內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟(總結(jié),)

1、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟（總結(jié),）.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：1材料與方法11材料111新生兒臍帶在無菌條件下，于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生胎兒臍帶。長度20cm，兩端扎緊投入到4弋臍帶保存液中，1h內(nèi)送細(xì)胞培養(yǎng)室。1.1.2儀器與試劑倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化儀器廠）；5%C02培養(yǎng)箱（美國Heraeus公司）；離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；25cm2培養(yǎng)瓶、六孔培養(yǎng)板（美國CA）star公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；促內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物（ECGS）、M199培養(yǎng)基、I型膠原酶（美國Sigrna公司）；明膠、胰酶（美國A1Tlresco公司）；滅菌生理鹽水（錦州醫(yī)

2、學(xué)院附屬第一醫(yī)院制劑室）；鼠抗人V皿因子單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。2方法1.2.1試劑配制：（1）臍帶保存液：生理鹽水、葡萄糖100mmoL/L、100U/ml青霉素一100U/m1鏈霉素。磷酸鹽緩沖液（PBs）。（3）DHanks液。（4）0.1%I型膠原酶：用PBS配制。（5）0.05%胰酶一0.02%乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）溶液：用DHanks液配制。肉內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液：含20%胎牛血清、ECGS、肝素，100U/m1青霉素一100U/m1鏈霉素的M199培養(yǎng)基。（7）0.2%明膠：用PBS配制。以上試劑均過濾除菌。122人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原

3、代培養(yǎng)：參照J(rèn)affe和LinS等方法并加以改進(jìn)。在無菌條件下取新生胎兒臍帶，長度20cm。剪去臍帶兩端和臍帶上有夾痕及血腫部分，盡量擠干凈臍帶內(nèi)血液。用生理鹽水沖洗臍帶表面至無血色。用輸血器內(nèi)接有穿刺器的軟管，找到臍靜脈，將軟管針頭一端插入臍靜脈，用止水夾固定，另一端接20m1注射器，吸取PBS反復(fù)沖洗臍靜脈直至無血色液體流出為止；將臍帶另一端用止血鉗夾閉，向臍靜脈中灌入0.1%I型膠原酶溶液，使之充盈，夾閉軟管，37弋水浴中孵育20min,其間輕輕擠壓并旋轉(zhuǎn)臍帶，以使酶溶液充分接觸血管內(nèi)壁，然后將細(xì)胞一酶溶液收集于預(yù)先裝有溫培養(yǎng)液小三角瓶中。用2倍于消化液的溫PBS沖洗臍靜脈，一并收集于小

4、三角瓶中，將細(xì)胞懸液裝入10ml離心管，1000r/min離心10min,棄上清，吹打懸浮，再次離心10min,重懸細(xì)胞并接種于鋪有明膠的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于3TC5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液1次。1.2.3人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)原代細(xì)胞融合80%以上后，加入0.05%胰蛋白酶一0.02%EDTA溶液消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞皺縮變圓、彼此分離時(shí)棄消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液。1000r/min離心10min,棄上清，制成單細(xì)胞懸液。此時(shí)可用0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞百分率，并以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1x105

5、個(gè)/ml,接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿，彼此融合成片時(shí)依上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。補(bǔ)充：1.材料：a:臍帶20cm:建議最好不要取這么長，1015cm不會(huì)影響得到的細(xì)胞數(shù)，因?yàn)槟銢_洗臍帶的時(shí)候要把它垂直的提起來，以觀察底部流出液體的顏色，要是太長的話，在超凈臺(tái)里很難做到的！b:臍帶保存液：生理鹽水、葡萄糖100mmoL/L、100U/ml青霉素一100Um1鏈霉素:建議將雙抗的量改為十倍，1000u/l，因?yàn)樵畲蟮臄橙司褪俏廴?，而第一步的取材是最容易污染的，所以要加大量，以后培基里就可以不加雙抗了，因?yàn)榭股貙?duì)細(xì)胞的生長不利。方法（你的不是很詳細(xì)噢，補(bǔ)充幾點(diǎn)）a:般15cm左右的

6、臍帶用8ml膠原酶就可以了b:37度消化時(shí)間不要20min，那樣會(huì)消化很多雜質(zhì)比如成纖維細(xì)胞下來的，15cm足以c:傳代的時(shí)候用0.25的胰酶，這樣就不用離心了，效果也還不錯(cuò)的說內(nèi)皮細(xì)胞在異種排斥反應(yīng)中的作用(REVIEW)目前異種移植的排斥反應(yīng)主要包括超急性排斥反應(yīng)(hyperacuterejection,HAR)、急性血管性排斥反應(yīng)力cutevascularrejectionJ或稱延遲性排斥反應(yīng)(delayedxenograftrejection,DXR)和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。其中移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞活化所引起的一系列病理改變是引起異種排斥反應(yīng)的主要環(huán)節(jié)1。由于內(nèi)皮細(xì)胞是移植物與受者免疫系統(tǒng)

7、之間最直接的屏障，內(nèi)皮細(xì)胞不僅是移植排斥反應(yīng)主要的靶部位，而且本身的一系列反應(yīng)也介導(dǎo)了移植物的損傷，扮演著雙重身份。內(nèi)皮細(xì)胞的活化是由于天然抗體的結(jié)合和補(bǔ)體活化所產(chǎn)生的應(yīng)答和相互作用的結(jié)果，是HAR和DXR發(fā)生的主要原因2。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活化可以延長異種移植物在受者體內(nèi)的存活時(shí)間。鑒于其在異種排斥中的重要地位，內(nèi)皮細(xì)胞的研究越來越受到移植學(xué)者的關(guān)注。一、內(nèi)皮細(xì)胞的活化血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管腔內(nèi)膜表面，為單層緊密排列、互相聯(lián)結(jié)的一層薄膜，構(gòu)成了一道循環(huán)血液與局部組織之間的屏障。這種靜息的內(nèi)皮細(xì)胞不具有激活凝集素和抑制白細(xì)胞的附壁功能，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞的表面表達(dá)或分泌許多有助于抗凝和

