梨果皮色澤變異品種(系)的AFLP與SRAP標記鑒定

1、梨果皮色澤變異品種(系)的AFLP與SRAP標記鑒定論文摘要：本試驗利用AFLP和SRAP標記對3組果皮色澤的變異品種Table1Cultivarsorstrainsusedinthisstudy 編號 No. 品種或株系 Cultivars(strains) 外觀色澤 Colour of appearance 樣品采集地 Place of sample collection 1 南果Nanguo 綠色 green 遼寧Liaoning 2 南果紅色變異系 Red variant strain of Nanguo 紅暈 red flush 遼寧Liaoning 3 考密斯 Doyenne du

2、 Comice 綠色 green 南京Nanjing 4 紅考密斯 Red Doyenne du Comice 紫紅色 dark red 南京Nanjing 5 早紅考密斯 Early red Doyenne du Comice 紫紅色 dark red 河北 Hebei 6 早紅考密斯綠色變異系Green variant strain of Early red Doyenne du Comice 綠色 green 河北Hebei 7 紅安久Red dAnjou 紅色 red 河北Hebei 8 紅安久綠色變異系Green variant strain of Red dAnjou 綠色gree

3、n 河北Hebei 1.2試驗方法采用改進CTAB法提取基因組DNA，利用核酸分析儀檢測DNA的濃度，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并根據(jù)實驗需要進行合理稀釋，于-20保存?zhèn)溆?。反響體系參考LuisaMonte-Corvo的研究，并結合本試驗材料進行合理優(yōu)化，試驗采用三堿基選擇性引物，引物序列參照李元軍，引物合成由英濰捷基上海貿易完成，MseI/EcoRI內切酶和T4DNA連接酶均購于紐英倫生物技術北京。酶切反響體系為20L，DNA模板2L、NEBBuffer2L、BSA100 x0.3L、MseI0.5L、EcoRI0.3L、ddHO14.9L，37下酶切5小時，置于6515min；

4、連接反響是將EcoRIadapter1L、MseIadapter1L、TBuffer1L、ddHO1.5L混合后參加酶切產物中，連接12小時,置于6515min。選擇性擴增的PCR產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳別離，銀染顯色，以獲得電泳圖譜。SRAP引物序列參照路娟的研究，PCR反響體系采用本試驗室優(yōu)化的體系。取4LPCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，假設與預期片段大小相近且條帶清晰，再通過8.0%的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)別離，銀染后觀察、拍照。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理對于同一引物的擴增產物，有帶記為1;，無帶記為0;，弱帶及分辨不清的條帶忽略不計。將數(shù)據(jù)錄入Excel表格，形成二元矩

5、陣，根據(jù)Nei和Li計算相似系數(shù)，用NTSYSpc2.02軟件中的SHAN程序對色澤變異品種(系)進行聚類，并作聚類圖。2結果與分析2.1基因組DNA擴增結果利用64對AFLP引物組合對供試品種進行PCR擴增，其中54對引物擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，擴增條帶大小范圍在100500bp之間，局部引物擴增的電泳圖譜如圖1。對擴增條帶的統(tǒng)計結果分析說明，54對引物在3組色澤變異品種及株系中共檢測1089個位點，平均每對引物檢測位點數(shù)為20，其中多態(tài)性條帶數(shù)為688，多態(tài)性比率為63.2%。采用30對SRAP引物組合對供試品種進行檢測，有20對引物可擴增穩(wěn)定、清晰的條帶，擴增產物大小在1001000bp

6、范圍內，局部擴增條帶如圖2。對擴增條帶的統(tǒng)計分析說明，20對引物在3組色澤變異品種及株系中共檢測210個位點，平均每對引物檢測位點數(shù)為10.5，其中多態(tài)性條帶為76條，多態(tài)性比率為36.2%。2.2AFLP標記鑒定色澤變異品種54對AFLP引物組合在南果與南果紅色變異系中可擴增條帶數(shù)為1035條，可檢測的多態(tài)性條帶為7條，占總條帶數(shù)的0.64；考密斯及其色澤變異的4個品種Fig.1GeneticdifferencerevealedbydifferentAFLPprimerpairs18.Differentcultivarsoraccessions(codessequenceshownasTab

