賽萊拉單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)

1、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展史及各技術(shù)平臺(tái)大比拼隨著近幾年的迅速發(fā)展，單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域，如：早期胚胎發(fā)育 到組織和器官發(fā)育、以及免疫學(xué)和腫瘤學(xué)。近兩年有多項(xiàng)成果發(fā)表在Nature、Science 和Cell等頂級(jí)雜志上。2018年12月21日，Science雜志發(fā)布了 “2018年度突破” （BREAKTHROUGH OF THE YEAR）榜單，共計(jì)10項(xiàng)突破性成果入選，單細(xì)胞測(cè)序揭示胚胎發(fā) 育更是當(dāng)選“2018年度突破”榜首，并預(yù)言單細(xì)胞技術(shù)將引領(lǐng)今后10年的生物醫(yī)學(xué)研究。1.為什么做單細(xì)胞測(cè)序即使來(lái)源相同的單個(gè)細(xì)胞，由于隨機(jī)生物過(guò)程和環(huán)境擾動(dòng)的原因，彼此在許多方面也存 在差異，

2、即細(xì)胞的異質(zhì)性。常見(jiàn)的基因組測(cè)序技術(shù)避免不了這一現(xiàn)象帶來(lái)的影響，基于這一 原因，研究人員開(kāi)啟了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的探索之路。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可謂是生物科技發(fā)展史 上的一大創(chuàng)舉。對(duì)于多細(xì)胞生物而言，其細(xì)胞與細(xì)胞之間存在著差異，且不同群體細(xì)胞間的差異不一。 這種差異不僅體現(xiàn)在形態(tài)上，也體現(xiàn)在遺傳信息上，例如基因組信息、基因表達(dá)水平等。雖 然同一個(gè)體所有細(xì)胞均來(lái)自于同一個(gè)受精卵，理論上細(xì)胞間基因組是一致的，但是在細(xì)胞分 裂和分化過(guò)程中，由于內(nèi)部隨機(jī)生物過(guò)程和外部環(huán)境擾動(dòng)的影響，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA序列發(fā) 生改變，比較典型的例子是腫瘤細(xì)胞VS正常細(xì)胞、不同腫瘤細(xì)胞亞型（腫瘤異質(zhì)性）（圖1）。圖1：腫瘤異質(zhì)性在基

3、因表達(dá)層面上，不同的細(xì)胞也具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組，例如心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，而即 便是那些看似相同的細(xì)胞集合，細(xì)胞之間的表達(dá)水平也存在巨大差異。而細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的 差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異質(zhì)性。人類基因組計(jì)劃（HGP）完成后，隨著測(cè)序技術(shù)尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，人 們對(duì)基因組變異/基因表達(dá)差異與表型之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻。然而傳統(tǒng)的Bulk測(cè)序手 段是針對(duì)細(xì)胞集合進(jìn)行測(cè)序，即所使用的材料是組織樣本或一大群培養(yǎng)細(xì)胞，針對(duì)這類樣本 的研究反映的是特定組織/細(xì)胞集合的平均水平，或者是特定組織/細(xì)胞集合的代表性信息， 而同一組織往往是由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，且單個(gè)細(xì)胞間表達(dá)的信息也千差萬(wàn)別，因此常規(guī) Bulk

4、測(cè)序時(shí)單個(gè)細(xì)胞特異性的信息往往被掩蓋，導(dǎo)致錯(cuò)失很多重要信息。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，常規(guī)Bulk測(cè)序研究已經(jīng)不能滿足科研需求，2011年，Nature Methods將單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得期待的技術(shù)之一；2013年1月，Science雜志將單 細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首；2014年1月，Nature Methods將單細(xì)胞 測(cè)序列為2013年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展，并且指出刊登在Nature系列雜志上的單細(xì)胞測(cè)序文章在2013年出現(xiàn)了大爆發(fā)。因此單細(xì)胞測(cè)序正在成為科研熱點(diǎn)。2018 年 12 月 21 日，Science雜志發(fā)布了 “2018 年度突破”（BREAKTHROUGH

5、OF THE YEAR）榜單，共計(jì)10項(xiàng)突破性成果入選，單細(xì)胞測(cè)序揭示胚胎發(fā)育更是當(dāng)選笠018年度突 破”榜首。處于發(fā)育早期的斑馬魚(yú)胚胎。熒光標(biāo)記了確定它們將成為的細(xì)胞類型的基因。（圖片來(lái)自Science）2.單細(xì)胞RNA測(cè)序發(fā)展歷程單細(xì)胞測(cè)序可以分為單細(xì)胞DNA測(cè)序（單細(xì)胞基因組測(cè)序）和單細(xì)胞RNA測(cè)序（單細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序），細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，1個(gè)細(xì)胞中含有的RNA只有1-10pg，這么少 的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到現(xiàn)有測(cè)序儀的最低上樣需求，因此對(duì)于單細(xì)胞RNA測(cè)序，首先要解決的問(wèn) 題是RNA擴(kuò)增。1990年，Norman Iscove課題組，使用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cDNA分子的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，首