8、行使其它功能的分子，包括：NO、前列腺素、血管緊張素、內(nèi)皮素、硫酸肝素、血栓調(diào)節(jié)素和ATPDase(CD39)等，使內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)血管緊張性、維持凝血平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和抑制炎癥反應(yīng)等功能2,3。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷或與IL-1、腫瘤壞死因子和內(nèi)毒素等接觸后，即發(fā)生一系列代謝和結(jié)構(gòu)的變化，這一過程稱為內(nèi)皮細(xì)胞激活。移植物恢復(fù)血供后，受者異種天然抗體首先接觸的靶細(xì)胞就是供者移植物的血管內(nèi)皮細(xì)胞，之后進(jìn)一步結(jié)合，激活補(bǔ)體，引起移植物內(nèi)皮細(xì)胞活化2。Bach將異種排斥反應(yīng)中內(nèi)皮細(xì)胞的激活分可為2個(gè)階段：早期階段由補(bǔ)體活化產(chǎn)物誘導(dǎo)，無基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，稱I型激活，包括：內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化，表面硫酸肝

9、素丟失,P-選擇素和vWF(vonWillebrandfactor)在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，與HAR關(guān)系密切；口型內(nèi)皮細(xì)胞激活涉及到基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)粘附分子、細(xì)胞因子和前凝血因子等，與DXR相關(guān)1,4。其中在口型內(nèi)皮細(xì)胞激活過程中核轉(zhuǎn)錄核因子(NuclearFactor-KB,NF-kB)起到非常重要的作用，NF-kB是一種基因多顯性轉(zhuǎn)錄因子,在靜息內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，NF-kB和IkB結(jié)合形成異二聚體，能抑制NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核。內(nèi)皮細(xì)胞的活化涉及一些基因的激活，包括粘附分子(如E-選擇素，ICAM-1、細(xì)胞因子(如IL-1、IL-8等)、生長因子和凝血系統(tǒng)一些成分的基因，這些基

10、因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有NF-kB的結(jié)合部位，內(nèi)皮細(xì)胞活化后，IkB磷酸化降解，導(dǎo)致NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核，與這些基因啟動(dòng)子上的NF-kB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)這些基因的表達(dá)4,5。內(nèi)皮細(xì)胞活化后可以多種途徑進(jìn)行應(yīng)答，產(chǎn)生一系列活化后反應(yīng)2，包括：內(nèi)皮細(xì)胞收縮、血管失去完整性、內(nèi)皮下基質(zhì)暴露、細(xì)胞和蛋白質(zhì)從血管內(nèi)進(jìn)入器官組織，導(dǎo)致出血和水腫；粘附分子表達(dá)增加，例如，E-選擇素、ICAM-I等；分泌多種細(xì)胞因子和其它分子，例如IL-1、IL-6、IL-8和PAF等；參與多種造成抗凝與促凝之間失衡的機(jī)制等。由于NF-kB在內(nèi)皮細(xì)胞活化的機(jī)制中起著非常重要的作用，所以抑制NF-kB的活性可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活

11、。最初抑制NF-kB的研究集中在IkB的過度表達(dá)kB是NF-kB的天然抑制劑kB的過度表達(dá)能有效的抑制IkB，阻止促炎基因的上調(diào)，但可增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TNF介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。利用P65基因的突變體P65RHD，能阻斷NFkB的活化，抑制促炎基因的上調(diào)表達(dá)，而且并不增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，另外P65基因突變體的作用效果也證實(shí)了在DXR中口型內(nèi)皮細(xì)胞激活的假設(shè)4,6。此外，利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染移植物內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)抗凋亡基因A20,bcl-2和bcl-xl等不僅可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而且能抑制NF-kB的活性，阻止促炎基因的提高表達(dá),抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化7,8。因此，可以應(yīng)用轉(zhuǎn)

12、基因技術(shù)使移植器官血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)這些保護(hù)性基因，達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化的目的。二、內(nèi)皮細(xì)胞與異種抗體1.異種反應(yīng)性天然抗體受者體內(nèi)的異種反應(yīng)性天然抗體(xenoreactivenaturalantibodies,XNA)介導(dǎo)的補(bǔ)體激活，損傷并激活移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致移植物彌漫性血管內(nèi)凝血等病理機(jī)制是引起HAR的最主要原因。天然抗體是指那些不需抗原刺激就在機(jī)體內(nèi)預(yù)存的抗體，不同種屬的生物之間相互有預(yù)存抗體。機(jī)體主要通過天然免疫而獲得特異性天然抗體，如ABO同種血凝素和異種反應(yīng)性天然抗體等。XNA可分為抗-Gal抗體和抗非-Gal抗體，其中抗-Gal抗體與供體器官血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的Gala1,

13、3-Gal抗原的相互作用是引起HAR最主要的原因。豬和人的內(nèi)皮細(xì)胞最顯著的表型差異就是豬內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)天然抗原半乳糖a1，3-半乳糖(Gala1,3-Gal),而且這種Gala1,3-Gal天然抗原正是阻礙豬到人異種移植的主要屏障。Gala1,3-Gal是在a1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(a1,3-GT)的作用下合成，人類和其他舊世界靈長類動(dòng)物的此基因在進(jìn)化中因基因缺失或替代成為假基因，所以人和舊世界靈長類動(dòng)物體內(nèi)不含有這種Gala1,3-Gal抗原決定簇。但人和舊世界靈長類動(dòng)物體內(nèi)預(yù)存有針對(duì)異種天然抗原Gala1,3-Gal的XNA，人體有1%B細(xì)胞可以產(chǎn)生抗-Gal抗體，天然抗-Gal抗體首先通過

