菌種選育保存和復蘇

1、關(guān)于菌種的選育保存和復蘇第一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 菌種的分離一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 第二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。第三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到

2、目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立一更為科學的和針對性不強的分離方法是必要的。 二、分離思路 第四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）成功的分離培養(yǎng)方法(1)認真考慮所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標準；(3)將生態(tài)學方法運用到分離和篩選過程。第五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）培養(yǎng)分離中要解決的問題1、“分離什么和從哪里分離出?” 2、必須充分考慮所分離微

3、生物的生產(chǎn)能力、生 長速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其 提純的難易和費用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定 性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。第六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）將生態(tài)學方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點1、羅列出所要分離的微生物類群；2、根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分 離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3、將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各 部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā) 酵食品等；4、羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽 分、水分、氧化還原電勢及溫度等；第七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月5、列出生

4、物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤 中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；6、根據(jù)上述1-5項中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計分離方 法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然 浸出汁和培養(yǎng)條件；7、用標準方法作對照來評價生態(tài)學分離方法；8、根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；9、運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選 意義的微生物類群。第八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)

5、、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟第九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一）采樣1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。第十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月從自然界篩選第十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、采樣季節(jié)： 以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式： 在選好適當?shù)攸c后，用小

6、薩子除去表土，取離地 面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或 塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、 環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的 數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回， 以便及時分離。第十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）增殖培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。 厭

7、氧或好氧、酸堿度的選擇、特殊的生理特性、添加特殊的抑制劑第十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。第十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）篩 選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生

8、產(chǎn)菌種應(yīng)當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。四、實例自然界中細菌的分離第十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對

9、無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集 日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù) 等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為 真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；第十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。第十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況

10、下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面515cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。第二十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2植物體采集方法在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與

11、根際土樣一起保存。第二十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3水樣采集方法用于細菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4下貯存。第二十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)生態(tài)學參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學參數(shù)以及用于平

12、板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。第二十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1， 以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。第二十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）土中細菌的富集培養(yǎng)與分離 分離土樣

13、中的大部分細菌的分離程序中無需進行富集。但對某些少數(shù)細菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。第二十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月富集方法運用細菌的酶誘導性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。第二十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月土樣中細菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細菌的分離：水樣通過

14、0.22m無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。第二十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月水中細菌分離的簡易富集技術(shù)在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌、中溫菌和嗜高溫菌。第二十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2

15、022年6月次代培養(yǎng)及純化步驟涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。將認為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選。第二十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)選種 在長年累月的生產(chǎn)實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它

16、的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進行類似新種篩選分離，達到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。第三十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。第三十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組第三十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月育種過程包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的 引入。 (2)希望基因型的選出。 (3)改良

17、菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn) 規(guī)模)。第三十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇育種方法時綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式 或連續(xù)發(fā)酵試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的 明了程度；(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。第三十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加 特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力 來提高限速酶

18、的含量；在代謝裔途徑中引伸出 新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。(2)增加前體物的濃度。(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第三十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導代謝產(chǎn)品 的結(jié)構(gòu)類似物抗性。第三十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 提高特定基因的表達水平引入強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號，提高基因效力等。誘導解除基因表達抑制的突變。第三十

19、七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 改進菌種的生長效率通過確定并改變代謝中的耗能部分;由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。提高菌株對底物的利用率方法：第三十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。一、基本概念第三十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM

20、)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第四十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、營養(yǎng)缺陷型的用途 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第四十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜第四十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(一)出發(fā)菌株的選擇1、自然界新分離的野生型菌株

21、，對誘變處理較 敏感，容易達到好的效果。2、在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較 相像，也是良好的出發(fā)菌株。3、每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多 次誘變能積累較多的提高。4、出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理 比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第四十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 5、要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細 胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀 大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6、根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘 變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處 理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有 的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期 的

22、細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第四十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (二)處理菌懸液的制備 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。第四十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）誘變方法物理誘變化學誘變 根據(jù)有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。第四十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵

23、母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。第四十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （五）檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法、夾層法 第四十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、將一較平且直徑小于1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌 的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌

24、。2、將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕 一壓，使之成為印模，標記方位。3、將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的 同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。 1、影印法第四十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月4、將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5、二平皿相同方位進行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平 皿上長出的菌落少于CM平板上的。MM上未長 而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺 陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。第五十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)

25、位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。第五十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第五十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定 驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷因子，即生長譜測定。第五十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月生長譜測定的方法 將缺

26、陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的56個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。個平皿測一個菌。第五十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在56個平皿上可測20株菌以上。第五十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 基因育種 1、基因重組育種： 運用體外DNA各種操作或修改手法獲

27、得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細胞的方法。第五十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、一個完整的基因克隆過程包括以下步驟、獲得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因與載體在體外連接；、重組DNA分子導入宿主細胞；、篩選、鑒定陽性重組子；、重組子的擴增與或表達。第五十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因重組第五十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月載體宿主系統(tǒng) 載體(vector)： 是攜帶外源DN

28、A進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。第五十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月載體應(yīng)具備以下條件：、能在適當?shù)乃拗骷毎袕椭?；、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆 位點）以便外源DNA插入；、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載 體DNA與宿主DNA便于分離；、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng) 的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元 件。第六十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月宿主細胞必須符合以下條件、對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制；、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；、在

