黃曲霉素測定方法

1、黃曲霉毒素測定法1簡述黃曲霉毒素可以有曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和偽溜曲霉4種真菌產(chǎn) 生，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類素的二呋喃香豆素的衍生化合物，中藥在貯藏、制備、運(yùn) 輸過程中如保存不當(dāng)有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。黃曲霉毒素是目前世 界上已知的毒性最強(qiáng)的化合物之一，其致癌性肯定。對中藥中黃曲霉毒素殘留量 進(jìn)行嚴(yán)格控制對保證藥用安全具有重要意義。本法的基本原理為樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取、免疫親和柱凈化后，利用高效液相 色譜分離，柱后碘衍生-熒光檢測器檢測進(jìn)行分析測定。2儀器與用具2.1高速勻漿機(jī)、振蕩器2.2高效液相色譜單元，配熒光檢測其（具360nm激發(fā)波長和大于420nm發(fā)射波長）2.3柱后衍生

2、系統(tǒng)2.4離心機(jī)2.5超純水處理系統(tǒng)2.6黃曲霉總量（BB2、GG2）免疫親和柱2.7固相萃取裝置2.8離心管，具塞錐形瓶，刻度濃縮瓶，移液管，容量瓶等。3試藥與試液3.1甲醇、乙臘均為色譜純。3.2水位高純水。3.3黃曲霉毒素混合對照品。3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100m l使溶解，用水稀釋至1000ml即 得。4.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙 臘-水（40:18:42）為流動相，流速每分鐘0.8m；采用柱后衍生法檢測，（1）碘 衍生法：衍生溶液為0.05%的碘溶液（取碘0.5甘，加入甲醇100m l使溶解，用水稀 釋至1000

3、ml制成），衍生化泵流速每分鐘0.3ml，衍生化溫度70C ；以熒光檢測 器檢測，激發(fā)波長Aex =360nm，發(fā)射波長Aem =450nm。進(jìn)樣量：2050 ix l （視 靈敏度進(jìn)行調(diào)整）。按上述條件操作，理論板數(shù)以B計應(yīng)不低于5000，兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大 1于 1.5。5.操作方法5.1混合對照品溶液的制備 精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1、 B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為 1. 0pg/ml、0.3pg/ml、1.0pg/ml、0.3pg/ml、）0.5ml， 置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備液。精密量取儲備液1ml，置25ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋

4、至刻度，即得。5.2供試品溶液的制備取供試品粉末約15g（過二號篩），精密稱定，加入氯化 鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度 大于11，000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘（離心速度2500轉(zhuǎn)/分），精密量取上清液15ml， 置50m l量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45pm）濾過，量取續(xù) 濾液20.0ml，通過免疫親合柱，流速每分鐘3ml，用水20m l分兩次洗脫，洗脫液 棄去，使空氣進(jìn)入柱子,將水?dāng)D出柱子，再用1.5ml甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置 2ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。5.3測定法分別精密吸取上述混合對照品溶液5p

5、l、10pl、15pl、20pl、25pl，注 入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。另精密吸取上述供試品溶液2025pl，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素BB2、GG2的量，計算，即得。6注意事項6.1本實驗應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。6.2殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有 10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。實 驗廢液也需加入次氯酸鈉進(jìn)行處理。6.3紫外線對低濃度黃曲霉素有一定的破壞性，所以混合黃曲霉毒素對照品儲 備液應(yīng)配制在棕色容量瓶

6、中，并避光保存。混合黃曲霉毒素對照品溶液則需臨用 新配嗎，并注意避光。6.4當(dāng)供試品試液進(jìn)樣量超過20Ml時，為保證獲得良好的額色譜峰形，供試液 制備中最后可用水稀釋至刻度。6.5隨行回收綠：加標(biāo)濃度1.0p g/Kg,回收率應(yīng)在50%120%；加標(biāo)濃度110 p g/Kg，回收率應(yīng)在70%110%。6.6方法檢出限以黃曲霉毒素b1計應(yīng)不得高于0.5p g/Kg。7附注：光化學(xué)衍生法除上述中國藥典2010版已收載的柱后碘衍生-熒光檢測測定方法外，柱后 光化學(xué)衍生-熒光檢測測定方法在儀器性能和測定的穩(wěn)定性方面也有明顯的優(yōu) 勢。7.1儀器與用具光化學(xué)衍生器7.2色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：40C； 以甲醇-乙臘-水為流動相，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速1