14、胃腸道途徑，一些腸道細(xì)菌和特定菌群等持續(xù)刺激B細(xì)胞，使其產(chǎn)生天然抗-Gal抗體9。在非協(xié)調(diào)性異種移植實(shí)施后受者體內(nèi)的XNA將與異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的異種抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。Lambrigts等10在研究中將豬的器官移植給新生的狒狒(體內(nèi)無抗Gal-IgM但含有Gal-IgG),發(fā)現(xiàn)即使存在高濃度抗Gal-IgG也不會(huì)引起HAR，但如果將豬的器官移植給成年狒狒則發(fā)生HAR，說明在人類這種XNA主要為IgM抗體。當(dāng)有足夠的XNA存在的情況下，XNA與表達(dá)在異種移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞上的Gala1,3-Gal抗原迅速結(jié)合，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性凝血途徑，最終導(dǎo)致移植物出現(xiàn)彌漫性

15、血管內(nèi)凝血，而使移植物功能喪失?；赬NA與Gala1,3-Gal抗原的免疫應(yīng)答是引起HAR最重要的因素，迄今已經(jīng)采取了多種方法來降低或消除Gala1,3-Gal抗原誘導(dǎo)的HAR。例如，利用a-半乳糖苷酶可以剪切豬內(nèi)皮細(xì)胞表面的Gala1,3-Gal抗原決定簇，降低Gala1,3-Gal的表達(dá)11。另外Koma12在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，a1,2-巖藻糖苷轉(zhuǎn)移酶、a2,3-唾液?；D(zhuǎn)移酶、a2,6-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶和N-已酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶m都可與a1,3-GT競爭相同的受體底物而競爭性抑制其活性，顯著減少Gala1,3-Gal天然抗原在移植物內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)并且目前已經(jīng)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建出了表達(dá)

16、TH基因的轉(zhuǎn)基因豬13-15,這種轉(zhuǎn)基因豬Gala1,3-Gal天然抗原的表達(dá)水平較低，可以降低對(duì)XNA的反應(yīng)性，從而避免HAR的發(fā)生。但上述方法只是部分或暫時(shí)去除異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面的Gala1,3-Gal抗原決定簇，達(dá)到“功能性敲除”Gala1,3-Gal的目的，但剩余的Gala1,3-Gal抗原仍然足以活化補(bǔ)體系統(tǒng)，使得移植物功能喪失。研究表明，只有敲除異種移植物的Gala1,3-Gal基因，才能完全去除異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面的Gala1,3-Gal抗原決定簇16,17。目前已有一些研究中心成功培育出敲除了Gala1,3-Gal基因的小鼠，當(dāng)這些小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞暴露在人血清時(shí)，人體抗Ga

17、la1,3-Gal抗體與其結(jié)合比正常小鼠有顯著降低，從而抑制了人類補(bǔ)體的活化18。而且在最近研究中也已經(jīng)在克隆胎羊靶細(xì)胞中敲除了Gala1,3-GaI基因19。與此同時(shí)，在對(duì)豬的Gala1,3-Gal抗原的敲除研究中也取得了一定的進(jìn)展，2002年Scince和Nature分別報(bào)道了Lai等20利用核轉(zhuǎn)移技術(shù)成功的克隆了敲除a-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的豬，雖然他們只是敲除了等位基因上的一個(gè)a-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因位點(diǎn)，但在克服異種移植排斥反應(yīng)卻取得了突破性的進(jìn)展。目前PPLTherapeutics已經(jīng)獲得a-Gal雙等位基因敲除的純合子豬并將正式用于器官移植的前期試驗(yàn)來驗(yàn)證其作用和效果21。誘生抗體目

18、前可以利用清除受者體內(nèi)的天然抗體和補(bǔ)體等方法可以抑制HAR的發(fā)生，但這時(shí)異種移植器官的異種抗原就會(huì)刺激受者機(jī)體可以產(chǎn)生與天然抗體在功能上和結(jié)構(gòu)上都相似的抗體，稱之為誘生抗體。同天然抗體一樣，誘生抗體也能導(dǎo)致移植物廣泛血管內(nèi)皮損傷，使異種移植物功能喪失。HAR被抑制后，人和猴等非協(xié)調(diào)性器官移植受者將會(huì)誘生2種異種抗體9:高度特異性抗-Gal抗體；抗多種異種抗原抗體（抗非-Gal抗體）而且這2種抗體都是IgG家族和T細(xì)胞依賴性抗體。當(dāng)異種移植物進(jìn)入人體后，攜帶數(shù)目眾多的Gala1,3-Gal抗原決定簇的異種糖蛋白抗原被釋放入血，這些異種糖蛋白抗原通過其Gala1,3-Gal抗原決定簇與抗-GalB

19、細(xì)胞受體結(jié)合而相互作用，抗-GalB細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞將此抗原呈遞至輔助T細(xì)胞,在輔助T細(xì)胞的作用下完成使抗-GalB細(xì)胞完成活化和增殖22，在人體內(nèi)，這種活化最終導(dǎo)致大量高親和力抗a-Gal抗體IgG的產(chǎn)生9。這些抗體在移植后24周達(dá)到最高峰，并且在移植物存在時(shí)一直保持高效價(jià)，它們主要是IgG2亞型，可以導(dǎo)致抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC作用)。這種誘生的抗體反應(yīng)十分強(qiáng)烈，使用在同種移植中能夠抑制排斥反應(yīng)的免疫抑制劑的劑量并不能抑制此反應(yīng)9,23。但Buhler等24的研究發(fā)現(xiàn)抗CD40L抗體可以完全抑制誘生的抗-Gal抗體的產(chǎn)生，只是這種抑制作用是暫時(shí)的，一但停用抗CD40L抗