29、重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；、容易導入重組DNA分子；、符合重組DNA操作的安全標準。第六十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 雜交育種第六十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、細菌雜交在細菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hf

30、r稱供體菌，而F-稱受體菌。第六十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酵母雜交育種技術(shù) 1、酵母繁殖方式 酵母為單細胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。第六十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月單倍體細胞具及2兩種交配型。兩種交配型細胞經(jīng)其細胞壁上特定的凝聚因子誘導而進行交配，恢復為雙倍體；同一交配型細胞之間，則因細胞壁上凝集因子的存在而不能進行交配。在生活過程中，酵母細胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細胞。第六十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、酵

31、母雜交 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。 酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結(jié)果。第六十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出來的。第六十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年

32、6月 一、原生質(zhì)體融合育種的特點1、雜交頻率較高： 細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形 的原生質(zhì)體。2、受接合型或致育型的限制較小：二親株中任 何一株都可能起受體或供體的作用，因此有 利于不同種屬間微生物的雜交。3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二 親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一 的過程。第六十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月4、存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合 子的可能性。5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。第六十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、原生質(zhì)體融合育種步驟1

33、、標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2、原生質(zhì)體制備。3、等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。4、涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5、選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取 融合子進一步試驗、保藏。6、生產(chǎn)性能篩選。第七十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、原生質(zhì)體融合育種的要點 1、標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。第七十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是

34、在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。 在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。第七十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、影響原生質(zhì)體制備的因素1、菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2、菌體的培養(yǎng)時間 為了使細胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3、酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。第七十三張，PPT共一百零八頁

35、，創(chuàng)作于2022年6月4、酶處理溫度 5、破壁時的pH值6、滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第七十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) 在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。第七十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特

36、 別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生 產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3) 菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第七十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)1、冷凍干燥或真空干燥保藏；2、超低溫或在液氮中冷凍保藏； 3、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?、土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第七十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、冷凍保藏 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20以下，同時應(yīng)認真掌握好冷凍速度和解

37、凍速變。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。第七十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80)三、液氮冷凍保藏技術(shù) 第七十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月普通冷凍保藏技術(shù)(-20)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力12年。第八十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于

38、2022年6月應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。第八十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80) 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進行保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： 1離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞； 2用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞； 3加入等體積的20甘油或10二甲亞砜； 4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低 溫冰箱中保藏。第八十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 如果待

39、保藏菌種生長在斜面上，則可用含10甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。第八十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月液氮冷凍保藏技術(shù) (一)冷凍保護劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。所使用的甘油般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。 第八十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1、待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長斜面制備菌懸液： 每一斜面加入5ml含10甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；

40、用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， 第八十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。第八十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、控速冷凍 (1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于 一較大的金屬容器中； (2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；

41、(3)以1-2/min的致冷速度降溫，直到溫度達到 相對溫度之上幾度的細胞凍結(jié)點(通常為- 30)； (4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細胞在凍結(jié)點 時盡可能快地發(fā)生相變；第八十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(5)細胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/min，直到 溫度達-50；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)或 氣相(-156)中保存。 如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第八十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(三)復蘇 1、從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中。 2、迅速將安瓿置于37-40水浴

42、中，并輕輕搖動 以加速解； 3、用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有 2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管 反復抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml (約4、8滴) 轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。第八十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、 凍干保藏 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。第九十張，PPT共一百

43、零八頁，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)物的凍干過程第九十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)操作步驟1啟動冷凍干燥器的致冷單元。當冷凝器的溫度達到-40時啟動真空泵，使真空度達到2.674.00Pa。2將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入23體積的異丙醇，然后插入溫度計及可調(diào)溫控儀降溫探頭打開降溫探頭控制醇浴溫度在-40，這過程約需30min。3每支斜面加入2ml 20的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在106CFUm1用細菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時，加入40的脫脂乳，混合制成含106CFUml的均懸液。第九十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于

44、2022年6月4取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分裝安瓿(0.2ml瓿)，重新塞好棉塞。5輕輕振蕩安瓿，以使細胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細胞懸液迅速凍結(jié)。第九十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月615min后，將歧管與真空泵相通。7維持-40的醇浴溫度90-120min，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10，維持2h。8關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫(25)9在冷凍干燥的最初4h內(nèi)應(yīng)定期測真空度，在安瓿置于真空下后1h內(nèi)，真空度必須達到13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時逐漸降到2.674.0Pa。第九十四張，PPT

45、共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月10 在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機 中至少16h以獲得完全干燥。11干燥后，在2.674.00Pa的真空度下封瓶12在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。13關(guān)閉真空泵。14關(guān)閉冷凝器。第九十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、凍干菌種的保藏與再生1、保藏： 冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5下保藏。較低的保藏溫度(-20-70)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2、復蘇：(1)在超凈工作臺中用70酒精棉球擦洗安瓿，然 后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰 開安瓿第九十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)在安瓿中加入0.51ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢 旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉(zhuǎn)接到 一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種 瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此 直接振落入盛有l(wèi)2ml液體培養(yǎng)基的試管中， 輕輕振