酶活性濃度測(cè)定技術(shù)

1、關(guān)于酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)第一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié)酶活性濃度的測(cè)定技術(shù) 第二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月體液中酶的測(cè)定是臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。二十世紀(jì)50年代人們用分光光度法建立了連續(xù)監(jiān)測(cè)酶活性濃度方法，到60年代特別是80年代以后，由于各種工具酶和酶分析試劑盒的生產(chǎn)與普及，自動(dòng)和半自動(dòng)生物化學(xué)分析儀的引進(jìn)和應(yīng)用，使得各種體液酶的測(cè)定在方法學(xué)與臨床應(yīng)用方面有了長(zhǎng)足的進(jìn)步與發(fā)展。第三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、概 述正常人血中大部分酶一般在pg（10-12克）到ng（10-9克）水平，要直接測(cè)定這種微量酶蛋白是十分困難的。常用的

2、酶學(xué)測(cè)定方法則利用酶有加速化學(xué)反應(yīng)（催化）的特性，通過(guò)測(cè)定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)計(jì)算酶活性濃度的高低。這種 濃度的確切名稱(chēng)是“酶的催化活性濃度” 或簡(jiǎn)稱(chēng)為“酶活性濃度”。第四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月按監(jiān)測(cè)方法分類(lèi)可分為量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法和其他方法。以分光光度法最為常用。第五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1量氣法 測(cè)定原理是通過(guò)測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計(jì)算出氣體的變化量。適用于測(cè)定那些在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶，如氧化酶反應(yīng)涉及氧氣的消耗，脫羧酶會(huì)產(chǎn)生二氧化碳等。

3、此法操作煩瑣，靈敏度低且技術(shù)要求高，臨床實(shí)驗(yàn)室很少采用。第六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2分光光度法 從50年代起采用分光光度法取代比色法，其最大優(yōu)點(diǎn)在于擴(kuò)大了測(cè)定范圍，波長(zhǎng)范圍更寬。酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見(jiàn)光范圍測(cè)定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長(zhǎng)范圍測(cè)定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無(wú)色物質(zhì)。第七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)合各種工具酶的偶聯(lián)反應(yīng)，如應(yīng)用NAD(P)H和NAD(P)吸收光譜差異建立的測(cè)定各種脫氫酶活性濃度的方法，使分光光度法得到了進(jìn)一步發(fā)展，幾乎可應(yīng)用于各種血清酶活性的測(cè)定。隨著各種自動(dòng)生物化學(xué)儀和配套用試劑盒的

4、普及應(yīng)用，這一方法在臨床酶學(xué)測(cè)定中起著十分重要的作用。第八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3熒光法和放射性核素法 對(duì)于一些酶濃度很低的標(biāo)本，用普通的分光光度法往往測(cè)不出來(lái)，此時(shí)可考慮改用靈敏度較高的熒光法或放射性核素法。第九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光法取決于酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比，并通過(guò)熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)熒光強(qiáng)弱的變化換算出酶的活性。例如，還原型的NAD(P)H有強(qiáng)烈的熒光，故所有以NAD(P)為輔酶的氧化還原酶類(lèi)均可用熒光法進(jìn)行測(cè)定。核素法因有污染且操作煩雜，目前應(yīng)用較少。 第十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4其他方法

5、 當(dāng)酶促反應(yīng)涉及酸堿變化時(shí)，可用pH儀或電位滴定儀測(cè)定酸堿度變化來(lái)計(jì)算酶濃度。這類(lèi)方法需要一定儀器，操作麻煩。此外，各種電極法、旋光法、極譜法、高效液相色譜法或生物發(fā)光法等也可用于測(cè)定特定的酶或進(jìn)行酶學(xué)研究。第十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Note極譜法（polarography） 通過(guò)測(cè)定電解過(guò)程中所得到的極化電極的電流-電位（或電位-時(shí)間）曲線來(lái)確定溶液中被測(cè)物質(zhì)濃度的一類(lèi)電化學(xué)分析方法。第十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、酶活性濃度測(cè)定方法測(cè)定酶的催化活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點(diǎn)?？筛鶕?jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用合理的方法