20、體，誘生抗-Gal抗體仍然會(huì)產(chǎn)生?？狗?Gal抗體的產(chǎn)生是由于豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有大量的異種抗原肽，在將豬的器官移植入人體內(nèi)時(shí)可以發(fā)生免疫反應(yīng)，在受者體內(nèi)產(chǎn)生大量抗非-Gal抗體，這些抗體是由數(shù)目眾多的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的9。應(yīng)用針對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫抑制方法可能會(huì)抑制這些抗體的產(chǎn)生，Buhler在研究中發(fā)現(xiàn)在將豬的單核細(xì)胞輸入狒狒體內(nèi)的模型中，應(yīng)用抗CD40L抗體和環(huán)抱素A也可以抑制抗非-Gal抗體的產(chǎn)生24。適應(yīng)(accommodation)雖然異種抗體可以與異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞上的異種抗原發(fā)生作用，導(dǎo)致異種排斥反應(yīng)的發(fā)生。但這種異種抗體與異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用并不總是導(dǎo)致移植物損傷

21、，有些時(shí)候，這種相互作用會(huì)形成一種適應(yīng)狀態(tài)25，這種現(xiàn)象最初是由Platt等26在進(jìn)行ABO血型不相符的同種腎移植時(shí)發(fā)現(xiàn)的。研究表明長期清除受者天然抗體和抑制補(bǔ)體系統(tǒng)以防止血管排斥反應(yīng)可能并非必不可少。根據(jù)ABO血型不相容同種移植經(jīng)驗(yàn)，在移植物植入前后去除天然抗體和補(bǔ)體及抑制其他因子，一段時(shí)間后即使天然抗體和補(bǔ)體及其他因子恢復(fù)到正常水平后也不能刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化引起排斥反應(yīng)，其可能原因是在移植物植入后且天然抗體“不存在”的期間，移植物內(nèi)皮細(xì)胞有相當(dāng)?shù)臅r(shí)間從低溫暴露，低氧應(yīng)激和再灌注所造成的損傷中恢復(fù)正常。在異種移植中也可觀察到同樣的現(xiàn)象2，如Bach等用抗p抗體和抗IgM-XNA免疫抑制劑清除I

22、gM-XNA數(shù)周后植入異種器官，獲得延遲排斥效果，數(shù)周后即使天然抗體水平恢復(fù)，也不出現(xiàn)排斥反應(yīng)27。Delirouras等25發(fā)現(xiàn)，豬內(nèi)皮細(xì)胞暴露于低水平的人類抗體中,6天后可以獲得對(duì)抗TNF-a介導(dǎo)的凋亡的能力。說明這種異種抗體與異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用對(duì)異種移植還有著“積極”的一面。Cooper對(duì)之作了定義28：如果應(yīng)用抑制天然抗體和補(bǔ)體的方法，使異種移植物存活一定時(shí)間(23周)，而后停止治療，若在天然抗體和補(bǔ)體滴度回升時(shí)，排斥反應(yīng)仍不發(fā)生，這一現(xiàn)象稱為“適應(yīng)”(accommodation)，也被稱為機(jī)體對(duì)抗體和補(bǔ)體的“獲得性抵抗力”。適應(yīng)表現(xiàn)為:改變抗移植物抗體，使更少的抗體與移植物

23、結(jié)合或結(jié)合力減弱；改變?nèi)梭w器官內(nèi)皮細(xì)胞上的抗原表達(dá)，如靶物質(zhì)的糖類加上唾液酸基因，可保護(hù)它們不與天然抗體結(jié)合；改變移植物血管對(duì)抗體和補(bǔ)體損傷的易感性等。而內(nèi)皮細(xì)胞的變化可能是上述改變的本質(zhì)原因2。在未處理的受者，一旦異種移植器官血流再通，它的每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞上就有多達(dá)100000個(gè)天然抗體分子的沉積，隨后導(dǎo)致補(bǔ)體沉積，內(nèi)皮細(xì)胞將在幾秒或幾分鐘內(nèi)被突然大量地?fù)p傷。若在移植前去除天然抗體和補(bǔ)體，則可允許它們有機(jī)會(huì)慢慢恢復(fù)而“痊愈”，不產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞如此大量地?fù)p傷?！叭钡膬?nèi)皮細(xì)胞在其對(duì)恢復(fù)的天然抗體應(yīng)答中，可能積極干擾超急性排斥反應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答過程。首先，內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后的初期不僅出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-

24、kB的活化（NF-kB在許多特征性基因的上調(diào)中起重要的作用），而且也出現(xiàn)一個(gè)編碼I-kB（NF-kB抑制因子）樣分子的基因上調(diào)-kB蛋白能與NF-kB結(jié)合而抑制NF-kB功能，這樣，衣賴于NF-kB而上調(diào)的基因及其可能參與超急性排斥反應(yīng)的基因產(chǎn)物將不能上調(diào)，因而在造成“適應(yīng)”的一定條件下I-kB活性超過NF-kB，可防止內(nèi)皮細(xì)胞活化，從而引起“適應(yīng)”，而不是超急性排斥反應(yīng)。其次，有條件地刺激內(nèi)皮細(xì)胞既可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的毒素敏感，又可誘導(dǎo)其對(duì)相同毒素的適應(yīng)2。三、內(nèi)皮細(xì)胞和補(bǔ)體在異種移植導(dǎo)致移植物損傷中受者補(bǔ)體起到關(guān)鍵的作用，其激活是異種排斥反應(yīng)發(fā)生的基本步驟。通常認(rèn)為異種移植中補(bǔ)體激活

