《植物生理生化》實驗指導(dǎo)

1、之阿布豐王創(chuàng)作時間：二 O二一年七月二十九日植物生理生化實驗指導(dǎo)（適用專業(yè)：農(nóng)學(xué)類相關(guān)專業(yè)）黑龍江八一農(nóng)墾年夜學(xué)植物科技學(xué)院生理生化教研室目錄生物化學(xué)實驗部份: TOC o 1-5 h z 實驗一、氨基酸的紙層析 1實驗二、卵白質(zhì)含量測定（設(shè)計性實驗） 5 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 實驗三、酶的基賦性質(zhì) 7實驗四、維生素C含量的測定 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 12實驗五、還原糖和總糖的測定 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 14實驗六

2、、淀粉酶活性的測定17實驗七、脂肪浸提一一索氏脂肪浸提法 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 20實驗八、一種簡單實用的提取植物 DNA勺方法22實驗九、聚丙烯酰胺電泳法測定年夜麥、小麥種子純度24實驗十、淀粉酶的誘導(dǎo)、提取和活性測定（綜合性實 TOC o 1-5 h z 驗 ）26植物生理學(xué)實驗部份： HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 實驗一、植物組織水勢的測定（小液流法） 28實驗二、植物傷流量的測定30實驗三、根系活力的測定 TOC o 1-5 h z 31實驗四、蒸騰強度的測定 HYPER

3、LINK l bookmark21 o Current Document 35實驗五、葉綠體色素的提取、分離、性質(zhì)和定量測定（綜合性實驗 ）37實驗六、光合強度的測定（改良半葉法）3 9實驗七、呼吸強度的測定 41實驗八、植物抗逆性的鑒定（電導(dǎo)儀法）43 實驗九、植物缺水水平的測定（脯氨酸法）45生物化學(xué)實驗部份實驗一氨基酸的紙層析一、目的：層析分析法已廣泛用于氨基酸、核酸、激素、維生素、糖類的分離與分析 . 其優(yōu)點是能夠分離與分析在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上極為相似的物質(zhì)；設(shè)備簡單 ，把 持容易，樣品用量很少，結(jié)果也較明確.本實驗的目的在于要求學(xué)生掌握紙層析法的一般原理和把持技術(shù).二、原理：紙層析法

4、是以濾紙作為支持物的分配層析法.分配層析法是利用物質(zhì)在兩種 分歧混合溶劑中的分配系數(shù)分歧，而達(dá)到分離的目的.通經(jīng)常使用a暗示分配系 數(shù).在一定條件下，一種物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個常數(shù).溶質(zhì)在靜止相的濃度（CJ 溶質(zhì)在流動相的濃度（C）層析溶劑是選用有機溶劑和水組成的.由于濾紙纖維素對水有較強的親和力 （紙上有很多-OH基與水以氫鍵相連）,吸附很多水分子，一般達(dá)濾紙重的22%生 右（其中約有6%勺水與纖維素結(jié)合成復(fù)合物），因此使這一部份水?dāng)U散作用降低 形成靜止相；而有機溶劑與濾紙的親和力很弱 ，可以在濾紙的毛細(xì)管中自由流動 便形成流動相.層析時，將濾紙一端浸入層析溶劑中，有機溶劑連續(xù)不

5、竭地通過點 有樣品的原點處，使其中的溶質(zhì)依據(jù)自己的分配系數(shù)在兩相間進行分配.分配的過程：一部份溶質(zhì)隨有機相移動離開原點而進入無溶質(zhì)區(qū)，并進行重新分配，即一部份溶質(zhì)從有機相又進入水相.隨著有機相不竭向前移動，溶質(zhì)不竭地在兩相 間進行可逆的分配，不竭向前移動.各種物質(zhì)因其分配系數(shù)的分歧，在兩相間分配 的數(shù)量也就分歧，分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中分配的數(shù)量多，向前移動的速度 快；而分配系數(shù)年夜的溶質(zhì)在靜止相中分配的數(shù)量多，移動的速度慢.所以各種溶質(zhì)在層析的過程中由于移動的速度分歧即可以彼此分開.移動速度一般用移動速率暗示Rf暗示：原點到層析點中心的距離f 原點到溶劑前沿的距離各種化合物在恒定條件下,

6、經(jīng)層析后都有其一定的 Rf 值 , 也就是說在層析譜中有一定的位置. 借此可以達(dá)到分離、定性、鑒另外目的 .Rf 值決定于很多的因素 , 其中最主要的是所分離物質(zhì)的分配系數(shù). 物質(zhì)的分配系數(shù)是由以下因素決定的：（ 1）物質(zhì)極性的年夜小 . 水的極性很強 , 一般極性強的物質(zhì)就容易進入水相 , 非極性的物質(zhì)易進入有機溶劑中.例如側(cè)鏈含-O即口-NT、-COO較多的氨基酸分 配在水相中，Rf值較小，而含非極性（如-CH）較多的物質(zhì)其分子的極性降低，Rf 值增年夜 .（ 2）濾紙的質(zhì)地以及為水分飽和的水平. 濾紙的質(zhì)地必需均一、純潔、厚薄適當(dāng) , 具有一定的機械強度, 層析前應(yīng)為水和有機溶劑的蒸汽所

7、飽和 .（3）溶劑的純度、pHfi和含水量.pH值和含水量的改變可使氨基酸和層析 TOC o 1-5 h z 溶劑極性改變,Rf 值也隨之改變.（ 4）層析的溫度和時間. 溫度改變使溶劑中有機相含水量改變,Rf 值也改變 .當(dāng)所有條件相同時，層析時間短，測Rf值的因素必需嚴(yán)格控制.三、實驗資料、儀器和試劑：1、實驗資料：在25溫箱中萌發(fā)2-3天的綠芽菜.2、儀器：（1）恒溫水浴一臺；（2）烘箱一個；（3）研缽一個；（4）三角瓶一個；（ 5）蒸發(fā)皿一個；（ 6 ） 50毫升分液漏斗一個；（ 7 ）量筒三個；（ 8）微量吸管（或標(biāo)有刻度的毛細(xì)管）；（9）電熱吹風(fēng)機一個；（10）層析缸及培養(yǎng)皿；（

8、11）層析濾紙；（12）小型噴霧器一個；（13）剪刀、刀片、鉛筆、尺子、玻棒、凡士林、點樣瓶.3、試劑：（1）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為0.01M,溶于10好丙醇中.第一組：天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸.第二組：鳥氨酸、甘氨酸、y -氨基丁酸、繳氨酸.第三組：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸.第四組：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺.第五組：胱氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、瓜氨酸、天門冬酰胺.（ 2）溶液系統(tǒng)：第一向：正丁醇：甲酸：水：（ 15： 3： 2, 體積） , 搖勻靜止備用 .第二向：苯酚：水（ 80： 20, 重量） . 配制方法：在分液漏斗中先計量加入少量