6、次證實(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的。20世紀(jì)90年代初期，Eberwine等人發(fā)明了一種新技術(shù)，能夠從單個(gè)活神經(jīng)元細(xì)胞中獲 得cDNA，并且再以這些cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA，實(shí)現(xiàn)RNA的線性擴(kuò)增。2008年發(fā)展出了高通量RNA測(cè)序技術(shù)（二代測(cè)序），隨后科研人員將高通量測(cè)序技術(shù)與之前發(fā)展起來(lái)的核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了更加精細(xì)的研究。最早出現(xiàn) 的單細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法結(jié)合二代測(cè)序方出現(xiàn)在2009年，即Tang s method。Mulm 田tKiig噸inodr知 letsiromro(K3Crop-EeqiooMulm 田tKiig噸inodr知 letsiromro(K3

7、Crop-EeqiooroooUqLid M-ardlng10.0001WQ匚ytoS% ：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)展過(guò)程，圖片來(lái)自 Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the last decadeco-Ji rtcgrndcd Fluid ItWrnr5SPLiT-SmjTang通過(guò)對(duì)單個(gè)小鼠卵裂細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，與芯片技術(shù)相比，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù) 可以多發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)情況。之后，許多新穎的技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，可以更快速、低成 本地提供更多信息。Quartz-Seq實(shí)際上是對(duì)Tang的方法進(jìn)行了優(yōu)化，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，進(jìn) 一步減少了擴(kuò)增副產(chǎn)

8、物的產(chǎn)生。CEL-seq技術(shù)于2012年發(fā)表在Cell Reports上，由以色 列理工學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)，CEL-seq是用體外轉(zhuǎn)錄代替PCR達(dá)到擴(kuò)增的目的。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq10與CEL-seq很類似。Smart-Seq是一項(xiàng)具里程碑意義的 技術(shù)，2012年由美國(guó)和瑞典的科學(xué)家共同開(kāi)發(fā)。Smart-Seq和Smart-Seq2是基于SMART技 術(shù)(Switching Mechanism at 5 End of RNA Template)對(duì)目標(biāo)RNA 進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，而且已 經(jīng)有了較為成熟的商品化試劑盒，是目前應(yīng)用較多的手段。隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序應(yīng)用的深入和

9、細(xì)化，常常需要對(duì)復(fù)雜器官開(kāi)展單細(xì)胞測(cè)序，單純 對(duì)幾個(gè)細(xì)胞做測(cè)序不再滿足科研需求，需要一次性對(duì)幾千甚至幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，分 析細(xì)胞間的基因表達(dá)差異，因此需要開(kāi)發(fā)大規(guī)模低成本的單細(xì)胞測(cè)序方法。于是哈佛大學(xué)兩 個(gè)團(tuán)隊(duì)將微流體技術(shù)與單細(xì)胞RNA-Seq結(jié)合，分別開(kāi)發(fā)出Drop-seq和inDROP兩種技術(shù)，并 在2015年發(fā)表在同一期的Cell雜志上。這兩種技術(shù)都利用微流體裝置生成液滴，液滴沿 著一根極細(xì)槽道流動(dòng)時(shí)將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起包裹進(jìn)液滴，在液滴中實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄 擴(kuò)增建庫(kù)，同時(shí)每個(gè)條形碼附著到每個(gè)細(xì)胞的基因上，因此可以一次測(cè)定所有的基因并追蹤 每個(gè)基因的來(lái)源細(xì)胞。這些技術(shù)的出現(xiàn)，讓快速

10、、低成本地分析數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的基因活性成 為現(xiàn)實(shí)。表1：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)總覽MeehlsCaptured R時(shí)ecDNA coiTrageAmplifizatlcn cefhntiDvUMI SrrandspecificEarlyMultiplexingIfeim叩nlymerPTRpolvAk RMAsFid LlenRch with PCR after polvA tailnNd NoNobiaedQmrtz-polyA+FiiL-leiigch with -PCR after pnlyA caiLEngNe N-dNoseqbiased5C-seqpalyARMAsFull Lengt

11、h with 3-PCR polvA ailingNo 阮NobusedpolyA * and poly AFLiLLcngchPC R aftc r Dly-d ta ill ngN-o NoMoKM AS-polyA, andpolyAFLillenHch?CR itterpoly-tJC tailingYes Yes袍RNAsSwiRhinE頑甬PCESTRT stqpolvA+ EH拈5; tae (T55Jlemplacf swtehins-baied PCRYe s YesYesSma rt- setpolyA * RMAsFLil-lcngch with weak3-Jcmpla

