生物工程下游技術(shù)第2講的課件

1、第二講 光分析法導(dǎo)論一、光分析法及其特點(diǎn)光分析法：以物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)建立的分析方法。凡是基于檢測(cè)能量與待測(cè)物質(zhì)作用后所產(chǎn)生的光輻射信號(hào)或所引起的變化的分析方法都屬于光分析法。優(yōu)勢(shì)：研究物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)表征、表面分析及幾何模型。三個(gè)基本過(guò)程： （1）能源提供能量；（2）能量與被測(cè)物之間的相互作用；（3）產(chǎn)生信號(hào)。 基本特點(diǎn)：（1）所有光分析法均包含三個(gè)基本過(guò)程；（2）選擇性測(cè)量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學(xué)元器件。二光的性質(zhì)及其與物質(zhì)的相互作用1電磁波的種類：波長(zhǎng)(nm)510-30.10.11010200200400名稱射線x射線遠(yuǎn)紫外光近紫外光波長(zhǎng)(nm)4007

2、507501.01061.01061.01091.01091.01012名稱可見(jiàn)光紅外光微波無(wú)線電波波長(zhǎng)（）：表示相鄰兩個(gè)光波各相應(yīng)點(diǎn)間的直線距離（或相應(yīng)兩個(gè)波峰或波谷間的直線距離）。 波數(shù)（）：指在單位長(zhǎng)度內(nèi)波的數(shù)目。 頻率（）：指在1秒時(shí)間內(nèi)經(jīng)過(guò)某點(diǎn)的波數(shù)（即每秒內(nèi)振動(dòng)的次數(shù)）。 能量(E)：光子所具有的能量。表征電磁波特性的參數(shù)： 不同波長(zhǎng)的光具有不同的能量：波長(zhǎng)越長(zhǎng)（頻率、波數(shù)越低），能量越低；波長(zhǎng)越短，能量越高。電磁波譜中：射線、x射線（粒子性）能譜能譜分析法微波、無(wú)線電波（波動(dòng)性）波譜波譜分析法中間部分光學(xué)光譜光譜分析法復(fù)合光與單色光通常物質(zhì)發(fā)出的光為復(fù)合光可采用一定方法獲得單色光

3、 單色光的單色性用光譜線的寬度（或半寬度）表示，寬度越窄，單色性越好。例:日光中紅色光的波長(zhǎng)范圍是640680nm，而金屬鈉蒸氣所發(fā)射的黃色光波長(zhǎng)范圍是589.0589.6nm，光譜寬度僅為0.6nm，（誰(shuí)的單色性好？）。然而，普通的氦氖激光器發(fā)射的波長(zhǎng)為632.8nm的紅光，其寬度卻只有10-6nm。激光理想的單色光源！光學(xué)分析法中的光柵單色器一.棱鏡單色器基本組成入射狹縫準(zhǔn)直鏡棱鏡單色器聚焦物鏡聚焦面出射狹縫二. 光柵單色器基本組成入射狹縫平面衍射光柵出射狹縫聚焦物鏡聚焦面f準(zhǔn)直鏡二、光與物質(zhì)的相互作用吸收：物質(zhì)選擇性吸收特定頻率的光并使其強(qiáng)度減弱，物質(zhì)內(nèi)部的能量增加。分原子吸收、分子吸收

4、。(2)發(fā)射：受激物質(zhì)以光的形式釋放出多余的能量。分原子發(fā)射、分子發(fā)射及X射線。(3)散射：光通過(guò)不均勻介質(zhì)時(shí)，一部分光沿其他方向傳播，如：丁鐸爾散射和分子散射。(4)折射：當(dāng)光從一種透明介質(zhì)進(jìn)入另一種透明介質(zhì)時(shí)，光束前進(jìn)方向改變。色散現(xiàn)象單色光。物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 M + h M *M + 熱M + 熒光或磷光基態(tài) 激發(fā)態(tài)E1 （E） E2 E = E2 - E1 = h 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同。 基態(tài) 激發(fā)態(tài) E1 （E） E2M + 熱M +熒光或磷光(5) 反射 光射到物體表面的時(shí)候，被物體表面反射改變方向。(6) 干涉 當(dāng)頻率、振動(dòng)、周相相同的光源所發(fā)射的相