9、無離子水, 再加入一定量的新蒸餾的酚. 根據(jù)酚量補足應(yīng)加入的全部無離子水 , 這樣可防止因酚的冷凝而造成的溶解困難 . 充沛搖勻后靜止備用 . TOC o 1-5 h z 離子水：用于實驗中各種試劑配制.10%異丙醇：用于配制氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液.80%乙醇：取分析乙醇以無離子水稀釋.0.25%的水合茚三酮溶液.7）活性炭.8）石英砂.四、把持步伐：1、氨基酸的提?。喝⌒迈r的綠芽菜下胚軸2克, 加80%乙醇10毫升,加少量石英砂, 在研缽研成勻漿,移入三角瓶, 用少量80%乙醇淋洗研缽, 一并移入三角瓶, 加0.8克活性炭 , 置沸水浴中加熱至沸 1分鐘 , 取下冷卻 , 用濾紙過濾, 用少量80%乙

10、醇沖刷濾渣. 濾液收集在蒸發(fā)皿中置50-60水浴上蒸干 . 用1毫升10%異丙醇溶解, 收集樣液 , 準(zhǔn)備點樣.2、濾紙的準(zhǔn)備：單向?qū)游鰹V紙：取28 X 28厘米層析濾紙一張,在對應(yīng)的兩邊距每邊2厘米處，用鉛筆和直尺各劃一條平行于紙邊的直線, 其中一條為溶劑前沿達(dá)到標(biāo)識表記標(biāo)幟, 另一條為點樣線. 在點樣線上每隔2厘米劃一與點樣線垂直的短線,標(biāo)出五組標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和樣品的點樣位置雙向?qū)游鰹V紙：取28 X 28厘米層析濾紙二張,在距每邊2厘米處各劃一條平行于紙邊的直線, 以“井”字格下邊緣直線左端交點為點樣原點 , 原點右手為第一向 , 另一垂直方向為第二向 . 用一張作標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜, 另一張作樣

11、品圖譜.3、點樣：點樣時選用微量吸管或標(biāo)有刻度的毛細(xì)管（每小格1 微升） , 分別在每個點樣處精確點樣4微升. 必需在每一滴樣品干后再點第二滴. 為使樣品加速干燥, 可在有加熱裝置的點樣臺上進行, 或用吹風(fēng)機吹干, 樣點的直徑以 2-3 毫米為宜 , 點樣時溫度不能過高 , 否則會破毀氨基酸 . 將點好樣品的單向和雙向?qū)游鰹V紙均卷成筒形 , 在上、中、下三處系三道線, 但濾紙兩邊緣不能接觸. 為了消除鹽酸的干擾 , 防止拖尾現(xiàn)象, 可將層析濾紙放入盛有濃氨水的層析缸中熏10分鐘, 取出后在45烘箱中將氨驅(qū)凈, 再行層析 .4、層析：本試驗采納上層析法 .（ 1）單向?qū)游觯喝∵m當(dāng)年夜小的層析缸一

12、個, 缸底放一培養(yǎng)皿, 向培養(yǎng)皿內(nèi)加入第一向溶劑 ,液層厚約 1.5厘米 , 在培養(yǎng)皿上橫放兩根玻棒,取已點好的樣品的單向?qū)游鰹V紙以點樣端朝下放在盛有層析溶劑的層析缸內(nèi)的玻棒上 , 蓋上蓋子（濾紙切勿與溶劑接觸） . 平衡一小時, 然后將濾紙放入層析溶劑中 , 注意樣點不能進入溶劑 , 以免浸脫 . 將層析缸密封, 這時溶劑沿紙上升, 待溶劑前沿達(dá)到標(biāo)識表記標(biāo)幟線時, 立即取出 , 用吹風(fēng)機吹干或45下烘干, 然后顯色 .（ 2）雙向?qū)游觯喊瓷鲜鰡蜗驅(qū)游龇椒? 將點好標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的樣品的雙向?qū)游鰹V紙分別用第一向溶劑進行上行層析, 達(dá)到前沿標(biāo)識表記標(biāo)幟線時, 立即取出吹干溶劑, 減去溶劑前沿以外的

13、部份, 然后將紙轉(zhuǎn)90角 , 以同樣的方法用第二向溶劑進行上行層析, 當(dāng)溶劑前沿達(dá)到標(biāo)識表記標(biāo)幟時立即取出吹干或45下烘干,進行顯色.5、顯色：用噴霧器將0.25% 的茚三酮顯色劑均勻噴在層析濾紙上, 注意不要噴得過多 .用吹風(fēng)機吹干溶劑后 , 放在 60-65烘箱中烘30分鐘或用吹風(fēng)機吹熱風(fēng), 即能顯現(xiàn)各種氨基酸的色斑. 為了消除銨離子的影響 , 可在展開后在濾紙上噴1%的氫氧化鉀的無水乙醇溶液, 在60下堅持15分鐘, 以使全部氨完全揮發(fā)失落, 再行顯色 .五、結(jié)果與計算：單向?qū)游觯猴@色完畢后, 用鉛筆將各色譜的輪廓和中心點描繪出來, 然后量出由原點至色譜中心點和溶劑前沿的距離，計算出各種

14、已知和未知的色譜的Rf值 進行比力和鑒定. 各組已知氨基酸色譜順序由指導(dǎo)教師供給.雙向?qū)游觯篟f值有兩個數(shù)值組成，即要在第一向和第二向?qū)游鲋懈饔嬎阋淮? 根據(jù)Rf并借助各種氨基酸的特有顏色，分別與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸比較，即可鑒定為何種 氨基酸 .六、附注：色素含量不高的植物樣品 , 可不用活性炭處置.實驗二 卵白質(zhì)含量測定（設(shè)計性實驗）一、實驗?zāi)康奈覀儗⒅鸩礁淖儗嶒灲虒W(xué)都由實驗技術(shù)人員準(zhǔn)備實驗, 教師講解 , 學(xué)生照做的方法 , 盡量多給學(xué)生留下思考的時間和立異的機會. 在教師指導(dǎo)下, 查文獻(xiàn)、擬定實驗方案、調(diào)試儀器、配制藥品、處置數(shù)據(jù)、研究和解決實驗中呈現(xiàn)的問題 ,從失敗中獲得經(jīng)驗, 從勝利中獲得動