12、c-c switching-based PCRMe NNobiased5rt-polyA RMAsMearty Full-lengthTemplate swbzhing-baied PCRNa NoNoDinp-scqpolyARNAs3, rag ： UTR)Icmplacc swtehing-based K.RYes YesFaELh-seqpDlyA + RIWMearly full-tengLhlemplac-e s.wtching-baieil PCRNj 汕51 tafTSS：-Yes YYesin vitro traoscription-based linear amplific

13、ationCEbsecpolyA KNAS3 Mgtunqtn vtm rranicnpnonY&Yes.CEL-seqZpolyA RKAsm vitro- crjmcripiLion and random primer Yes YesYeshgd PCRMARS-seqpolyA+ RKAs3 tag tUTR)irt viciv transcriptionYe s YestsLn DropspolyA1 KNA5y rag (UTK)m rttro iranscrlpELonYes YesYtsNt*由此tl pHmtfWbdwtl Pt RDP-seqpolyA明處SpeciiEicF

14、Ei anPCR u3designcd heptdnier primEsr-Nc 險(xiǎn)Necyro-seqpolyA KMHS3 HE tin-R)gene-speo ric ptmers based pcrYes hoYesMALBApolvA4- RfJAsFiil-lenRchQu asi! id er PCR .sith 7 randorn MAL3ACNd NdNoRNAprimers3.三大單細(xì)胞測(cè)序策略比較越來(lái)越多的單細(xì)胞RNA測(cè)序平臺(tái)被應(yīng)用于科研和臨床。目前最廣泛使用的三種細(xì)胞捕 獲策略是基于微孔(microwell)、微流控(microfuidic)和液滴(droplet)的方

15、法?；谖⒖?microwell)的平臺(tái)，如SMART-seq2、MARS-seq，使用例如移液管或激光捕 獲分離細(xì)胞并將其置于微孔中，使基于表面標(biāo)記選擇細(xì)胞成為可能。這種方法的主要缺點(diǎn)是 它們通常是低通量的，每個(gè)細(xì)胞所需的工作量可能相當(dāng)大?；谖⒘骺?microfuidic)的平臺(tái)，如Fluidigm C1，為捕獲細(xì)胞和進(jìn)行文庫(kù)制備所需的 反應(yīng)提供了一個(gè)更加集成的系統(tǒng)。因此，它們比基于微孔的平臺(tái)提供更高的通量。通常情況 下，在微流控平臺(tái)中只有大約10%細(xì)胞被捕獲到，因此如果處理罕見(jiàn)的細(xì)胞類型或非常少量 的細(xì)胞，它們是不合適的?；谝旱?droplet)的平臺(tái)，如10X Chromium Co

16、ntroller，利用微流控技術(shù)進(jìn)行單個(gè)細(xì) 胞分選，將帶有條形碼和引物的凝膠珠和單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中；在每個(gè)油滴內(nèi)，凝膠珠溶 解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測(cè)序的帶條形碼的cDNA；液體油層破壞后， cDNA后續(xù)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，即可一次性獲得大 量單細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，10min內(nèi)自動(dòng)完成多至80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲，從而實(shí)現(xiàn)在單細(xì) 胞水平進(jìn)行表達(dá)測(cè)序的目的。10X Chromium Single Cell Gene Expression Solution 技術(shù)原理與其他高通量捕獲平臺(tái)相比，10X Chromium Controlle

17、r具有多方面的優(yōu)勢(shì)，如：平臺(tái)一 次實(shí)驗(yàn)可完成多至80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲，通量高、周期快速，成本最低、細(xì)胞捕獲效率高， 單個(gè)樣本細(xì)胞捕獲率高達(dá)65%；商業(yè)化儀器操作簡(jiǎn)便等。Tsihle IRNA qiLetK-in mclhfwkMethodFlitdlpn Cl(SMART-M)iFl uM (gm Cl syNtim (mRNA Stq HT)SMART-se|仙麗Fluidigm Cl -Hutdigm Cl nFACS1QX (jicnqniicx Chrurnium single cell C4jntnMlrTFACSCdlsizeILomuaenDLis si 趺 of 5- l(

18、HM 1017 心1 I Q.MIO 10,000Nu liiriiuuiun 20.000No limilitiQnV 傳回 1 quulitj con iroll checkMicroscope cniinaLionMicroscope exam indl km.NdNoNo-Liufi點(diǎn) Germ storageNo. FT1U3I pioccss immediaEelyNs must prnccKB immediatelyYesNtih must process iirimdiMidyYesTJirMiihputLimited by :number of machinesLimiEed by number ci rnuchinesLimited 町 cipmrtor cfficicrKyUp Ki 8 samples ptr chipFukcss is wuwimccdCwi+ + + + + + + + 3 days-7 we*Sample Prep