基因表達(dá)量實時熒光定量PCR檢測步驟

1、 基因表達(dá)量實時熒光定量PCR檢測步驟材料（試劑和耗材）1.1樣本（小鼠組織）-2個引物（lifetechnology公司合成）BestarTMjPCRRTKit（德國DBI貨號：DBI-2220）BestarSybrGreenqPCRmastermix（德國DBI貨號：DBI-2043）96孔板（美國lifetechnology）材料（儀器）ABI7500熒光定量PCR儀（lifetechnology公司）TGL-16M低溫冷凍離心機(jī)（湘儀）SW-CJ-1D單人凈化工作臺（瀘凈凈化）HR40-IIA2生物安全柜（Haier）實驗步驟3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology

2、公司提供的TriozolRNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行。程序如下：（1）將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1mlTRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s（請勿渦漩激烈振蕩），室溫靜置3min,12,000g,4C離心15min,置于冰上；（3）溶液分為三層,RNA溶解在水相中，小心吸取500卩1水相至另一個新的RNasefree的EP管中；（4）加入500卩1異丙醇，-20度放置1h,12,000g,4C離心10min,離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清； 加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min,去上清；超凈工作臺上吹干樣品l

3、Omin,加入適量DEPC水溶解RNA。加入40山DEPC水溶解沉淀。3.2RNA質(zhì)量檢測紫外分光光度計測定RNA濃度：sampleIDconcentration(ng/“L260/280a9981.87b10241.973.3去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫1O,OOOg離心lmin,收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65C條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5XRTBuffer2yLRTEnzymeMix0.5yLPrimerMix0.5yLRNA6yLRNase-freeWater1gLToal10gL反應(yīng)條件：37C,15m

4、in98C,5min4C,hold反應(yīng)結(jié)束后，-2OC保存。34cDNA的實時熒光定量PCR3.4.1實驗步驟每個樣本分別設(shè)置3個目的基因和3個內(nèi)參基因的平行實驗。PCR反應(yīng)體系為20yL，根據(jù)表1.配置。反應(yīng)條件為：95C2min95C10s、60C34s（采集熒光信號）卜45個循環(huán)72C30s丿循環(huán)結(jié)束后從60C升高到98C獲取熔解曲線。表120“熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑體積（卩L）終濃度滅菌蒸餾水4.46/BestarSybrGreenqPCRmastermix101xForwardPrimer(20yM)0.250.25gMReversePrimer(20gM)0.250.25gM5

5、0XROX0.040.1X模板5/Total20/表2使用的引物基因名稱GenebankID引物序列擴(kuò)增長度（bp）Mus-GAPDHNM_001289726.1Forward：TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse：GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM*Forward：Reverse：yNM*Forward：Reverse：342實驗結(jié)果的分析方法本實驗采用2-.Ct法進(jìn)行分析，計算公式為：_（待測組目的基因待測組管家基因）_（對照組目的基瓦對照組管家基因F=2平均ct值平均ct值平均ct值平均ct值F為相對表達(dá)量，根據(jù)此次試驗的設(shè)計，對照組中的目的基因表達(dá)量為1。4結(jié)果4.1擴(kuò)增曲線IXGAPDH基因擴(kuò)增曲線x基因擴(kuò)增曲線y基因擴(kuò)增曲線i!iPHAffCcJii-iFti4.2熔解曲線GAPDH基因熔解曲線YdMM!9rulaaltAIMi站孔kjry，y基因熔解曲線-24.3實驗數(shù)據(jù)見EXCEL表格。備注：ACt=目的基因Ct-管