15、力 .卵白質(zhì)含量是農(nóng)產(chǎn)物品質(zhì)的重要指標(biāo)之一, 年夜豆、水稻等農(nóng)作物是農(nóng)業(yè)院校學(xué)生學(xué)習(xí)研究的最重要的生物資料. 農(nóng)作物品種及各個發(fā)育時期或分歧栽培條件下的生理生化指標(biāo)反映了其品種特性和生長的變動規(guī)律, 掌握這些生理生化指標(biāo)測定的方法對學(xué)生今后的科研實踐是非常需要的 . 在以往的實驗中 , 我們沒有開設(shè)這樣的實驗設(shè)計項目 , 使學(xué)生對生物化學(xué)實驗技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究方向的重要位置認(rèn)識不夠. 所以為了將基礎(chǔ)知識與專業(yè)技術(shù)更好地銜接, 使學(xué)生將生化基本實驗技能應(yīng)用于農(nóng)學(xué)專業(yè)的科研、管理, 很有需要開設(shè)此項實驗.本實驗通過比力分歧年夜豆 （或水稻等 ） 品種或同一品種各個發(fā)育時期或分歧栽培條件下的籽粒卵白質(zhì)含

16、量變動 , 來掌握測定原理, 學(xué)習(xí)測定方法, 并通過分析得出相應(yīng)結(jié)論. 提高學(xué)生對生物化學(xué)實驗技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究方向的重要位置的認(rèn)識；使學(xué)生將生化基本實驗技能應(yīng)用于農(nóng)學(xué)專業(yè)的未來科研工作中 .二、實驗室具備的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑等方面的條件儀器：電子天平、過濾裝置、移液管、滴定裝置、可見分光光度計、紫外分光光度計、離心機、水浴鍋、溫度計、烘箱、真空抽氣機、粉碎機、電爐子、實驗室經(jīng)常使用玻璃器皿；試劑：慣例化學(xué)、生物化學(xué)試驗的試劑均有, 如有特殊要求請說明；實驗資料：年夜豆粉、小麥、玉米等.三、整體要求要求學(xué)生認(rèn)真查文獻(xiàn)、擬定實驗方案、調(diào)試儀器、配制藥品、處置數(shù)據(jù)、盡量自力解決實驗中呈現(xiàn)的問題 , 需

17、要時與老師商量解決, 以達(dá)到熬煉提高的目的 .書寫陳說要認(rèn)真、條理清楚、整潔、對結(jié)果有客觀分析 .最后要有總結(jié)（自我評價），包括自力完成實驗的收獲、教訓(xùn)、注意事 項、實驗過程中遇到的問題及解決的方法等.實驗三酶的基賦性質(zhì)酶是生物體中具有催化功能的卵白質(zhì)，因此，也叫生物催化劑.生物體內(nèi)存在 多種多樣的酶，從而使生物體在溫和的條件下能夠迅速完成復(fù)雜的代謝過程 .所 以了解酶的基賦性質(zhì)，對揭示各種生化進程具有非常重要的意義.酶的高效性一、目的：通過本實驗認(rèn)識酶的催化效率比一般催化劑高.二、原理：酶作為一種特殊的催化劑，能年夜年夜降低反應(yīng)的活化能，從而極年夜地加 快了反應(yīng)速度.這在生理上具有極其重要的

18、意義.在生物體內(nèi)，某些代謝由于需氧 脫氫的結(jié)果而發(fā)生對機體有迫害作用的 HQ.過氧化氫酶能催化過氧化氫很快地 分解成隆5口 Q,使H2O不致在體內(nèi)年夜量積累.鐵粉也是過氧化氫分解的催化劑 但其催化效率僅為過氧化氫酶的100億分之一.三、實驗資料、儀器和試劑：.實驗資料：馬鈴薯.儀器：（1）試管：4支；（2）管架：1個；（3）研缽；（4）量筒：10 毫升X 1.試劑：（1）2%（2）鐵粉四、把持步伐呂勺項目12342%12G ( ml)3333生馬鈴署糜熟馬鈴署糜鐵粉現(xiàn)象解釋現(xiàn)象取4支試管,編號，按上表把持.酶的特異性(專一性)一、目的. 了解酶的特異性.掌握檢查酶的特異性的方法及其原理.二、原

19、理：酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是酶具有高度的特異性，即一種酶只能對 一種或一類化合物起催化作用.例如：蔗糖酶只能催化蔗糖的水解，而不能催化 淀粉的水解；而淀粉酶能催化淀粉水解，卻不能催化蔗糖水解.本實驗以蔗糖酶 和淀粉酶對蔗糖和淀粉的作用為例來說明酶的特異性 .三、儀器和試劑：.儀器：(1)研缽；(2)試管：6支；(3)試管架；(4)小燒杯；(5)刻度吸 管：1毫升X5,2毫升X1 ; (6)漏斗；(7)電熱恒溫水浴.試劑：1%淀粉溶液(含0.3%NaCD :將1克可溶性淀粉及0.3克氯化鈉，混懸 于5毫升蒸儲水中，攪動后緩慢倒入沸騰的60毫升蒸儲水中，攪動煮沸1分鐘.晾至 室溫后加水至1

20、00毫升，放置于冰箱貯存.2%蔗糖溶液：蔗糖是典范的非還原糖，若商品蔗糖中還原糖含量超越 一定標(biāo)準(zhǔn)，則呈還原性，這種蔗糖不能使用.所以，實驗前必需進行檢查.本實驗用 的蔗糖至少應(yīng)是分析純的試劑，要現(xiàn)用現(xiàn)配.(3)淀粉酶液：稀釋200倍的新鮮唾液.(4)蔗糖酶液：取1克新鮮酵母放入研缽中，加少量石英砂和蒸儲水，研磨 10分鐘左右，用蒸儲水稀釋至50毫升，靜止片刻再過濾，濾液即為蔗糖酶提取液.(5)本乃狄(Benedict )試劑：將17.3克硫酸銅溶解于100毫升蒸儲水中. 冷卻后稀釋至150毫升.取檸檬酸鈉173克及碳酸鈉(Na2c0r H2O) 100克，加水 600毫升，加熱使之溶解，冷卻

21、后，稀釋至850毫升.最后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸 檬酸鈉一碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如有沉淀可過濾.此試劑可長期保管.四、把持步伐:取6支試管編號，按下表把持:號 把持:i訃、1234561粉（ml）1112項糖(ml)111淀粉酶液 TOC o 1-5 h z 11(ml)蔗糖酶液11(ml)蒸儲水(ml)11反應(yīng)搖勻，放入37c水浴中保溫10分鐘木乃狄試劑 222222(ml)反應(yīng)搖勻，放入沸水加熱數(shù)分鐘結(jié)果解釋實驗現(xiàn)象溫度對酶活力的影響、目的:通過檢驗分歧溫度下淀粉酶的活性 確酶的最適溫度的概念.二、原理：，了解溫度對酶活性的影響，并進一步明酶的催化作用受溫度的影響很年夜.在一定溫度范圍

