醫(yī)學(xué)專(zhuān)題藥敏試驗(yàn)

1、2021/7/20 星期二1抗菌藥物的敏感試驗(yàn) 張德純 教授 病原生物學(xué)教研室2021/7/20 星期二2 醫(yī)院感染近年來(lái)已成為全球性的突出問(wèn)題，其主要原因之一是抗菌藥物的使用不當(dāng)促進(jìn)耐藥菌在病人體內(nèi)和醫(yī)院環(huán)境中定植繁衍，進(jìn)而導(dǎo)致的交叉感染和內(nèi)源性感染日益增多。合理使用抗菌藥物的前提之一是要重視感染病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷和監(jiān)控抗感染治療的實(shí)驗(yàn)室服務(wù)。為臨床抗感染治療的藥物選擇以及療效的監(jiān)測(cè)和考核提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的重要職能之一。2021/7/20 星期二3 藥物敏感試驗(yàn)包括體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)、體內(nèi)抗菌藥物活性的測(cè)定和藥物濃度的測(cè)定。 體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)包括抑菌試驗(yàn)、殺菌試驗(yàn)、聯(lián)合

2、藥敏試驗(yàn)和檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶。常用的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)有紙片擴(kuò)散法、稀釋法和E試驗(yàn)法。 本章僅對(duì)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常用的體外藥敏試驗(yàn)的基本原理和方法進(jìn)行介紹。2021/7/20 星期二4一、臨床常用的抗菌藥物 抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。1. 青霉素類(lèi)抗生素2.頭孢菌素類(lèi)抗生素3.其他-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素4.氨基糖甙類(lèi)抗生素5.喹諾酮類(lèi)抗生素6.大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素7.四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類(lèi)抗生素8.糖肽類(lèi)抗生素9.磺胺類(lèi)藥物及增效劑10. 其他合成抗菌藥2021/7/20 星期二5二、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（一）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（anti

3、microbial susceptibility test ,AST）意義在于：1. 可預(yù)測(cè)抗菌治療的效果，既AST試驗(yàn)結(jié)果為“敏感”時(shí)，治療可能有效；試驗(yàn)結(jié)果為“耐藥”時(shí)，使用該藥物治療肯定失??；2. 指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇使用抗生素，AST的結(jié)果往往在給予病人經(jīng)驗(yàn)性治療2448h之后，若AST結(jié)果為“敏感”，該治療為有效，若結(jié)果為“耐藥”，即應(yīng)更換藥物；2021/7/20 星期二63. 提供所選擇藥物的依據(jù)；4. 監(jiān)測(cè)耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染病的流行病學(xué)，控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。2021/7/20 星期二7（二）藥敏試驗(yàn)方法 1 紙片擴(kuò)散法1）K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法（1）

4、原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上。紙片中所含有的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周?chē)鷧^(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度。并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。2021/7/20 星期二82.抗菌藥物紙片：選擇直徑6.35mm的新華濾紙含藥物紙片，-20保存。3.培養(yǎng)基：用水解酪蛋白（Mueller-Hinton MH）瓊脂。瓊脂厚度4mm。9cm內(nèi)徑的平板需傾注25-30ml瓊脂，7cm內(nèi)徑的平板需傾注15 ml瓊脂。

5、對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌在MH瓊脂基礎(chǔ)上加入血清或血液。2021/7/20 星期二94. 操作步驟： 接種 在已分純的待測(cè)菌平板上挑取45個(gè)菌落 35 46 h35mlMH肉湯中 用肉湯調(diào)整菌液至 15min 內(nèi) 0.5個(gè)麥?zhǔn)瞎埽?.5108/ml） 用無(wú)菌 棉簽均勻涂布平板（涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60 度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周） 室溫5分鐘后 貼紙片（各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm） 35 16-18h 觀察結(jié)果2021/7/20 星期二10 5. 結(jié)果判斷：量取抑菌圈直徑 抗菌藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)分為以下三級(jí)：敏感：表示測(cè)試菌能被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃

6、度所抑制或殺滅。中度敏感(中介)：指測(cè)試菌可被測(cè)定藥物大劑量給藥后在體內(nèi)能達(dá)到的濃度所抑制，或在測(cè)定藥物濃集部位的體液中，如尿中被抑制。 耐藥：表示測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。 2021/7/20 星期二116.影響因素（1）培養(yǎng)基的質(zhì)量，如PH、深度、硬度和表面濕度等；（2）藥敏紙片的質(zhì)量，含藥量和保存方式；（3）接種菌量正確與否是影響結(jié)果的重要因素之一，取決于比濁標(biāo)準(zhǔn)的配制，正確使用和保存；（4）試驗(yàn)操作質(zhì)量：接種細(xì)菌后貼片時(shí)515分鐘； （5）孵育條件，溫度和時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間 1618h,不要超過(guò)24h。 7. 質(zhì)量控制 采用標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球ATCC259

7、23，大腸埃希菌ATCC25922，和銅綠假單胞菌 ATCC278532021/7/20 星期二122）直接紙片藥敏法 由確證感染部位采集到的一些重要臨床標(biāo)本直接涂布接種MH瓊脂或5%羊血MH瓊脂，然后放置藥敏紙片。不僅可提早24h得出初步藥敏結(jié)果供臨床用藥參考，還有助于發(fā)現(xiàn)混合感染中的不同菌種、耐藥菌株以及病原菌的鑒定。但由于此法難以控制接種菌量，且標(biāo)本中可能存在多種細(xì)菌，因此還需要在病原菌分純后再用KB法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。2021/7/20 星期二13 2 稀釋法 1） 肉湯稀釋法 包括試管稀釋法和微量稀釋法。下面重點(diǎn)講述試管稀釋法（常量稀釋法）。 （1）.原理：以水解酪蛋白（MH）液體