6、進(jìn)行酶活性濃度的測(cè)定。第十三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）酶促反應(yīng)進(jìn)程如將酶促反應(yīng)過(guò)程中測(cè)得的產(chǎn)物 P 或底物 S 變化量對(duì)時(shí)間作圖，可得酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線（圖6-2）。圖中產(chǎn)物 P 或底物 S 變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。第十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大多數(shù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線表明，在酶促反應(yīng)一開(kāi)始的階段，底物 S 濃度不斷下降，隨之有相應(yīng)產(chǎn)物 P 產(chǎn)生。但由于各種因素的影響，反應(yīng)速率比較慢，這段時(shí)間稱(chēng)為延滯期（1ag phase），可以是幾秒至幾分鐘。尤其是雙底物反應(yīng)或需要輔酶參與者，通常為13min

7、。第十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月隨后在過(guò)量的底物存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到一個(gè)反應(yīng)速率穩(wěn)定的階段，即酶促反應(yīng)以恒定的速率進(jìn)行，不受底物濃度的影響，這段反應(yīng)稱(chēng)為線性反應(yīng)期（1inear phase）或零級(jí)反應(yīng)期（zero order）。產(chǎn)物 P 和底物 S 與時(shí)間t成線性關(guān)系。第十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于種種因素，如底物因酶反應(yīng)消耗而濃度下降，產(chǎn)物濃度上升出現(xiàn)逆反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可能有抑制酶反應(yīng)作用或酶的熱失活等，使酶促反應(yīng)變慢，即反應(yīng)速率下降，偏離線性，這段時(shí)間稱(chēng)為一級(jí)反應(yīng)期（first order）。第十八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于20

8、22年6月反應(yīng)速率與底物 S 成正比，產(chǎn)物P 與時(shí)間t不成線性關(guān)系。如果反應(yīng)速率受兩種或兩種以上物質(zhì)濃度的影響，則反應(yīng)可為一級(jí)、二級(jí)或多級(jí)反應(yīng)，一般將這段反應(yīng)時(shí)間統(tǒng)稱(chēng)為非線性反應(yīng)期。圖6-3顯示單試劑速率法酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線。第十九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度，否則將導(dǎo)致誤差。在延滯期、非線性反應(yīng)期所測(cè)得的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般結(jié)果偏低。第二十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶活性濃度測(cè)定方法酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度（v）達(dá)到最大速度Vm

9、ax，即在過(guò)量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的速度，此時(shí)反應(yīng)速度與酶濃度 E 之間有線性關(guān)系。第二十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月如按反應(yīng)時(shí)間將酶活性濃度測(cè)定方法進(jìn)行分類(lèi)，可分為定時(shí)法（fixed time assay）和連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuous monitoring assay）兩大類(lèi)。第二十三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1定時(shí)法 這是早期測(cè)定酶活性濃度的方法。大多是使酶作用一段時(shí)間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)平均速度。第二十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月這類(lèi)方法有多種命名，如

10、“取樣法”、“終點(diǎn)法”或“兩點(diǎn)法”。用此類(lèi)方法測(cè)定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時(shí)間要很精確，否則會(huì)引起較大誤差。第二十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月這種方法的優(yōu)點(diǎn)是比較簡(jiǎn)單，因測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)是無(wú)法知道在整個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級(jí)反應(yīng)。第二十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月圖6-4顯示定時(shí)法中酶促反應(yīng)的三種可能過(guò)程。雖然從t1到t2三種反應(yīng)所生成的產(chǎn)物量相同，但實(shí)際反應(yīng)過(guò)程有很大差別。曲線1說(shuō)明酶促反應(yīng)速率接近終點(diǎn)時(shí)已經(jīng)減慢，曲線2說(shuō)明在反應(yīng)早期存在延滯期。只有

11、曲線3時(shí)，用定時(shí)法可以準(zhǔn)確測(cè)定代表酶活性濃度的反應(yīng)速率。第二十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月因此，用定時(shí)法準(zhǔn)確測(cè)定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應(yīng)速率和時(shí)間的關(guān)系，應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線性時(shí)間，然后在這段時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，避開(kāi)延滯期和一級(jí)反應(yīng)。 第二十九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2連續(xù)監(jiān)測(cè)法 連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。與定時(shí)法不同的是，這類(lèi)方法勿需停止酶促反應(yīng)，不需添加其他呈色試劑，就可測(cè)定反應(yīng)物的