22、內(nèi)，隨著溫度的升高，酶 的熱變性不顯著，而酶促反應(yīng)速度增加，直至達(dá)到最年夜值.由于酶是一種卵白質(zhì) 溫渡過高會引起酶的急劇變性，招致酶失活，因此，反應(yīng)速度達(dá)到最年夜值以后， 隨著溫度的升高，反應(yīng)速度急劇下降，以至完全停止酶促反應(yīng).反應(yīng)速度達(dá)到最年 夜值時的溫度稱為酶作用的最適溫度.年夜大都植物酶的最適溫度為3740C ,植 物酶的最適溫度為5060C .本實驗以分歧溫度條件下淀粉酶作用于淀粉，并用碘液檢查酶促淀粉水解水 平，來說明溫度與酶活力的關(guān)系.三、儀器和試劑:1; （2）試管：3支；（3）.儀器：（1）刻度吸管：1毫升X2,2毫升X試管架；（4）恒溫水?。?個；（5）冰浴.試劑：1崛粉溶7

23、?。ê?.3%NaCD :配法如前.pH7.0磷酸鹽緩沖液：配法同前.（3）碘液四、把持步伐:冷卻70 c70 c31211解釋實驗現(xiàn)象.酶的激活和抑制、目的:了解酶促反應(yīng)的激活和抑制作用；學(xué)習(xí)激活劑和抑制劑影響酶促反應(yīng)的方 法和原理.、原理:酶的活力常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活力增加，稱為激活劑;有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱為抑制劑.值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕 對的，有些物質(zhì)在低濃度時為某種酶的激活劑，而在高濃度時則為該酶的抑制劑.例如，氯化納達(dá)到1/3飽和度時就可抑制唾液淀粉酶的活力 三、儀器和試劑:1.儀器:（1）試管：3支；（2）試管架；（3）漏斗；（4）燒杯；（5）刻

24、度吸管：1毫升X4,5毫升X1; （6）恒溫水?。唬?） 10毫升X 1四、把持步伐:1%NaC l（ml）蒸儲水（ml）1%CuSO （ml）唾液淀粉酶（ml）0.1 %淀粉（ml）取3支試管，按下表把持 TOC o 1-5 h z 121 111將上述各管試劑混勻33搖勻后放入37c水浴中彳溫反應(yīng)1分鐘左右，從1號試 保溫反應(yīng)檢驗淀粉水管取出1滴溶液置白瓷板上，用碘液檢查淀粉的水解水 解水平平,待試液不再變色時，取出所有試管.現(xiàn)象解釋現(xiàn)象實驗四維生素若量的測定、目的:維生素佻人類營養(yǎng)中最重要維生素之一，缺乏時會發(fā)生壞血病.水果、蔬菜 是供給人類維生素C的主要來源.通過對維生素C含量的測定，

25、可以了解果品質(zhì)量 的高低，并掌握這一測定方法.二、原理：利用染料2,6-二氯酚靛酚作氧化劑，可將還原態(tài)的維生素CM化成脫氫維生 素C,而染料自己被還原成無色的衍生物.2,6-二氯酚淀粉在酸性條件下呈紅色 在滴定終點之前，淌下的2,6-二氯酚淀粉立即被還原成無色.當(dāng)溶液從無色轉(zhuǎn)釀 成為紅色時，即為滴定終點.三、實驗資料、儀器和試劑:1、實驗資料：水果或蔬菜.2、儀器：(1)微量滴定管；500毫升X 1; (2)量瓶：50毫升X 2; (3) 三角瓶；500毫升X 2; (4)研缽；(5)量筒；(6)刻度吸管；10毫升X 2;3、試劑：1%鼻酸：秤取5.0克草酸溶于少量蒸儲水中，定容至500毫升.

26、2噂酸：秤取10.0克草酸溶于少量蒸儲水中，定容至500毫升.0.001N 2,6-二氯酚靛酚鈉溶液：稱取干燥的 2,6-二氯酚靛酚鈉60毫 克，放入200毫升量瓶中，加熱蒸儲水中100-150毫升，滴加0.01N NaOH4-5g,強烈 搖動10分鐘冷卻后加水至刻度.搖勻后用緊密濾紙濾于棕色瓶中，貯于冰箱中備 用，有效期一周.使用前需標(biāo)定(見附注).四、把持步伐:1、樣品的處置和提?。悍Q取4.0克新鮮樣品，至研缽中，力口5毫升2噂酸,研成勻漿.通過漏斗將樣品 提取液轉(zhuǎn)移到50毫升量瓶中.殘渣再用2%T酸提取2-3次,提取液及殘渣一并轉(zhuǎn)入 量瓶.2%草酸總、量為35毫升，最后以水定容.溶液定容

27、時若泡沫較多，可加幾滴乙 醇消除泡沫后再定容.搖勻，過濾，濾液備用.2、樣品的測定：吸取濾液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定 至呈現(xiàn)明顯的紅色，并在15秒內(nèi)不用失為止.記錄所用滴定液體積.3、空白測定：在另一 50毫升三角瓶內(nèi)，放入35毫升2噂酸,并用1噂酸定溶，搖勻，取此液 10毫升放入另一 50毫升三角瓶內(nèi)，用2,6-二氯酚靛酚鈉滴定至終點，記錄染料用 量.結(jié)果與計算：V1V2K VW V3100X: 100克樣品所含維生素Ct克數(shù)(毫克/100克)W稱取樣品重(克)1:滴定樣品所用染料毫升數(shù)2:滴定空白所用染料毫升數(shù):樣品提取液稀釋之總體積（即50毫升）

28、K: 1毫升染料液所能氧化維生素C之毫克數(shù)，可由標(biāo)定算出 六、附注：2,6-二氯酚靛酚鈉溶液的標(biāo)定：準(zhǔn)確稱取維生素 C2di克，用1%茸酸溶 解定容至200毫升.吸取此液10毫升，以1%葉酸再次稀釋定容至200毫升.吸取此液 10毫升，放入50毫升三角瓶中（同時吸取10毫升1%口酸于另一個50毫升三角瓶中 做空白對比立即用所要標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚鈉滴定至粉紅色呈現(xiàn)15秒不用失， 記錄所用毫升數(shù)，按下式計算Kfi （即1毫升染料所能氧化抗壞血酸的毫克數(shù)）.G1010K200200V（式中：G為稱取維生素 C的毫克數(shù).V為滴定10毫升標(biāo)準(zhǔn)維生素 C時所用去染料的毫 升數(shù)，與滴定空白所用毫升數(shù)之

29、差值 ）把持要盡可能快，并防止與鐵銅器具接觸，以減少維生素。勺氧化.草酸及樣品的提取液防止日光直射.當(dāng)樣液自己帶色時，測定前于提取液中加2-3毫升二氯乙烷.在滴定過 程中當(dāng)二氯乙烷由無色變粉紅色時，即達(dá)終點.實驗五還原糖和總糖的測定一、目的：掌握還原糖和總糖定量測定的基來源根基理，學(xué)習(xí)比色定糖法的基本把持， 熟悉721型分光光度計的使用方法.二、原理：各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖.利用溶解度分歧，可將 植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖完全水解成有還原性的單糖.在堿性條件下，還原糖將3,5-二硝基水楊 酸還原為3-氨基-5-硝基水楊