25、是由異種天然抗體所觸發(fā)，抗體特異性與異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，粘附C1q，啟動(dòng)補(bǔ)體經(jīng)典途徑。但另有研究發(fā)現(xiàn)，豬內(nèi)皮細(xì)胞也可以同時(shí)激活人補(bǔ)體激活的經(jīng)典和旁路途徑2。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體在內(nèi)皮細(xì)胞活化，導(dǎo)致HAR過程中起著重要的作用。補(bǔ)體與天然抗體沉積在內(nèi)皮細(xì)胞表面，活化補(bǔ)體成分可把信號(hào)傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化。此外，補(bǔ)體裂解產(chǎn)物如C5a具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化、化學(xué)活化、脫顆粒和呼吸爆發(fā)的功能，以及可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞整合素與內(nèi)皮細(xì)胞上配體的親和力。C5a還可以刺激巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放TNF和IL-1,而TNF和IL-1又可以活化內(nèi)皮細(xì)胞，且這些細(xì)胞亦可直接以活化形式與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)一步加劇排斥反

26、應(yīng)2。研究發(fā)現(xiàn)1%的人補(bǔ)體即可激活豬內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞上的硫酸肝素的丟失，5的補(bǔ)體可以刺激豬內(nèi)皮細(xì)胞從抗凝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌隣顟B(tài)。但補(bǔ)體并不能像細(xì)胞因子那樣直接激活內(nèi)皮細(xì)胞，而是通過誘導(dǎo)IL-1a分泌來激活內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)用IL-1受體拮抗劑和抗IL-1抗體可以抑制補(bǔ)體激活內(nèi)皮細(xì)胞而導(dǎo)致的凝血和炎癥反應(yīng)，從而證實(shí)了IL-1在補(bǔ)體激活內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制中的重要作用29。目前大致采用2種主要方法防止補(bǔ)體激活：應(yīng)用高純度眼睛蛇毒因子或可溶性補(bǔ)體受體I來消耗補(bǔ)體；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使異種移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人源補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白來抑制補(bǔ)體的活化。尤其在利用轉(zhuǎn)人源補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因方面取得了一定的進(jìn)展，人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白主要包

27、括衰變加速因子(DAF/CD55)、膜輔助因子(MCP/CD46)、膜反應(yīng)性溶解抑制物(MIRL/CD59)等。其中CD46能抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成，從而抑制補(bǔ)體的激活。CD59可以阻斷攻膜復(fù)合體(MAC)的形成，避免其對(duì)移植物的損傷。DAF可以抑制C3b和MAC在豬內(nèi)皮細(xì)胞上的沉積30。近年來在異種移植研究中發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使豬內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)基因豬在一定程度上可以抑制天然抗體所介導(dǎo)的補(bǔ)體活化，使移植物免遭超急性排斥反應(yīng)的損傷作用31，32,33。最近的研究還表明表達(dá)人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子CD46，DAF和CD59的豬能夠合成與人類自身相似的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)34,并且聯(lián)合轉(zhuǎn)染多種補(bǔ)體調(diào)

28、節(jié)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因豬的效果明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)染一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子，例如，轉(zhuǎn)DAF和CD59的轉(zhuǎn)基因豬效果優(yōu)于轉(zhuǎn)染單一DAF的轉(zhuǎn)基因豬；聯(lián)合轉(zhuǎn)染CD46與DAF也有相似的效果35。另外Shiraishi等36應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)CD55、CD46和CD59三個(gè)基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以明顯的抑制補(bǔ)體激活，其效果也遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于轉(zhuǎn)染單一基因。四、內(nèi)皮細(xì)胞與凝血異種移植常伴隨顯著的凝血功能異常，血小板活化及血管損傷。實(shí)際上移植物血管內(nèi)凝血是異種移植排斥反應(yīng)的特征之一37。凝血過程的激活與受者免疫應(yīng)答關(guān)系密切，在血管化異種移植中纖維蛋白沉積與血小板聚集是復(fù)雜排斥反應(yīng)過程中免疫和炎癥反應(yīng)的結(jié)果。在這一機(jī)制中，內(nèi)皮細(xì)

29、胞的激活與否起到十分關(guān)鍵的作用2。正常的內(nèi)皮細(xì)胞表面含有許多有助于抗凝和行使其他功能的分子，其中最重要的2種為硫酸肝素和血栓調(diào)節(jié)素。硫酸肝素由一個(gè)蛋白質(zhì)核心和與之相連的糖胺聚糖鏈組成，當(dāng)抗凝血酶皿與硫酸肝素連結(jié)后即活化成為一種強(qiáng)有力的抗凝劑，干擾凝血途徑中的關(guān)鍵成分凝血酶及其他因子的作用；與硫酸肝素連結(jié)的還有超氧化物歧化酶(SOD),它可以破壞與活化內(nèi)皮細(xì)胞連結(jié)的活化中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的氧基團(tuán)（O2-）。血栓調(diào)節(jié)素可與凝血酶結(jié)合，使血液中存在的蛋白C（PC）成為活化PC（APC）,與血液中另一成分蛋白S一起通過破壞凝血因子Va和VMa來干擾凝血途徑的激活，進(jìn)而阻礙血栓形成，即具有抗凝作用。ATP

