動物免疫學實驗技術-紅細胞免疫功能檢測技術

1、PAGE PAGE 4 第二十四章 紅細胞免疫功能檢測技術（Erythrocyte immune function detection technique）一、原理人和多種動物紅細胞與白細胞一樣，也具有重要的免疫功能。其基礎是紅細胞表面具有C3b受體（C3bR）。紅細胞可通過其表面的C3bR，發(fā)揮清除免疫復合物（IC）、促進吞噬、提呈抗原及激活補體等多種作用。因此，建立的檢測紅細胞免疫功能的各種方法，也多以紅細胞表面的C3bR為基礎設計的?，F(xiàn)已建立的主要有紅細胞C3bR 花環(huán)及IC花環(huán)試驗、紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗、單克隆抗體Coombs試驗、抗C3bR單克隆抗體法、ELISA、放射配體結

2、合法、紅細胞促吞噬作用測定法等。本實驗以紅細胞C3bR花環(huán)及IC花環(huán)試驗和紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗為例，介紹紅細胞免疫功能的檢測方法。C3bR酵母花環(huán)試驗用于檢測紅細胞C3bR，原理為用小鼠等血清（補體）致敏后的酵母菌，使菌體表面吸附C3b，可與紅細胞表面的C3bR結合，從而將酵母細胞吸附在紅細胞周圍形成花環(huán)。紅細胞IC酵母花環(huán)試驗用于檢測紅細胞表面的IC，原理為紅細胞表面的C3bR可與體內(nèi)形成的抗原抗體補體復合物種的補體成分結合，而將免疫復合物吸附在其表面，而酵母細胞也可與免疫復合物中的補體成分結合，從而被吸附于細胞表面形成花環(huán)。而紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗的原理為，葡萄球菌A蛋白能與

3、紅細胞膜上粘附的IC中的IgGFc片段相結合，而補體致敏的酵母菌能與紅細胞膜上未粘附IC的C3bR相結合，各自形成花環(huán)。紅細胞C3bR和免疫復合物花環(huán)率可作為紅細胞免疫粘附功能的指標，如二項指標都低下，判為原發(fā)性細胞免疫功能低下，為紅細胞C3b受體受到破壞和影響所致；如果紅細胞C3bR花環(huán)率低，而紅細胞IC花環(huán)率高，為繼發(fā)性紅細胞免疫功能低下，是由于循環(huán)免疫復合物增加，紅細胞粘附IC過多引起。紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗可同時顯示4種免疫功能狀態(tài)不同的紅細胞，SPA菌體花環(huán)為已全部被IC或抗RBC抗體粘附的紅細胞；酵母菌花環(huán)為未粘附IC或抗RBC抗體的紅細胞；混合花環(huán)為部分粘附IC或少許抗RB

4、C抗體，并且C3b受體有空位的紅細胞；裸紅細胞為未粘附IC或抗體，并且C3b活性低（不能粘附補體致敏酵母菌）的紅細胞。二、材料與試劑離心機、恒溫水浴箱、顯微鏡、計數(shù)器、小離心管、血細胞計數(shù)管。酵母試劑、Hanks液、豚鼠血清、動物抗凝血、姬姆薩氏染色液。金黃色葡萄球菌SPA陽性株為Cowan I （ATCC12598或NCTC8530），陰性株為Wood46株等。三、操作方法1紅細胞C3bR花環(huán)試驗（1）C3b致敏酵母懸液制備：將酵母試劑用Hanks液（含鈣、鎂、pH值7.2，下同）洗1次（1 000r/m離心10min），配成含酵母細胞1.00108/ml的懸液，加等量新鮮豚鼠血清，混勻，3

5、7水浴20min。然后再以Hanks液洗2次，恢復原濃度，即為C3b致敏酵母細胞懸液。酵母試劑用Hanks液洗滌后，配成1.00108/ml濃度，即為非致敏酵母懸液。（2）紅細胞懸液制備：將人或鼠、兔、牛、雞等被檢動物的肝素抗凝血，用Hanks液洗3次（每次以2 000r/min離心5min），最后將紅細胞用Hanks液稀釋成1.25107細胞/ml的懸液。（3）檢測方法：取C3b致敏酵母菌懸濁液和紅細胞懸液各50l，混勻，于37水浴40min后取出，輕輕搖起，加0.25%戊二醛溶液20l固定5min，用適量Hanks液稀釋，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆薩氏染色，高倍鏡檢查。2紅細胞IC酵母花環(huán)

6、試驗除酵母細胞不致敏外，其余同紅細胞C3bR花環(huán)試驗。3紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗 金黃色葡萄球菌SPA陰性和陽性菌的培養(yǎng)和懸液制備：以常規(guī)方法在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)金黃色葡萄球菌SPA陰、陽性菌，以Hanks液洗下，經(jīng)活菌計數(shù)使之達到6.25103個菌/ml即為菌懸液。 補體致敏酵母菌和紅細胞懸液的制備：同紅細胞C3bR花環(huán)試驗。 檢測方法：在小離心管內(nèi)加入上述待測細胞懸液50l，補體致敏酵母菌懸液50l混合，置37水浴30min，再加50l SPA陰、陽性菌懸液混勻，37水浴30min，取出水平涂片，姬姆薩氏染色，顯微鏡油鏡檢查。四、結果判定1紅細胞C3bR花環(huán)試驗和IC酵母花環(huán)試驗 以

7、1個紅細胞粘附2個或2個以上酵母細胞為1個花環(huán)，計數(shù)200個紅細胞，求出花環(huán)率。正常情況下，兩個試驗均會看到在紅細胞周圍粘附幾個酵母細胞形成的花環(huán)，且紅細胞C3bR花環(huán)率大大高于紅細胞IC酵母花環(huán)率。如正常情況下，人的兩種花環(huán)率分別為25%35%和3%8%，雞的兩種花環(huán)率分別為9%19%和3%6%。但發(fā)生各種傳染病及腫瘤性疾病時，兩種花環(huán)率會發(fā)生變化。2紅細胞SPA酵母混合花環(huán)試驗 紅細胞上粘附2個以上酵母菌為C3b花環(huán)；粘附10個以上SPA菌體為IC花環(huán)；同時粘附10個SPA菌和2個酵母菌以上者為混合花環(huán)；未粘附SPA菌體與酵母菌者為裸紅細胞。計數(shù)200個紅細胞，算出各自花環(huán)率。涂片染色后紅細胞為紅色，酵母菌為藍色，SPA菌體為小的淺藍色。五、注意事項1不同動物來源的補體對本試驗結果影響很大，因此檢測不同種屬來源的紅細胞，應采用不同動物的補體，如檢測人的紅細胞應用豚鼠血清作補體，檢測雞的紅細胞應以家兔血清作補體，檢測牛的紅細胞應以小鼠血清作補體，補體來源不對，很難形成花環(huán)。2補體血清及被檢紅細胞應現(xiàn)采現(xiàn)用，不能馬上使用的，可暫存于4冰箱內(nèi)，但一般不超過6小時。3試驗管從水浴中取出搖勻時，要