30、酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它 產(chǎn)物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)深淺的水平呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光值,核對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，即可分別求出樣 品中還原糖和總糖的含量.多糖水解時，在單糖殘基上加了一分子水，因而在計算中須扣除已加入的水量，測定所得的總糖量乘以0.9即為實際的總糖量三、實驗資料、儀器和試劑1、實驗資料：面粉.2、儀器：(1) 25ml血糖管或刻度試管X 11; (2)年夜離心管或玻璃漏斗 X2; (3)燒杯：100mlX1； (4)三角瓶：100mlX1； (5)容量瓶：100mIX 3; (6)刻度吸管：1mlX11、2m1X4

31、、10mlX1； 恒溫水浴；(8)沸水?。?9) 離心機(過濾法不用此設(shè)備)；(10)電子天平；(11)分光光度計；3、試劑：(1)1mg/m1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取 100 mg分析純葡萄糖(預(yù)先在80 C烘 至衡重)，置于小燒杯中，用少量蒸儲水溶解后，定量轉(zhuǎn)移至100ml的容量瓶中，以 蒸儲水定容至刻度，搖勻，冰箱中保管備用.(2)3,5-二硝基水楊酸試劑：將 6.3g 3,5-二硝基水楊酸和262ml 2NNaOH溶 液，加到500ml含有185g灑石酸甲鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉， 攪拌溶解.冷卻后加蒸儲水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用.(3)碘-碘化鉀溶液：稱

32、取5g碘和10g碘化鉀，溶于100ml蒸儲水中.(4)酚丈指示劑：稱取0.1g酚幅 溶于250ml 70%乙酉|中.(5)6NHCl(6)6NNaOH四、把持步伐1、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7支具有25ml刻度的血糖管或試管，編號，按下表所示的量，精確加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和 量項目葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)蒸儲水(ml)012345600.20.40.60.81.01.22.01.81.61.41.21.00.81.51.51.51.51.51.51.53,5-二硝基水楊酸試劑.3,5-二硝基水楊酸試劑(ml)將各管搖勻，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻 至室

33、溫，再以蒸儲水定容至25ml刻度處，用橡皮塞塞住管口，倒置混勻(如用年夜試管,則向每管加入21.5ml蒸儲水，混勻).在540nms長下,用0號管調(diào)零,分別讀 取1-6號管的消光值.以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.2、樣品中還原糖和總糖的測定：(1)樣品中還原糖的提?。簻?zhǔn)確稱取2g食用面粉，放在100ml的燒杯中，先以少量的蒸儲水調(diào)成糊狀，然 后加50ml蒸儲水，攪勻，置于50。叵溫水浴中保溫20分鐘，使還原糖浸出.離心或 過濾，用20ml蒸儲水洗殘渣,再離心或過濾，將兩次離心的上清液或濾液全部收集 在100ml的容量瓶中，用蒸儲水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液.(2

34、)樣品中非還原糖的水解和提?。簻?zhǔn)確稱取1 g食用面粉，放在100ml的三角瓶中，加入10 ml 6NHC1及15ml蒸 儲水，置于沸水浴中加熱水解30分鐘.取12滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化 鉀溶液，檢查水解是否完全.如已水解完全，則不顯藍(lán)色.待三角瓶中的水解液冷 卻后，加入一滴酚吹指示劑，以6NNaOH和至微紅，過濾，再用少量蒸儲水沖刷三 角瓶及濾紙，將濾液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸儲水定容至刻度，混勻.精 確吸取10ml定容過的水解液，移至另一 100ml的容量瓶中，定容，混勻，作為總糖待 測液.(3)顯色和比色：取5支25ml刻度的血糖或刻度試管，編號，按下表所示的量，精

35、確加入待測 液和試劑.數(shù)量、 管還原糖測定管號總糖測定管號 項目.還原糖待測液(ml)2總糖待測液(ml)0蒸儲水(ml)03,5-二硝基水楊酸試劑1.5 (ml)IRm2000011001121.51.51.51.5加完試劑后，其余把持均與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線是相同，測定各管消光值.五、結(jié)果與計算:以管、的消光值平均值和管I、n的消光值的平均值 ,分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù).按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量這卅件加/曰、才盾麻告擊 加 惻定時取用體積查曲線所得還原糖量克 數(shù)4工人=一還原糖（）總糖（）提取液總體積dnno/樣品毫克數(shù)100%查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)稀釋倍數(shù)0.

36、9 100%樣品是克數(shù)六、附注:1、用血糖管比年夜試管方便.2、離心比過濾易得精液.3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進行，一起顯色和比色.實驗六淀粉酶活性的測定一、目的：植物中的淀粉酶能將貯藏的淀粉水解成麥芽糖.淀粉酶幾乎存在于所有植物中,其中以禾谷類種子的淀粉酶活性最強.植物中有a -淀粉酶及B -淀粉酶，具活 性因植物的生長發(fā)育時期分歧而有所變動.本實驗的目的在于掌握分別測定這兩 種淀粉酶的方法.二、原理：a -淀粉酶及B -淀粉酶，各有其一定的特性，如B -淀粉酶不耐熱，在高溫下 易鈍化而a -淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發(fā)生鈍化，通常提取液同時有兩種淀 粉酶存在，測按時，可根

37、據(jù)它們的特性分別加以處置，鈍化其中之一，即可測出另 一酶的活性.將提取液加熱到70c維持15分鐘以鈍化B -淀粉酶，即可測定a -淀 粉酶的活性.或者將提取液用pH3.6之醋酸在0 c加以處置，鈍化a -淀粉酶的活性, 以測出B -淀粉酶的活性.淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸 試劑測定.由于麥芽糖能將后者還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸的顯色基團，在一 定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的深度成正比，故可求出麥芽糖的含量，以麥芽糖的毫克數(shù)暗示淀粉酶活性的年夜小.三、實驗資料儀器及試劑：1、實驗資料：萌發(fā)的小麥（芽長1厘米左右）2、儀器：（1）小臺秤；（2）研缽；（3）容量瓶：100

38、毫升X 1; （4）具 塞刻度試管25毫升X 13; （5）試管：8支；（6）刻度吸管：1毫升X2,2毫升X 2；（ 7）離心機；（8）恒溫水?。唬?9）分光光度計.3、試劑：1%淀粉溶液；0.4 N NaOH；pH5.6的檸檬酸緩沖液：A、稱取木?檬酸20.01克，溶解后稀釋至1升； B、稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后稀釋至1升.取A?夜13.7毫升與B26.3毫升混勻, 即為pH5.6之緩沖液.3,5-二硝基水楊酸：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1克溶于20毫升1N 氧化鈉中 , 加入50毫升蒸餾水, 再加入30克酒石酸鈉, 待溶解后 , 用蒸餾水稀釋至100毫升 , 蓋緊瓶塞 , 勿使二