30、Dase（CD39）是表達(dá)在靜息內(nèi)皮細(xì)胞表面的另一種分子，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞激活后其活性降低。ATPDase有將腺苷酸三磷酸（ATP）和腺苷酸二磷酸（ADP）代謝成腺苷酸環(huán)腺苷一磷酸（AMP）的功能。在5-核苷酸酶的作用下，AMP轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘账?。ADP可以強(qiáng)烈刺激血小板聚集，ATP和ADP都可以刺激多種細(xì)胞變?yōu)橹卵准?xì)胞。所以ATPDase去除ATP、ADP可以消除ATP、ADP的促凝血和致炎的刺激。另外，腺苷酸也有抗凝血、抗炎癥刺激的功能，所以ATPDase還可以通過促進(jìn)腺苷酸的合成來抑制血小板聚集和炎癥反應(yīng)38。內(nèi)皮細(xì)胞活化后，使血管的完整性受損與基質(zhì)相聯(lián)的組織因子（tissuefactor,TF）增

31、加。活化內(nèi)皮細(xì)胞表面也可表達(dá)TF,這些TF的暴露，使得活化內(nèi)皮細(xì)胞因子或因子Wa能與之結(jié)合，啟動(dòng)外源性凝血過程。另外活化的內(nèi)皮細(xì)胞激活補(bǔ)體，引起補(bǔ)體連鎖激活啟動(dòng)的凝血途徑可能也是異種移植排斥反應(yīng)中廣泛血栓形成的部分原因2。正如Fecke等發(fā)現(xiàn)非協(xié)調(diào)性異種移植排斥反應(yīng)依賴于天然抗體和豬內(nèi)皮細(xì)胞上的Gala1,3-Gal天然抗原的相互作用。這種相互作用使補(bǔ)體活化，且活性物質(zhì)沉積于細(xì)胞膜上導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血栓形成39。其中多種機(jī)制可造成抗凝（與靜息內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)）和促凝（與活化內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)）之間的失衡2:血小板活化因子(PAF)可促進(jìn)血小板的活化及血小板血栓的形成；內(nèi)皮細(xì)胞活化可誘導(dǎo)硫酸肝素缺失

32、，導(dǎo)致抗凝血酶皿作用消失，這種缺失需有天然抗體和補(bǔ)體，天然抗體加上C5a已足夠介導(dǎo)此缺失，其與補(bǔ)體連鎖激活的整個(gè)過程無關(guān);血栓調(diào)節(jié)素在內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)缺失而喪失與凝血酶結(jié)合的能力；纖維蛋白溶解酶原激活因子，可以破壞纖維蛋白凝塊，而內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)纖維蛋白溶解酶原激活因子抑制物(PAI-1)的分泌可抑制纖維蛋白溶解酶原激活因子的天然作用，存在-個(gè)與PAI-1產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)促凝血作用；含有攻膜復(fù)合體成分的活化內(nèi)皮細(xì)胞胞膜破裂，凝血酶原酶激活而導(dǎo)致凝血；當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到天然抗體加補(bǔ)體的刺激時(shí)，最重要的途徑可能是由于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子，引起因子轉(zhuǎn)化為Wa,隨后發(fā)生凝血連鎖反應(yīng)。血小板的生理和病理生理學(xué)功

33、能被普遍認(rèn)為可以導(dǎo)致組織損傷和炎癥反應(yīng)。目前的研究已經(jīng)證明活化的血小板可以引起內(nèi)皮系統(tǒng)的活化，血小板與內(nèi)皮系統(tǒng)的相互作用在移植后早期發(fā)揮重要作用40。血小板的活化、聚集亦與活化內(nèi)皮細(xì)胞釋放的TXA2和PAF明顯升高關(guān)系密切。另外,血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的初始結(jié)合還依賴血小板受體GPIb和內(nèi)皮下基質(zhì)中的VonWillebrand因子(vWF)的相互作用，人的GPIb和vWF之間相互作用可以誘導(dǎo)血小板的活化，但這種作用依賴于血管切應(yīng)力。豬的vWF也可以與人的GPIb相互作用誘導(dǎo)血小板聚集，與人和人之間不同的是，豬與人之間的這種相互作用并不依賴于血管切應(yīng)力的影響。Xu等41在DXR的研究中發(fā)現(xiàn)，移植物內(nèi)皮

34、細(xì)胞和受者血小板之間的相互作用在異種排斥反應(yīng)的凝血過程起著至關(guān)重要的作用，表達(dá)CD40L的人血小板和表達(dá)CD40的豬內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用可導(dǎo)致豬內(nèi)皮細(xì)胞的活化，且此活化可以被抗CD40L的單克隆抗體直接抑制表明此相互作用在DXR的凝血機(jī)制中起到一定的作用，而且可以利用抗CD154單克隆抗體作為治療非協(xié)調(diào)性異種移植排斥反應(yīng)的一種有效方法。血小板活化產(chǎn)生的微量凝血酶可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的顯著改變。包括誘導(dǎo)組織因子活化和釋放E-選擇素，分泌型內(nèi)皮素-1。這些變化在一定程度上是由于血小板表面轉(zhuǎn)化生長因子修飾的IL-1的作用，并受分泌型轉(zhuǎn)化生長因子-0(TGF-0)的調(diào)控23。Chen等42在研究活化的內(nèi)

35、皮細(xì)胞激活凝血因子的作用時(shí)，測試了因子Xa和凝血酶是否能激活豬內(nèi)皮細(xì)胞，以及表達(dá)組織因子通路抑制劑和水蛭素-CD4融合蛋白是否能抑制這種內(nèi)皮細(xì)胞的活化，結(jié)果顯示，用人因子Xa和凝血酶孵化的豬內(nèi)皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)E-選擇素、VCAM和組織因子，并且此表達(dá)呈時(shí)間和濃度依賴性。相反，轉(zhuǎn)染人組織因子通路抑制劑-CD4(TFPI-CD4)融合蛋白的豬內(nèi)皮細(xì)胞可以選擇性地抵御因子Xa的促炎效應(yīng)；同樣地，轉(zhuǎn)染水蛭素-CD4融合蛋白的豬內(nèi)皮細(xì)胞也可以選擇性地抵御凝血酶的促炎效應(yīng)。若因子Xa和凝血酶合并應(yīng)用則可增強(qiáng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活化能力，共同表達(dá)TFPI-CD4融合蛋白和水蛭素-CD4融合蛋白的豬血管