12、變化，很容易觀察到反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程。在以往的一段時(shí)期里，常把這類(lèi) 方法稱(chēng)為“動(dòng)力學(xué)法”或“速率法”。第三十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月這類(lèi)測(cè)定方法簡(jiǎn)單，優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，以觀察到是否偏離零級(jí)反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)。通常截取反應(yīng)開(kāi)始后較短的時(shí)間，就能近似地建立這種反應(yīng)量與反應(yīng)時(shí)間的線性關(guān)系，不過(guò)這種時(shí)間范圍因酶種類(lèi)和反應(yīng)條件而異，必須用實(shí)驗(yàn)方法 進(jìn)行確定。第三十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定結(jié)果常較定時(shí)法高，且因在酶促反應(yīng)初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶變性等均很小，因

13、而測(cè)定結(jié)果也較取樣法準(zhǔn)確。第三十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性濃度隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，各種自動(dòng)生物化學(xué)分析儀的廣泛使用，連續(xù)監(jiān)測(cè)法已逐步取代定時(shí)法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶活性濃度最常用的方法。第三十三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的種類(lèi)1直接法 這類(lèi)方法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導(dǎo)率、粘度等，從而計(jì)算出酶活性濃度。第三十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月其中以分光光度法應(yīng)用最為廣泛，也是方法學(xué)上最成熟的一種。利用NAD(P)H在340

14、nm處的吸光度的變化測(cè)定各種脫氫酶的方法是應(yīng)用最廣的一類(lèi)方法。NAD(P)H在260nm波長(zhǎng)和340nm波長(zhǎng)處有吸收峰，而氧化型NADNADP只在260nm波長(zhǎng)處有吸收峰，這是因?yàn)榉肿又杏邢汆堰实木壒省?40nm波長(zhǎng)處吸光度的變化可以反映 反應(yīng)體系中NAD(P)H量的增減。 A+NAD(P) B+NAD(P)H脫氫酶第三十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月還可利用一類(lèi)人工合成的所謂“色素原”底物，其本身為無(wú)色或微黃色，酶作用后生成有色化合物，如目前應(yīng)用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物進(jìn)行水解酶和一些還原酶的測(cè)定。 A B C酶促反應(yīng)顯色反應(yīng)第三十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

15、2間接法 直接法雖然簡(jiǎn)單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)等方面有顯著差異時(shí)，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法進(jìn)行測(cè)定。目前可采用兩類(lèi)間接法進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定。第三十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一類(lèi)方法是在原來(lái)反應(yīng)體系中加入一些試劑，這些試劑只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的物質(zhì)變化，但同時(shí)又不和酶作用也不影響酶活性。典型的例子是血清ChE（膽堿酯酶）的丁酰硫代膽堿測(cè)定法。另一類(lèi)是目前應(yīng)用最多，最為廣泛的酶偶聯(lián)法，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)。第三十八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶偶聯(lián)反應(yīng)最簡(jiǎn)單的酶

16、偶聯(lián)反應(yīng)（單底物反應(yīng)且只有一個(gè)工具酶）模式為：A B C被測(cè)定酶（Ex）催化的反應(yīng)稱(chēng)為始發(fā)反應(yīng)；產(chǎn)生被檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)物C（如NADH）的反應(yīng)稱(chēng)為指示反應(yīng)，相應(yīng)的偶聯(lián)酶（第二個(gè)酶）酶稱(chēng)指示酶（Ei）。ExEi第三十九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)往往還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連接起來(lái)，此反應(yīng)稱(chēng)為輔助反應(yīng)。模式為：A B C D一般習(xí)慣將最后一個(gè)酶稱(chēng)指示酶（Ei），其他外加的酶稱(chēng)為輔助酶（Ea）。個(gè)別情況還可能使用兩種或以上的輔助酶。將這一連串酶促 反應(yīng)稱(chēng)為酶偶聯(lián)體系。ExEiEa第四十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2

17、022年6月臨床常規(guī)酶學(xué)分析所用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶。通過(guò)監(jiān)測(cè)其反應(yīng)物NADH或NADPH于340nm處吸光度的變化速率，可以很容易地監(jiān)測(cè)指示酶反應(yīng)。第四十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用酶偶聯(lián)法測(cè)定酶活性濃度時(shí)，并不是一開(kāi)始反應(yīng)就全部反映了測(cè)定酶活性。這是因?yàn)樵谂悸?lián)反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)相：一是預(yù)孵育期，反應(yīng)一開(kāi)始只存在底物A，不存在指示酶的反應(yīng)，在此時(shí)相中使存在于樣品中的干擾物質(zhì)充分進(jìn)行反應(yīng)，將試劑中的NADH變?yōu)镹AD。二是延滯期，加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，在啟動(dòng)后的一段短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物B開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增加，處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表測(cè)定酶的 反應(yīng)速率Vx，這