39、氧化碳進入.（5）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱取麥芽糖0.100克溶于少量蒸餾水中 ,仔細(xì)移入 100毫升容量瓶中 , 用蒸餾水稀釋至刻度.四、把持步伐：1、酶液的提?。悍Q取 2克萌發(fā)的小麥種子（芽長1 厘米左右） , 至研缽中加一克石英砂, 磨成勻漿倒入25毫升具塞刻度試管中, 用蒸餾水稀釋至刻度, 混勻后在室溫（ 20）下放置 , 每隔數(shù)分鐘震蕩一次, 放置 15-20分鐘 , 離心 , 取上清液備用 .2、a-淀粉酶活性的測定：（ 1）取試管4支 , 注明兩支為測定管.（ 2）于每管中各加酶提取液1毫升 , 在 70恒溫水浴中（水溫度的變動不應(yīng)超越0.5 C）準(zhǔn)確加熱15分鐘，在此期間B -淀粉酶受

40、熱而鈍化，取出后迅速在 自來水中冷卻 .（3）在試管中各加入1毫升pH5.6檸檬酸緩沖液.（4）向?qū)Ρ裙苤屑尤?毫升0.4N氫氧化鈉，以鈍化酶的活性.（5）將測定管和對比管置40（0.5 ）恒溫水浴中保溫15分鐘 , 再向各管分別加入40下預(yù)熱的淀粉溶液2 毫升 , 搖勻 , 立即放入40水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘后取出，向各測定管迅速加入4毫升0.4N氫氧化鈉，以終止酶的活動，然后準(zhǔn)備下步糖的測定.3、 a-淀粉酶及B -淀粉酶總活性的測定:取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸儲水稀釋至100毫升（稀釋水平視 酶活性年夜小而定）混合均勻后，取4支試管，各加入稀釋之酶液1毫升及1毫升 pH5.6

41、之檸檬酸緩沖液.以下步伐重復(fù)a -淀粉酶的第（4）及（5）的把持，同樣 準(zhǔn)備糖的測定.4、麥芽糖的測定：（1）取25毫升刻度試管7個，編號，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1毫克/毫升） 0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻， 用蒸儲水稀釋至25毫升，用分光光度計在520nmfe長下進行比色，記錄消光值,以 消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.（2）樣品的測定：取以上各管中酶作用后的溶液及對比管中的溶液各2毫升，分別放入25毫升具塞刻度試管中，再加入2毫升3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻, 置沸水中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸儲水稀釋至

42、25毫升，混勻.用分光光度計 在520nms長下進行比色，記錄消光值,從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然 后進行結(jié)果計算.五、結(jié)果計算:淀粉酶水解活性麥芽糖（毫克）/鮮種（克）5分鐘（A-Am品?釋總體積 樣品重（克）C（）-淀粉酶總活性麥芽糖（毫克）/鮮種（克）5分鐘（B 1）/吁釋總體積樣品重（克）Ca -淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值）A a -淀粉酶的對比管中麥芽糖量B（a+B）-淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量（a+B）-淀粉酶的對比管中麥芽糖量比色時所用樣品液毫升數(shù)實驗七脂肪浸提一一索氏脂肪浸提法、目的:學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪提取的原理和測定方法.二、原理：用脂肪溶劑將

43、脂肪從樣品中浸提出來, 然后將溶劑蒸發(fā)除去, 稱取瓶中殘留 TOC o 1-5 h z 物的重量或稱量樣品損失的重量, 即可求出樣品中粗脂肪的含量.在測定樣品含油量時 , 通常采納沸點低于60的有機溶劑作為脂肪溶劑（ 如乙醚和沸點為30至60的石油醚） 所提取的脂溶性物質(zhì)為脂類物質(zhì)的混合物 ,其中含有脂肪、游離脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有機酸等,因此稱為粗脂肪.三、實驗資料、儀器和試劑：1、實驗資料：（ 1）待測植物樣品；（2）濾紙筒.2、儀器：（1）蘭氏脂肪浸提儀；（2）電熱恒溫水??；（3）分析天平.3、試劑：（1）乙醚 .四、把持步伐：1、儀器的裝置：將索氏脂肪浸提取儀的冷

44、凝管及脂肪接受瓶的磨砂玻璃接口處用鉛筆編號,洗凈烘干 . 脂肪接受瓶放入干燥器內(nèi)冷卻后稱取空瓶質(zhì)量, 仍放回干燥器內(nèi)備用 .將冷凝器用鐵駕臺卡夾裝置在加熱用的電熱恒溫水浴上 , 裝牢 . 在冷凝器的進出 水口分別裝上橡膠管, 通向冷凝器內(nèi)蛇型管的短管為進水口 , 通向外層的短管為出水口 .2、樣品的稱?。喝V紙筒（25力70毫米）截成35毫米的長度，用鉛筆編號，兩邊對稱的夾上 一個回形針, 留出一段鐵環(huán)作掛鉤用 . 在分析天平上稱取空濾紙筒的重量, 加入經(jīng)1 毫米篩孔制備的樣品 2 3克 , 稱準(zhǔn)其重量, 再向濾紙筒塞入脫脂棉一小塊, 防止樣品散失, 將已加入樣品的濾紙筒放在一個小燒杯內(nèi) ,

45、然后放入90的真空干燥烘箱內(nèi)烘56 小時 , 取出放入干燥器內(nèi)冷卻備用 .3、脂肪的浸提：將濾紙筒掛在冷凝器內(nèi)固定在桿下真?zhèn)€鉤子上, 再將脂肪瓶加入無水乙醚70毫升 , 套在冷凝器下面的磨口上. 把裝好冷凝器的脂肪瓶放在預(yù)先調(diào)好溫度（ 50-60）的電熱水浴上. 松開固定桿上的止水夾 , 將濾紙筒浸入乙醚內(nèi) , 開放冷凝水閥門 , 注意乙醚煮沸的情況, 要求回流速度適當(dāng) , 不成太快 , 以免冷凝不及乙醚在冷凝器上部逸失.濾紙筒內(nèi)樣品經(jīng)熱沸的乙醴浸提 20分鐘后，提起濾紙筒把持桿 至最高位置，冷凝后的乙醴自溢流管流入，裝滿濾紙筒，使之淋洗濾紙筒上部的筒 壁，然后從乙醴逐步回收管回收乙醴,直至脂

