酶切回收連接

1、基因工程的基本過(guò)程基因工程的基本過(guò)程質(zhì)粒質(zhì)粒dna的酶切的酶切定義：識(shí)別定義：識(shí)別dsdna的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈或其周圍切割雙鏈dna的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶類內(nèi)切酶作用特點(diǎn)類內(nèi)切酶作用特點(diǎn)v能在特殊位點(diǎn)識(shí)別和切斷能在特殊位點(diǎn)識(shí)別和切斷dsdna，識(shí)別序列，識(shí)別序列4-6bp，具有具有回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) （180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)）度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)）vhind v產(chǎn)生產(chǎn)生5粘性末端粘性末端vsst 產(chǎn)生產(chǎn)生3粘性末端粘性末端gtccaggtcgaccagctggacctg第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第一個(gè)字母

2、取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。3、命名、命名：hind haemophilus influenzae d株株 流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶 屬屬 系系 株株 序序v書(shū)寫(xiě)方法：前書(shū)寫(xiě)方法：前3個(gè)字母斜體個(gè)字母斜體酶活性單位酶活性單位v指在限定條件下（溫度、指在限定條件下（溫度、buffer），），1hr消化消化1ugdna的酶量稱為一個(gè)酶單位（的酶量稱為一個(gè)酶單位（unit）。）。v實(shí)際工作中，為保

3、證消化完全，實(shí)際工作中，為保證消化完全，1ugdna的消化的消化需要需要3-5個(gè)單位的酶，反應(yīng)時(shí)間也要適度延長(zhǎng)，個(gè)單位的酶，反應(yīng)時(shí)間也要適度延長(zhǎng)，通常是反應(yīng)過(guò)夜。通常是反應(yīng)過(guò)夜。酶切反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)v回收回收dna通常酶切通常酶切10gv實(shí)際酶的用量應(yīng)是理論用量的實(shí)際酶的用量應(yīng)是理論用量的3-5倍。倍。v酶通常保存在酶通常保存在50%的甘油中的甘油中 ，使用時(shí)甘油濃度，使用時(shí)甘油濃度必須小于必須小于5%，故酶至少稀釋，故酶至少稀釋10倍。倍。vbuffer通常是通常是10，使用時(shí)稀釋，使用時(shí)稀釋1010倍。倍。v總反應(yīng)體積總反應(yīng)體積20-50ul20-50ul，不足用，不足用t

4、dhtdh2 2o o補(bǔ)足。補(bǔ)足。dna的量的量酶的用量（酶的用量（u/c）酶在酶在50甘油中，甘油在甘油中，甘油在總體積的濃度要小于總體積的濃度要小于5反應(yīng)的反應(yīng)的總體積總體積buffer的體積的體積水的體積水的體積 質(zhì)粒質(zhì)粒dna 15l （10g）hind iii (20u/l) 1.5 l 10 緩沖液緩沖液 e 3l 三蒸水三蒸水 9l _總體積總體積 30l xbai（20u/l 1.5 l 加樣順序加樣順序加樣后混勻，短暫離心，使之至管底。加樣后混勻，短暫離心，使之至管底。dna片段的片段的分離純化分離純化四、操作步驟：四、操作步驟： 關(guān)鍵操作：點(diǎn)樣關(guān)鍵操作：點(diǎn)樣n在加樣孔正上方

5、，不要進(jìn)入孔中甚至戳穿在加樣孔正上方，不要進(jìn)入孔中甚至戳穿孔底孔底1.加樣器一旦按下，就一定保持按住直至加加樣器一旦按下，就一定保持按住直至加樣器離開(kāi)加樣孔，否則會(huì)將樣品又吸回到樣器離開(kāi)加樣孔，否則會(huì)將樣品又吸回到tip中，使加樣失敗中，使加樣失敗載體載體 dna目的目的基因基因 bp1534 994 695 515 377 237 a b c m 酚抽提法酚抽提法 切下含目的切下含目的dna的膠塊。的膠塊。 加入酚，將膠塊沒(méi)過(guò)即可。加入酚，將膠塊沒(méi)過(guò)即可。 振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時(shí)間。振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時(shí)間。 30水浴融化，若體積小，可補(bǔ)加水浴融化，若體積小，可補(bǔ)加te。 振蕩器

6、上振蕩。振蕩器上振蕩。 12,000 rpm離心離心5 min。 取上清取上清200l。 用用200l的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心12000 rpm，5 min，取上清）。，取上清）。 加加20 l naac，400 l無(wú)水乙醇沉淀無(wú)水乙醇沉淀dna，冰，冰凍約凍約30 min甚至過(guò)夜。甚至過(guò)夜。 12,000 rpm離心離心10 min，棄上清。，棄上清。 將將dna溶于約溶于約30l te中。中。dna片段的連接反應(yīng)片段的連接反應(yīng) dna 連接酶連接酶 ligase 催化催化dna 5 dna 5 磷酸基與磷酸基與 3 3 羥基之間形羥基之間形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵(atp)(atp)5533oh pohpdna連接酶連接酶dna連接酶連接酶總體積總體積20 l 載體載體 0.10.2g目的基因：載體目的基因：載體mol數(shù)數(shù)= 15：1h2o10buffer載體載體目的基因目的基因ligase總體積總體積20l l l l l l 連