7、le1)2.3SRAP標記鑒定色澤變異品種20對SRAP引物組合在南果與南果紅色變異系中可擴增條帶數(shù)為198條，可檢測的多態(tài)性條帶為3條，占總條帶數(shù)的1.43；考密斯及其色澤變異4個品種Fig.2GeneticdifferencerevealedbydifferentSRAPprimerpairs18.Differentcultivarsoraccessions(codessequenceshownasTable1)的4個品種系中3對引物能區(qū)分其中的2個品種系，9對引物能區(qū)分其中的1個品種系。對擴增結果采用Nei-Li相似性系數(shù)的計算方法，南果與南果紅色變異系之間的相似系數(shù)為0.984，考密斯

8、及其色澤變異品種系之間的相似系數(shù)為0.912。表2變異品種系產生差異片段結果Table2Polymorphicfragmentbythevariantcultivars(strains) 引物 Primers 長度(bp) Length(bp) 南果 Nanguo 南果紅色變異系 Red variant strain of Nanguo 考密斯 Doyenne du Comice 紅考密斯 Red Doyenne du Comice 早紅考密斯 Early red Doyenne du Comice 早紅考密斯綠色變異系Green variant strain of Early red Doy

9、enne du Comice M-CAG/E-AAC 255 1 0 1 1 1 1 M-CAG/E-ACC 300 1 0 0 0 0 0 M-CAT/E-ACG 290 0 1 1 1 1 1 M-CAT/E-ACC 350 1 1 0 1 0 0 320 1 0 1 0 0 0 238 1 1 0 1 0 1 M-CTA/E-AAG 272 0 0 1 1 0 0 265 0 0 0 1 0 0 230 1 0 0 1 0 1 M-CTA/E-ACT 285 1 0 1 1 0 1 274 1 1 1 0 1 1 246 1 1 0 1 0 1 M-CTC/E-AGG 256 1 0 0

10、 1 0 1 em7/me3 300 1 0 0 0 0 0 em8/me7 201 0 1 0 0 0 0 em11/me5 700 0 0 0 0 1 1 296 0 0 0 1 0 0 270 1 1 0 0 1 0 242 0 1 1 1 1 1 2.4不同品種系的指紋圖譜及系譜關系綜合AFLP與SRAP標記的檢測結果，獲得4個品種系的特征譜帶，南果梨在引物M-CAG/E-ACC300bp和em7/me3310bp圖2處有特征帶；紅考密斯在引物M-CAT/E-AGG370bp和em11/me5296bp圖1、2處有特征條帶；早紅考密斯在引物em8/me3240bp和em11/me322

11、0bp圖2處有特征帶；早紅考密斯綠色變異品系在em8/me3220bp圖2處有特征帶。特征帶是進行品種或類型鑒別的重要指標，依據(jù)以上特征指紋我們可以將其從供識材料中立即識別出來。此外，指紋圖譜還揭示了供試材料間的差異譜帶，如考密斯在引物M-CAT/E-ACA240bp條帶處缺失，其它品種系均有該條帶擴增圖1；早紅考密斯的綠色變異在引物em7/me3315bp條帶處表現(xiàn)缺失，其它品種系有條帶擴增。SRPA引物em11/me5可區(qū)分除紅安久及其變異系以外的所有供試材料，可應用于品種系的分子鑒別。利用NTSYSpc2.02對8份供試材料的AFLP和SRPA譜帶進行聚類分析，結果如圖3。根據(jù)相似系數(shù)0

12、.8可將所有品種分為2個類群，屬東方梨的南果梨及其變異聚為一類，而其他6個西洋梨及其變異類型聚為另一類群，說明了東方梨與西方梨具有較遠的遺傳關系。在西洋梨類群中，各變異類型與其相應的原始品種表現(xiàn)出較高的相似性。圖3AFLP標記和SRAP標記結果聚類圖品種18同表1所示Fig.3DendrogramofAFLPMarkandSRAPMarkCultiavr18:notedasTable13討論3.1果樹突變的鑒定方法可用于突變鑒定的主要方法有形態(tài)學觀察、同工酶分析、染色體變異數(shù)量與結構的檢測、孢粉學研究和分子標記技術。形態(tài)學觀察主要適用于成齡的果樹品種，鑒定的周期長，并且易受環(huán)境因素的影響，結果

13、可靠性差；染色體變異數(shù)量與結構的檢測，受染色體制片技術和分辨率的限制，核型分析應用于芽變鑒定還有一定的難度，尤其是對于大多數(shù)具有小染色體和結構差異較小的果樹來說無法到達鑒別的目的；孢粉學鑒定芽變需要結合電鏡分析，制樣方法同樣受到影響，并且即使同一品種內花粉粒之間也存在個體差異，因此必須結合其它指標進行綜合分析才能提高其可靠性；同功酶分析相對穩(wěn)定和可靠，但由于受組織器官特異性和發(fā)育階段特異性的影響，使得其在實際應用中也受到一定程度的限制。隨著分子標記技術的出現(xiàn)與開展，使得果樹品種系的鑒定直接在DNA分子水平上進行，這在很大程度上提高了突變鑒定的效率，因此應用越來越廣泛。金勇豐等最早利用RAPD標