18、一時(shí)期稱(chēng)為延滯期。第四十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月隨著產(chǎn)物B增加到一定程度時(shí)，Ex和Ei反應(yīng)速率相同，達(dá)到了穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm波長(zhǎng)處吸光度才會(huì)有明顯的線性變化。最后由于底物消耗，反應(yīng)速度又復(fù)減慢。圖6-5顯示酶偶聯(lián)法測(cè)定ALT時(shí)吸光度變化的掃描圖譜。設(shè)計(jì)或選擇酶測(cè)定方法時(shí)，如用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測(cè)定時(shí)間一定要避開(kāi)此期。第四十三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)然也不是所有酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測(cè)定。為了保證準(zhǔn)確測(cè)定酶活性，酶偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)速率應(yīng)超過(guò)或等于測(cè)定酶的反應(yīng)速率，指示酶反應(yīng)必須是一級(jí)反應(yīng)，即指示

19、酶反應(yīng)速率應(yīng)和測(cè)定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。第四十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月只有當(dāng)使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小時(shí)，才能做到這一點(diǎn)。一般說(shuō)來(lái)酶偶聯(lián)法中所用的指示酶Km值都很小，酶促反應(yīng)最適pH應(yīng)與工具酶的反應(yīng)最適pH相接近。當(dāng)然在選用指示酶時(shí)還應(yīng)從經(jīng)濟(jì)方面考慮選用一些來(lái)源容易且價(jià)格便宜的酶制劑。第四十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）干擾因素臨床測(cè)定酶活性濃度標(biāo)本都是體液，其中除測(cè)定酶外，還存在著其他各種酶和其他物質(zhì)，因此在實(shí)測(cè)反應(yīng)中可能出現(xiàn)一些副反應(yīng)或旁路反應(yīng)，這些都會(huì)對(duì)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生干擾。第四十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1其他酶和物質(zhì)的

20、干擾反應(yīng)體系各成分除可能引起測(cè)定酶反應(yīng)外，還有可能引起其他酶的反應(yīng)而干擾測(cè)定。例如酶偶聯(lián)法測(cè)ALT時(shí)，由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD(H)，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸反應(yīng)，引起340nm波長(zhǎng)處吸光度下降，從而引起ALT活性測(cè)定誤差。第四十八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月又如紅細(xì)胞中腺苷酸激酶（AK）對(duì)CK測(cè)定的干擾，在CK測(cè)定的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK的底物，但它又同時(shí)是AK的底物，二個(gè)酶反應(yīng)都產(chǎn)生ATP。ATP在試劑中與己糖激酶（HK）和G6PD作用會(huì)形成NADH引起340nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，出現(xiàn)CK酶活性結(jié)果偏高。為避免此干擾，一般在反應(yīng)體系中加入AK的抑制劑腺苷酸 （

21、AMP）和二腺苷五磷酸（AP5A）。第四十九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2酶的污染 因試劑用酶多從動(dòng)物組織或細(xì)菌中提取，易污染其他酶，如不設(shè)法除去將引起測(cè)定誤差。如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測(cè)定。使用的酶制劑（如工具酶）必須提純。例如測(cè)AST時(shí)，被蘋(píng)果酸脫氫酶所污染的AST不應(yīng)超過(guò)相對(duì)量的 510-5（0005）。第五十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3非酶反應(yīng) 有些底物不穩(wěn)定，沒(méi)有酶的作用就會(huì)自行反應(yīng)。例如很多硝基酚的酯類(lèi)衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時(shí)間可自行水解釋放出硝基酚。類(lèi)似情況還可見(jiàn)于一些內(nèi)部因素如pH變化而引起的空

22、白對(duì)照的變化。又如測(cè)定ALD（醛縮酶）時(shí)，其底物醛類(lèi)化合物可以和NAD 起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類(lèi)似NADH的吸收光譜 的衍生物，給測(cè)定帶來(lái)困難。第五十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混雜有其他一些物質(zhì)，可能影響酶的活性。如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。第五十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5沉淀形成 使用分光光度法測(cè)定酶活性時(shí)，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會(huì)引起吸光度變化。常加入表面活性劑以防止顆粒從勻漿中析出。有些酶反應(yīng)需鎂離子作為輔因子，如反應(yīng)液中含有多余磷酸根時(shí)將有沉淀出現(xiàn)。第五十三張，PPT