46、肪接受瓶中的乙醴完全蒸發(fā)干為止. 關(guān)閉電源，關(guān)上冷凝水的閥門.4、脂肪瓶的干燥和濾紙筒乙醴的回收：脫下脂肪瓶，用綢布擦去手摸的痕跡及沾上的灰塵，放入90c的直空干燥箱 內(nèi)烘45-60分鐘后取出放入干燥器內(nèi)，冷卻半個小時后稱重.濾紙筒脫離掛鉤后立 即放入一個空的脂肪瓶內(nèi)，一個脂肪瓶可以同時放入4-8個,套上冷卻器，開放冷 卻水，翻開水浴電源回收乙醴.五、計算結(jié)果：粗脂肪浸提前脂肪瓶重后脂月加重一 100% 樣品重六、附注:乙醴易燃，把持時應(yīng)特別注意，加乙醴時不要翻開電門，脂肪瓶與冷凝器的結(jié) 合必需吻合，不能漏氣,脂肪浸提儀附近不能有明火閃動.乙醴試劑瓶應(yīng)遠(yuǎn)離加熱 器.實驗八一種簡單實用的提取植物

47、DNA勺方法一、目的與原理：植物DNA勺提取是植物分子生物學(xué)和基因工程研究的一種基本的技術(shù)，至今已有了數(shù)種方法.此方法最年夜的特點是：將SDSC時用作細(xì)胞膜的去污劑和卵 白質(zhì)的變性劑，變性的卵白質(zhì)通過離心而不是酚抽提除去 ，使得整個把持過程變 得簡單快捷，比力溫和，1小時左右就可以獲得純化的植物 DNA用這種方法獲得的 DN南昌直接被限制Tt內(nèi)切酶酶解，純度較高，適用于分子生物學(xué)的研究.本實驗的 目的是掌握DNAM取的原理和方法.二、資料與方法：1、植物資料：螺旋藻(Spirulina platensis )、水稻(Oryza sativa ) 和煙草(Nicotianatabacum ).2

48、、試劑和溶液：(1) 20X SSC 3mol L-1 檸檬酸鈉，pH8.0 :(2)溶菌酶、10g N1Rnas8 10%SDS均為Sigma物)；( 3)酚：氯仿：異戊醇=25： 24： 1(4) TE: 10mmol L-1Tris-HCL、1mmol- L-1EDTA,pH7.6.3、提取步伐：收集對數(shù)生長期的螺旋藻細(xì)胞，懸浮于5倍體積(v/w)含2mg mL-1溶菌酶 的20XSSCfr，室溫堅持10分鐘，偶爾搖動混勻.水稻幼苗和煙草嫩葉在液氮中研 磨成粉狀后，立即用5倍體積的20XSS(浮，并輕輕拌勻.上述懸浮液在冰上先放 置3分鐘，然后加入10% SDS1終濃度為2%,混勻；繼續(xù)

49、放置10分鐘后，在4 c用 11000X g離心15分鐘.上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并用相同體積的TEW釋，再加 入RNaseS終濃度為10g - ml-1,室溫放置30分鐘.11000 X g離心15分鐘，所得的 DNAC淀用70%勺乙醇洗兩次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于適量的TEt. 三、結(jié)果與討論：利用本方法，從煙草、水稻和螺旋藻中提取了 DNA因為整個過程的把持步伐 較少，也較溫和，減少了 DNAS弄斷白機會，所以所得的DN酚子量較年夜，年夜部 份都比完整的入噬菌體的 DNA (48.5Kb)還年夜.另外，用此方法所提的DNA勺 OD260/OD280比值1.8至1.9之間，并能

50、被限制性內(nèi)切酶酶切，顯示有較好的純度.在使用本方法時，須注意下面的幾個問題.當(dāng)20XSSC勺懸浮液中加入SDSS 2%后 , 溶液中會呈現(xiàn)白色絮狀物質(zhì), 標(biāo)明卵白質(zhì)已經(jīng)變性, 這是本方法的主要特點之一 . 它通過變性后離心而不是經(jīng)常使用的屢次酚抽方法 , 將絕年夜部份的卵白質(zhì)除去.離心所得的上清液，需要用TEB釋，這是因為溶液中的鹽濃度較高，如不 稀釋,RNase就無法起作用；而且在沉淀DNAt如用乙醇會將溶液中的鹽析出，如 用異戊醇則形成兩相的界面, 將溶液中鹽的濃度降低后 , 就解決了這些問題. 可是 ,加年夜稀釋TE勺體積，對DNA勺產(chǎn)量并沒有非常明顯的作用，用等體積的T麗釋即 可.DN

51、Att提7經(jīng)RNase解后，再用酚：氯仿：異戊醇抽提一次，用以除去剩余的 卵白質(zhì)和酶.本方法適用于年夜量和微量的DNAJ備.年夜量制備時，RNase酶解和 酚：氯仿：異戊醇的抽提步伐可以在 DN膿縮一些后再使用，這樣就較便于把持， 而且節(jié)省RNas前酚.通常，用這種方法能從每克新鮮組織中提取到 10至15仙g的 DNA.實驗九聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定年夜麥、小麥種子純度一、目的：本實驗采納聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù), 提取分離種子中的卵白質(zhì), 根據(jù)分歧品種的卵白質(zhì)譜帶與標(biāo)準(zhǔn)譜帶的不同 , 可鑒定出品種的真實性和純度. 本實驗?zāi)康氖钦莆站郾０冯娪镜脑?、實驗方法以及此方法在種子鑒定中的應(yīng)用 .二

52、、原理：從種子中提取的醇溶卵白在凝膠的分子篩效應(yīng)和電泳分離的電荷效應(yīng)作用下獲得良好的分離, 通過顯色顯示卵白質(zhì)譜帶類型. 分歧品種由于遺傳組成份歧,種子內(nèi)所含的卵白質(zhì)種類有不同 , 這種不同可利用電泳圖譜加以鑒別 , 從而對品 種真實性和純度進行鑒定.三、儀器和試劑：1、儀器：電泳儀（滿足穩(wěn)壓500V）、離心機、垂直板電泳槽、鉗子、5ml、10ml移液管、微量進樣器、聚丙烯離心管.2 、試劑：尿素, 乙醇 , 甘氨酸 , 甲基綠 , 三氯乙酸 , 冰乙酸 , 過氧化氫 , 硫酸亞鐵，抗壞血酸，a-氯乙醇.3、藥劑配制：（ 1）卵白質(zhì)提取液：小麥：0.05克甲基綠溶于25毫升a -氯乙醇中，加蒸

53、溜水至100毫升.高溫保 管.年夜麥：0.05克甲基綠溶于20毫升a -氯乙醇中，加入118克尿素，再加入1毫 升B -琉基乙醇，加蒸溜水至100毫升.高溫保管.（2）電泳緩沖液：0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解, 加4毫升冰乙酸, 定容至 1000毫升 . 高溫保管 .（3）凝膠緩沖液：1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解, 加20毫升冰乙酸, 定容至1000毫升 . 高溫保管 .（4）0.6%過氧化氫：30%過氧化氫2毫升 , 加蒸溜水至100毫升 . 高溫保管 .（ 5）染色液：0.25克考馬斯亮藍(lán)加25毫升無水乙醇溶解, 加入50克三氯乙酸 , 加水至500毫升 .（6）凝膠液：丙烯酰胺20克, 甲叉