36、內(nèi)皮細(xì)胞則可以完全抑制Xa和凝血酶誘導(dǎo)的VCAM上調(diào)表達(dá)。另外，Henn43和Rushworth等44研究發(fā)現(xiàn)極少量的凝血酶就可以刺激血小板CD40L表達(dá)，并與血小板膜表面組成表達(dá)的CD40分子結(jié)合后，可導(dǎo)致血小板的聚集和釋放；與此同時(shí)血小板表面的CD40L還可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD40分子結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。最近的體外實(shí)驗(yàn)研究表明豬外周血祖細(xì)胞(PBPC)能誘導(dǎo)狒狒血小板聚集45，當(dāng)大于90%的血小板聚集被抑制后，血栓性微血管病(thromboticmicroangiopathy，TM)被延遲46。說明這種PBPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化是在輸注入豬PBPC的狒狒體內(nèi)產(chǎn)生TM的機(jī)制之一。但

37、這種TM并不是PBPC引起內(nèi)皮細(xì)胞的活化而產(chǎn)生的，而是PBPC與血小板直接作用而導(dǎo)致的，或者還受補(bǔ)體系統(tǒng)的影響45。研究證明，經(jīng)過人XNA和補(bǔ)體刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞具有抗溶解纖維蛋白原的功能，說明這種抗溶解纖維蛋白原活性與異種移植排斥反應(yīng)血栓形成有關(guān)46。另外內(nèi)皮細(xì)胞受損后釋放的核苷酸能促進(jìn)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞活化，而表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的ATPDase可使ATP和ADP降解成AMP，最終形成有潛在抗血小板聚集和抗炎癥反應(yīng)能力的腺苷，因此內(nèi)皮細(xì)胞喪失ATPDase活性是促進(jìn)移植物損傷和血栓形成的原因之一37。另外，NK細(xì)胞激活內(nèi)皮細(xì)胞也可以使內(nèi)皮細(xì)胞從抗凝狀態(tài)轉(zhuǎn)為促凝狀態(tài)，從而促進(jìn)異種移植物血管內(nèi)凝

38、血47。以往影響異種排斥反應(yīng)凝血過程的治療方法主要是應(yīng)用肝素相關(guān)藥物、抗血小板藥物、抗組織因子藥物和抗凝血酶藥物等抗凝血藥物。近來在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，利用基因工程技術(shù)使豬內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人血栓調(diào)節(jié)素(Thrombomodulin,TBM)、人ATPDase和人組織因子通路抑制劑(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)等均能不同程度地抑制異種移植物內(nèi)血栓的形成48。其中血栓調(diào)節(jié)素(TBM)是表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上的一種重要的調(diào)節(jié)凝血酶的分子，但豬的TBM和人的凝血酶及蛋白C有著不相容性，因此在豬內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)人的TBM就可以調(diào)節(jié)移植物的凝血平衡。另外利用人TFPI可以抑制人凝血

39、因子X和組織因子復(fù)合物的活性這一機(jī)理，使豬內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人TFPI可以抑制異種移植排斥反應(yīng)中血管內(nèi)凝血的發(fā)生4。最近Cowan等49在研究中發(fā)現(xiàn)重組抗凝血酶III在豬到人異種移植中可以改善早期移植物的破壞和抑制血管內(nèi)凝血的發(fā)生。五、內(nèi)皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞研究表明異種移植排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，有多種炎性細(xì)胞侵潤移植物，如NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。NK細(xì)胞和單核細(xì)胞可以大量浸潤異種移植物，而且活化的內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子可以使異種移植物發(fā)生炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)血栓形成。內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是免疫攻擊的靶細(xì)胞，同時(shí)也通過與抗體間的相互作用和調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用來激活內(nèi)皮細(xì)胞，使

40、內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝功能變?yōu)榇倌?，加之炎性?xì)胞的浸潤，使得移植物遭受排斥反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)，一系列細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)增加，如E-選擇素和ICAM-I等。而中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞可表達(dá)與活化內(nèi)皮細(xì)胞上E-選擇素和ICAM-I等粘附分子有親和力的配體并與之結(jié)合。另外內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)還分泌多種細(xì)胞因子和其它分子，包括IL-1、IL-6、IL-8及PAF。IL-1可活化單核細(xì)胞等血細(xì)胞，IL-8是白細(xì)胞的化學(xué)趨化因子，而PAF則可以激活中性粒細(xì)胞2。白細(xì)胞從血管腔內(nèi)遷移到局部組織的這一過程受到粘附分子包括選擇素、整合素、免疫球蛋白家族和趨化因子家族的調(diào)控。內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的E-選

41、擇素、P-選擇素和表達(dá)在白細(xì)胞表面的L-選擇素通過與其對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合而誘導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)，而且這種滾動(dòng)所需要的牢固的粘附可以通過白細(xì)胞整合素（CD11a/CD18，CD11b/CD18，CD11c/CD18，和CD49d/CD29）結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞免疫球蛋白超家族（ICAM-1，-2，-3和VCAM-1）來執(zhí)行。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子有助于整合素的活化和結(jié)合。另外急性跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移步驟與另一種免疫球蛋白超家族CD31或PECAM-1有關(guān)，通過嗜同種抗體和嗜異種抗體的相互作用使白細(xì)胞利于遷移通過內(nèi)皮細(xì)胞層和基底層。這一浸潤過程在異種排斥反應(yīng)移植物功能喪失的機(jī)制中發(fā)揮重要的作用50。免疫組