14、記分析桃品種布目早生;和其早熟芽變大觀1號;基因組DNA多態(tài)性，篩選出1個引物可檢測出兩者間的多態(tài)性。Scott等第一次成功地采用AFLP技術鑒別了葡萄的體細胞變異，64對引物組合中有2對可產生特異片段,它們可以區(qū)分親本與體細胞變異。LuisGoulo等曾用RAPD和AFLP標記對41個蘋果的芽變品種進行了鑒定，并得到兩種標記是相關的；CaiYL等利用RAPD鑒定了櫻桃芽變，得到除紅燈;之外其他品種的一條或更多的特征譜帶；魯風娟等將AFLP技術應用于梨芽變的鑒定，得到AFLP技術可以高效率的鑒定梨芽變。并取得了成功。但是，在通常情況下，由于體細胞的變異只涉及了基因組極其微小的局部，利用較少的標

15、記檢測基因組相當小的范圍，往往得不到所需的標記。例如，Tignon在蘋果變異品種的鑒定中，使用6對AFLP引物組合就沒能區(qū)別變異品種和其母本品種。本研究應用54對AFLP標記和20對SRAP標記成功鑒定出了南果以及考密斯的色澤變異種系，但是紅安久及其綠色變異系卻無法區(qū)分開，分析其原因可能是所使用的引物缺乏，而無法檢測到變異位點，因此，更多引物的開發(fā)和利用對于突變體的鑒定是十分重要的。3.2不同分子標記的鑒別效率近20年來，分子標記技術開展較為迅速，數(shù)目類型繁多，應用于突變鑒定的標記先后有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SRAP等。RFLP由于涉及到分子雜交等試驗條件的限制，其應用的范圍并

16、不廣泛。RAPD和AFLP標記在突變鑒定中應用較多，Monte-Corvo的研究說明RAPD標記和AFLP標記都適合于鑒定梨芽變，但是相比擬AFLP標記可檢測到更高的多態(tài)性，結果更有重復性和可靠性。已有的多數(shù)研究說明，SSR標記難以應用于芽變品種的鑒別。Yamamoto等曾利用9對SSR引物對二十世紀及其芽變(金二十世紀、奧嗄金二十世紀)、巴梨及其芽變紅巴梨進行分析，均無法區(qū)分原種及其芽變；曹玉芬等也曾利用12對SSR引物以鑒別鴨梨及其垂枝型芽變垂枝鴨梨和四倍體倍性芽變晉縣大鴨梨、南果梨及其大果型芽變大南果，結果也是失敗的。路娟曾利用SSR標記鑒定新高及其黃皮綠枝型芽變大果水晶，黃花及其大果型

17、芽變大果黃花，考密斯及其濃紅芽變品種紅考密斯，均無法區(qū)分原種及其芽變。SRAP標記是Li等創(chuàng)造的一種新的標記類型，目前在果樹芽變鑒定中的應用還較少。張四普等篩選了600對SRAP引物組合，獲得了紅花石榴與白花變異枝中的1個差異條帶。從本研究結果來看，AFLP和SRPA兩種標記均適合于梨突變類型的鑒定，但從揭示的多態(tài)性來說，AFLP標記效率高于SRPA標記。這可能是因為AFLP標記在一次反響中可檢測的位點數(shù)明顯高于SRAP標記?？梢?，到目前為止AFLP標記仍不失為檢測突變體的首選方案。4結論本研究利用AFLP標記和SRAP標記成功鑒定出了南果、考密斯的色澤變異品種系，并得到南果、紅考密斯、早紅考

18、密斯和早紅考密斯綠色變異系的特征譜帶；紅安久及其綠色變異系沒有被區(qū)分開。與SRAP標記相比，AFLP標記對芽變鑒定的效率更高。參考文獻1 CAO Yu-fen, LIU Feng-zhi, GAO Yuan, JIANG Li-jie, WANG Kun, MA Zhi-yong, ZHANG Kai-chun. SSR analysis of genetic diversity of pear cultivars . Acta Horticulturae Sinica, 2007 , 34(2):305-310.2 Luis G, Luis C, Cristina M O, Jose M L

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