因此，在熒光顯微鏡下檢測(cè)是否有互補(bǔ)熒光產(chǎn)生，就可以推斷出兩目標(biāo)蛋白是否發(fā)生了相互作用。7Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC)8Bimolecular FluorescenceComplementation (BiFC)優(yōu)點(diǎn)：BiFC系統(tǒng)對(duì)儀器要求低、數(shù)據(jù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單,由于只是檢測(cè)熒光的有無(wú), 因而背景干凈, 檢測(cè)更加靈敏.重建后的熒光蛋白結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)還可以用于研究蛋白質(zhì)之間的弱相互作用或瞬間相互作用9BiFC技術(shù)的最大缺陷是多個(gè)BiFC 系統(tǒng)對(duì)溫度敏感. 溫度高時(shí),片段間不易互補(bǔ)形成完整的熒光蛋白. 一般在30 以下形成互補(bǔ)效應(yīng)好,溫度越低,越有利于片段之間的互補(bǔ),這就對(duì)研究細(xì)胞在生理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)相互作用帶來(lái)不利因素. 目前,只有基于venus、citrine 和cerulean 的3 個(gè)雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)可以在生理溫度條件下實(shí)現(xiàn)片段互補(bǔ)30 . 此外,BiFC 系統(tǒng)需要2 個(gè)熒光蛋白片段互補(bǔ),重新形成完整的活性蛋白以及發(fā)生熒