42、化分析提示，異種移植物浸潤的細(xì)胞中NK細(xì)胞占很大比例，說明NK細(xì)胞的激活和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用是異種移植的障礙之一。NK細(xì)胞通過兩種方式粘附到內(nèi)皮細(xì)胞，參與內(nèi)皮細(xì)胞的溶解破壞51:NK細(xì)胞通過NK細(xì)胞Fc受體（FcYH:CD16）結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞所介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性作用（ADCC）;NK細(xì)胞通過其表面分子和內(nèi)皮細(xì)胞表面MHCI類分子的相互作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用。這2種方式都通過NK釋放的穿孔素和顆粒酶來發(fā)揮效應(yīng)。Cascalho等52認(rèn)為有3種機(jī)制誘導(dǎo)NK的毒性作用：異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞上的MHC-1類分子不能與NK細(xì)胞抑制受體相互作用；異種反應(yīng)抗體IgG結(jié)合豬內(nèi)皮細(xì)胞可以刺激人

43、NK細(xì)胞上的Fcy口受體；豬內(nèi)皮細(xì)胞上的a-Gal抗原決定簇可以刺激人NK細(xì)胞上的外源凝集素受體。另外Smyth等53還發(fā)現(xiàn)人NK細(xì)胞可以促進(jìn)異種抗原的表達(dá)，從而誘導(dǎo)對(duì)異種移植物的直接免疫應(yīng)答。人類NK細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子例如TNFa、IL-10、IFN-y和IL-3，它們都可以作用于豬內(nèi)皮細(xì)胞，且人NK細(xì)胞激活豬內(nèi)皮細(xì)胞后，可使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)E-選擇素和IL-8。在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)異種內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生的低水平的細(xì)胞毒性作用，而且當(dāng)有異種抗體IgG存在時(shí)，這種毒性作用可被加強(qiáng)。更重要的是，NK細(xì)胞還可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞具有的抗凝功能轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌δ?。Miyagawa等54發(fā)現(xiàn)降低a

44、-Gal抗原決定簇在豬內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)后，豬內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性也有降低，說明a-Gal抗原決定簇可以影響人NK細(xì)胞和豬內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。但也有一些學(xué)者認(rèn)為人NK細(xì)胞和豬內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用并不依賴于a-Gal抗原決定簇。利用豬VCAM-I特異性的單克隆抗體可以減少NK和單核細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞的跨膜遷移，因此應(yīng)用這種單克隆抗體有可能抑制異種移植中炎性細(xì)胞的浸潤55。非經(jīng)典MHC-I類分子HLA-G和HLA-E可以與NK細(xì)胞上的抑制受體結(jié)合從而抑制NK細(xì)胞的溶細(xì)胞作用。Forte等56在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，HLA-G分子可以與NK細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞抑制性受體ILT-2結(jié)合，從

45、而抑制NK細(xì)胞生物學(xué)活性。在體外實(shí)驗(yàn)中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人HLA-G基因，可以明顯的抑制NK細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和殺傷作用。Matsunami等57的研究也表明HLA-G或HLA-E基因轉(zhuǎn)染的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞可以抑制NK細(xì)胞的溶細(xì)胞作用，而且聯(lián)合轉(zhuǎn)HLA-G和HLA-E基因可以增強(qiáng)對(duì)NK細(xì)胞的抑制功能。另外最近研究證明豬內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)人麗T細(xì)胞介導(dǎo)的異基因毒性反應(yīng)有高度的敏感性?；罨娜薡5T細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞有排斥反應(yīng)作用。Y5T細(xì)胞的細(xì)胞毒性對(duì)異種基因內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能是異種移植的一大障礙。當(dāng)考慮應(yīng)用特殊方法抑制異種移植排斥反應(yīng)時(shí)，Y&T細(xì)胞可作為一研究重點(diǎn)58。綜上所述，內(nèi)皮

46、細(xì)胞的激活是異種排斥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，移植物內(nèi)皮系統(tǒng)是受者免疫系統(tǒng)最直接攻擊的靶部位，異種排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展都與移植物內(nèi)皮細(xì)胞的活化有著十分密切的聯(lián)系。移植物被植入異種受者體內(nèi)后，可以通過經(jīng)典途徑和替代途徑激活受者補(bǔ)體，最終形成攻膜復(fù)合體沉積于移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面，損傷和激活內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞活化后引起一系列的病理改變，包括其表面抗凝分子減少或丟失，使內(nèi)皮細(xì)胞表型由抗凝變?yōu)榇倌?，使血小板活化、聚集，最終形成移植物血管內(nèi)凝血，使移植物功能喪失。另外受者NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞對(duì)移植物內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用更加重了內(nèi)皮細(xì)胞的損害。雖然利用抑制補(bǔ)體和消除天然抗體等方法在一定程度上可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的

47、活化，但其功效只是暫時(shí)的。近來利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白或敲除天然抗原GalaL,3-Gal等研究已經(jīng)取得了突破，相信隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷成熟，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾供體器官血管內(nèi)皮細(xì)胞將成為克服異種排斥反應(yīng)的一種主要途徑。參考文獻(xiàn)*主要文獻(xiàn)*重要文獻(xiàn)1.SolvikUO,HaraldsenG,FianeAE,etal.Humanserum-inducedexpressionofE-selectinonporcineaorticendothelialcellsinvitroistotallycomplementmediated.Transplantation,

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