23、共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月解決上述干擾問(wèn)題的方法之一可通過(guò)試劑空白管檢出并加以校正。即有時(shí)不僅要作標(biāo)本對(duì)照管，還要作試劑空白管。另一個(gè)有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測(cè)定酶活性。第五十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、工 具 酶通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱(chēng)為工具酶。常使用酶偶聯(lián)體系進(jìn)行測(cè)定，指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。第五十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）常用工具酶及其質(zhì)量要求常用工具酶多為氧化還原酶類(lèi)，這是因?yàn)槠洚a(chǎn)物最易被直接監(jiān)測(cè)而成為指示酶。在一系列利用工具酶的反應(yīng)中，主要限速因子應(yīng)該是待測(cè)化合物和待測(cè)酶，工

24、具酶和其輔助底物應(yīng)過(guò)量。第五十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月工具酶純度不必要求過(guò)高，這樣才能降低其作為試劑的成本。但對(duì)工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑制劑等）的含量要有一定的限制，以保證工具酶一定的比活性和純度，減少或避免一些干擾測(cè)定的不必要的副反應(yīng)。第五十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）工具酶參與的指示反應(yīng)近年來(lái)，在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多項(xiàng)目的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的類(lèi)似的反應(yīng)原理，即所謂共通（或通用）反應(yīng)途徑。第五十八張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月最常用的有兩類(lèi)分光光度法，一類(lèi)是利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2），再加氧化發(fā)色劑比色

25、；另一類(lèi)是利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)-NAD(P)H的正逆反應(yīng)后，直接通過(guò)分光光度法或其他方法測(cè)定NAD(P)H的變化量。表6-4顯示臨床常用的共通性呈色反應(yīng)。第五十九張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應(yīng)臨床化學(xué)測(cè)定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇氧化酶、甘油氧化酶、丙酮酸氧化酶等工具酶分別用于葡萄糖、尿酸、膽固醇、甘油、丙酮酸的測(cè)定，可使相應(yīng)底物被氧化生成H2O2。第六十一張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月H2O2主要通過(guò)以氫（或電子）為受體的指示酶反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。有兩類(lèi)工

26、具酶參與反應(yīng)：過(guò)氧化氫酶或稱(chēng)觸酶（catalase）及過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD），兩者均為含三價(jià)鐵的指示酶，以指示酶POD最為常用。第六十二張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月血糖測(cè)定（葡萄糖氧化酶法） 葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚 醌亞胺+4 H2O過(guò)氧化物酶（紅色）葡萄糖氧化酶第六十三張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月血清總膽固醇測(cè)定（膽固醇氧化酶法）膽固醇酯+H2O 膽固醇+脂肪酸膽固醇+O2 4-膽甾氧化烯酮+ H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚 醌亞胺+4 H2O膽固醇酯酶膽固醇氧化酶過(guò)氧化物酶（紅色

27、）第六十四張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2NAD(P) 或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶的脫氫酶如 LD(H)、GLD （谷氨酸脫氫酶） 、G6PD等參與時(shí)，常將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P) 而形成NAD(P)H。第六十五張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月LD主要以NADNADH為輔酶，而GLD則不論來(lái)自肝或細(xì)菌，均可以NADNADP 或其還原型為輔酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。目前利用此類(lèi)反應(yīng)的測(cè)定項(xiàng)目至少有葡萄糖、尿素、-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD(H)、GLD（谷氨酸脫氫酶）、CK、ALD（醛縮酶）、G6PD和ICD（異檸 檬酸脫氫酶）第六十六張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月此外，酶循環(huán)法（enzymatic cycling methods）采用兩類(lèi)工具酶進(jìn)行循環(huán)催化反應(yīng)，使被測(cè)物放大擴(kuò)增，從而使檢測(cè)靈敏度提高。目前已應(yīng)用于臨床常規(guī)總膽汁酸的測(cè)定。第六十七張，PPT共七十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月為了簡(jiǎn)化操作過(guò)程，并使酶試劑得以方便或反復(fù)使用，已有許多研究將水溶性的酶通過(guò)吸附、包埋、載體共價(jià)結(jié)合或通過(guò)酶分子間共價(jià)交