54、雙丙烯酰胺0.8克, 尿素12克, 硫酸亞鐵0.01 克, 抗壞血酸 0.2克, 用凝膠緩沖液溶解并定容至200毫升 . 高溫保管 .四、實驗步伐：1、樣品提取：一般每個樣品測定100粒種子 , 若更準(zhǔn)確地估測品種純度, 則需更多的種子.如果分析結(jié)果要與某一純度的標(biāo)準(zhǔn)值比力 , 可采納順次測定法（ sepuentialtesting ）來確定 , 即50粒作為一組, 需要時刻連續(xù)測定命組, 以減少工作量. 如果只鑒定真實性, 可用 50粒 .取小麥或年夜麥種子, 用鉗子逐粒夾碎（夾種子時最好墊上小片清潔的紙,以便于清理鉗頭和防止樣品之間的污染） , 置1.5毫升離心管中 , 加入卵白質(zhì)提取液（

55、小麥 0.2毫升 , 年夜麥 0.3毫升）充沛搖動混合,在室溫下提取24小時, 然后在18000 X g條件下離心15分鐘.取其上清液用于電泳.2、凝膠制備：從冰箱中取出凝膠溶液和過氧化氫液, 吸取 10毫升凝膠溶液, 加1滴0.6%過氧化氫 , 搖勻后迅速倒入封口處, 稍加搖動 , 使整條縫口布滿膠液, 讓其在 5-10 分鐘聚合封好 .吸取 45毫升凝膠溶液, 加 3滴0.6%過氧化氫, 迅速搖勻 , 倒入凝膠板之間 , 馬上插好樣品梳 , 讓其在 5-10分鐘內(nèi)聚合.3、進樣：小心抽出樣品梳, 將玻璃板加在電泳槽上, 用濾紙或注射器吸取樣品槽中過剩的水分，然后用微量進樣器吸取10-20川

56、樣品加入樣品槽中.4、電泳：在前后槽注入電極液, 前槽接正極 , 后槽接負(fù)極 . 然后翻開電源 , 逐漸將電壓增到500Vt泳時，要求在15-20 C溫度下進行.電泳時間一般為60-80分鐘,具體時間可按甲基綠遷移時間來推算, 電泳時間為甲基綠移至前沿所需時間的 2-2.5 倍.5、染色：將膠板小心的取下, 在染色液中染色1-2 天. 一般情況不需要脫色, 但為使譜帶清晰 , 可用清水沖刷 .五、鑒定：譜帶命名可采納相對遷移率法 , 或電泳程式法. 根據(jù)醇溶卵白譜帶的組成和帶型的一致性, 并與標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳圖譜比力, 堅定種子真實性以及測定品種純度.實驗十淀粉酶的誘導(dǎo)、提取和活性測定（綜合性實驗

57、）一、實驗原理年夜麥（或小麥）種子萌發(fā)時，種胚發(fā)生GAT散到胚乳的糊粉層細(xì)胞（被 稱為GAS應(yīng)的“靶細(xì)胞”）,安慰其合成或激活a -淀粉酶,然后進入胚乳，使貯 藏的淀粉被水解為還原酶，因此，無胚種子不能釋放GA也不能形成與激活a -淀 粉酶.外加的GA也可取代胚白釋放作用,從而誘導(dǎo)a -淀粉酶的合成.在一定范圍 內(nèi)，由去胚的吸脹年夜麥發(fā)生的還原糖量，與外加GA濃度的對數(shù)成正比，由此可說明GAt a -淀粉酶的誘導(dǎo)形成.二、資料與用品1、資料：年夜麥（或小麥）種子；2、儀器：721分光光度計；超凈工作臺（或滅菌箱）；溫箱；搖床；恒溫水?。桓邏簻缇?；棉塞；牛皮紙；刀片；鑷子；燒杯；培養(yǎng)皿；試管；

58、移液管；玻璃棒.3、藥品：10-3mol/L乙酸緩沖液（pH 4.8）每ml含鏈霉素硫酸鹽1mg （或氯 霉素40 Ng）、10 mg/L GA10 mg,加少量95吆醇溶 解，用蒸 儲水 定容至 1000ml、淀粉溶液（稱取可溶性淀粉 0.67g和KHPO0.82g溶于20 ml蒸儲水中不 竭攪拌下加到70ml沸水中，最后加水定容至100ml）、12- KI溶液（稱取I2 0.06g 和 KI 0.6g,溶于 0.05mol/L HCL 溶液 1000ml中）、5%g白粉?液（ WN）、5% WSO溶液（WN）、滅菌水、石英砂.三、方法與步伐1、資料準(zhǔn)備選擇對GA敏感、萌發(fā)高、年夜小一致的小

59、麥種子，用50% HSO浸泡2h,取出 后, 用自來水沖刷約20次, 然后用力揉搓除去穎殼；用刀片將種子橫切近于等長的兩半 , 使成無胚的半粒和有胚的半粒, 各150粒分裝與兩個小燒杯內(nèi), 用5%漂白粉溶液消毒 15min, 在無菌條件下倒失落漂白粉溶液, 用無菌水洗5次 . 然后將無胚與有胚的半粒種子放于內(nèi)裝一層石英沙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi) , 倒入剛好浸沒種子的無 菌水 , 將培養(yǎng)皿置于25度溫箱中吸漲24-48 h.2、GA系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置取干潔試管5支（編號）,各加蒸儲水9ml,向1號管加GA母液1 ml,混勻后吸 出 1 ml 加到 2號管內(nèi)；2號管混勻后吸出1 ml 加到 3號管內(nèi)；

60、依次稀釋, 于是依次配成 0.101 mg/L、10-2 mg/L、103 mg/L、104 mg/L、105 mg/L 的 GA系列濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液 . 再取干潔試管8 支（ 0-7 號） , 按表加入各種試液也資料（燒杯中吸脹的半粒年夜麥種子）,與25度下振蕩保溫24 h,過濾（或離心）,濾液（或上清 液）備用.3、a-淀粉酶活性測定取干潔試管8支（0-7號），分別加入蒸儲水0.8 ml和淀粉溶液1 ml,再按號 加入半粒種子保溫濾液（或上清液）0.2 ml混勻，于25度恒溫水浴中準(zhǔn)確計時保溫10 min （適宜的時間由預(yù)備試驗確定，即以1mg/L GA的反應(yīng)液與碘試劑反應(yīng)， 以。曲達(dá)到0.