8、培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋?zhuān)缓蠓N入待測(cè)細(xì)菌，定量測(cè)定抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度（MBC）。 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）：細(xì)菌生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC。 最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）：某抗菌藥物能殺滅99.9%以上測(cè)試菌時(shí)的最低藥物濃度。2021/7/20 星期二14試管編號(hào)：抗生素： 2ml(512g/ml)MH肉湯抗生素含量菌液(ml)：（1.5107 /ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101ml

9、1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 256 128 64 32 16 8 4 2 1- 不加抗生素0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml1ml(棄去 )對(duì)倍稀釋?zhuān)?2) 方法2021/7/20 星期二15注意 :設(shè)立對(duì)照管(肉湯對(duì)照管,待測(cè)菌生長(zhǎng)對(duì)照管和質(zhì)控菌生長(zhǎng)對(duì)照管.（3）結(jié)果判斷: 不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)該細(xì)菌的MIC.如第六管不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng),則MIC=原藥物濃度(512 g/ml) 稀釋倍數(shù)(1:32)=16 g/ml

10、 將所有無(wú)菌生長(zhǎng)的試管轉(zhuǎn)移到血平板，培養(yǎng)過(guò)夜，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為藥對(duì)該菌的MBC.混勻35 1620h 觀察結(jié)果2021/7/20 星期二16 （4）影響因素：培養(yǎng)基、接種菌量、蛋白質(zhì)結(jié)合率、抗菌藥物的配制、結(jié)果觀察的時(shí)間等因素均能影響本試驗(yàn)的結(jié)果。 （5）質(zhì)量控制：每批或每次實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)試菌種類(lèi)分別選用金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定。2021/7/20 星期二172）瓊脂稀釋法（1）原理： 將藥物混勻于MH瓊脂平板上， 配制含不同濃度藥物平板，使用多頭

11、接種器接種細(xì)菌，經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含的藥物濃度測(cè) 得MIC。 （2）方法： 將0.5麥?zhǔn)瞎芫合♂?0倍以多頭接種器接種于瓊脂表面，稀釋的菌液15min內(nèi)接種完畢，置35孵育1620h。 （3）質(zhì)量控制：原則同肉湯稀釋法，每個(gè)瓊脂平板應(yīng)同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)菌株。2021/7/20 星期二18 3 E試驗(yàn) E試驗(yàn)是一種結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)微生物藥敏試驗(yàn)直接定量的技術(shù)。 （1）原理 E試條是一條5mm50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。 將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明

12、顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗生素抑制細(xì)菌的特定濃度，又稱(chēng)抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關(guān)。 2021/7/20 星期二19（2）方法 菌液、平板接種等同紙片瓊脂擴(kuò)散法,待瓊脂平板完全干燥，用E試驗(yàn)加樣器或鑷子將試條放在已接種細(xì)菌的平板表面，試條全長(zhǎng)應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。 采用NCCLS2002 AST執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦孵育條件。 （3）結(jié)果判讀：讀取橢圓環(huán)與E試驗(yàn)試條的交界點(diǎn)IC值。2021/7/20 星期二20 E試驗(yàn)2021/7/20 星期二21細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)抑菌圈含藥試條最低抑菌濃度2021/7/20 星期二22 4 聯(lián)合

13、藥物敏感試驗(yàn)（1）聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法很多，其中紙片法最為常用。下面就介紹紙片法的試驗(yàn)方法。 與紙片擴(kuò)散法類(lèi)似。先將試驗(yàn)菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，放置5分鐘，待平板表面水分吸收后，將兩種含藥紙片貼于平板上，兩紙片中心距離2-4mm左右。然后35 孵育過(guò)夜，取出觀察結(jié)果。2021/7/20 星期二232）結(jié)果判斷聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)可出現(xiàn)四種結(jié)果：A.無(wú)關(guān)作用： 甲+乙=甲單或乙單B.拮抗作用： 甲+乙甲單或乙單C.相加作用： 甲+乙=甲單+乙單D.協(xié)同作用： 甲+乙甲單+乙單2021/7/20 星期二24A.無(wú)關(guān)作用： 甲+乙=甲單或乙單細(xì)菌對(duì)兩藥均耐藥細(xì)菌對(duì)甲耐藥對(duì)乙敏感細(xì)菌對(duì)兩藥均敏感，抑菌環(huán)交界角尖銳。2021/7/20 星期二25B.拮抗作用： 甲+乙甲單或乙單細(xì)菌對(duì)甲藥耐藥，對(duì)乙藥敏感，甲藥對(duì)乙藥發(fā)生切割狀拮抗現(xiàn)象。細(xì)菌對(duì)甲乙兩藥均敏感，乙藥對(duì)甲藥發(fā)生扇圓形拮抗現(xiàn)象。細(xì)菌對(duì)甲乙兩藥均敏感，甲乙兩藥發(fā)生相互切割狀拮抗現(xiàn)象。2021/7/20 星期二26