5、干光波互相疊加時(shí)，可以產(chǎn)生明暗相間的條紋。(7) 衍射 光繞過(guò)障礙物而彎曲地向后傳播。干涉衍射現(xiàn)象，應(yīng)用：分光，X射線衍射。(8) 偏振 天然光通過(guò)某些物質(zhì)后，變?yōu)橹辉谝粋€(gè)固定方向有振動(dòng)的光稱為平面偏振光。三、光分析分類（一）光譜法 基于物質(zhì)與輻射能作用時(shí)，原子、分子內(nèi)部量子化能級(jí)之間躍遷而產(chǎn)生的光的發(fā)射、吸收或散射的波長(zhǎng)與強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。1、原子光譜（線性光譜）最常見(jiàn)的三種基于原子外層電子躍遷的： 原子吸收光譜（AAS） 原子發(fā)射光譜（AES） 原子熒光光譜（AFS） 基于原子內(nèi)層電子躍遷的X射線熒光光譜（XFS）基于原子核與射線作用的穆斯堡譜原子光譜 線光譜 Line spectraN

6、a 589.0nm、589.6nmE2E0E1E3原子發(fā)射光譜原子吸收光譜波長(zhǎng)hi半寬度10-210-52、分子光譜 帶狀光譜 Band spectra基于分子中電子能級(jí)、振-轉(zhuǎn)能級(jí)躍遷： 紫外光譜法（UV） 紅外光譜法（IR） 分子熒光光譜法（MFS） 分子磷光光譜法（MPS） 核磁共振與順磁共振波譜（N） 分子光譜分子發(fā)射光譜分子吸收光譜hi波長(zhǎng)/nmI波長(zhǎng)/nmA(T)E2E1E0半寬度20100nm半寬度20100nm（二）非光譜法 不涉及能級(jí)躍遷，物質(zhì)與輻射作用時(shí)，僅改變傳播方向等物理性質(zhì)。利用光與物質(zhì)作用時(shí)所產(chǎn)生的折射、干涉、衍射和偏振等變化來(lái)分析測(cè)定。主要有偏振法、干涉法、旋光法

7、、圓二色性法等。 光分析法光譜分析法非光譜分析法折射法圓二色性法X射線衍射法干涉法旋光法原子光譜分析法分子光譜分析法 光譜分析法吸收光譜法發(fā)射光譜法原子吸收紫外可見(jiàn)紅外可見(jiàn)核磁共振原子發(fā)射原子熒光分子熒光分子磷光X射線熒光化學(xué)發(fā)光光譜分析法的分類1、按產(chǎn)生光譜的物質(zhì)類型分： 原子光譜、分子光譜和固體光譜2、按產(chǎn)生光譜的方式分： 發(fā)射光譜、吸收光譜和散射光譜3、按照光譜的性質(zhì)和形狀分： 線光譜、帶光譜和連續(xù)光譜）吸收光譜：物質(zhì)受到光輻射作用時(shí)，物質(zhì)中的分子或原子以及強(qiáng)磁場(chǎng)中的自旋原子核吸收了特定的光子后，由低能態(tài)被激發(fā)躍遷到高能態(tài)，將吸收的光輻射記錄下來(lái)得到的即吸收光譜。 可分為分子吸收光譜、原

8、子吸收光譜及核磁共振波譜 ）發(fā)射光譜：物質(zhì)中的粒子用一定的能量（如光、電、熱等）激發(fā)到高能級(jí)后，當(dāng)躍遷回低能級(jí)時(shí)，便產(chǎn)生出特征的發(fā)射光譜。 可分為原子（離子）發(fā)射光譜、分子發(fā)射光譜和X射線發(fā)射光譜。）散射光譜法：利用物質(zhì)對(duì)光的散射來(lái)進(jìn)行分析的方法。 瑞利散射（物質(zhì)與光發(fā)生彈性碰撞） 拉曼散射（物質(zhì)與光發(fā)生非彈性碰撞） 拉曼散射光譜光譜形狀1、線光譜: 由若干條強(qiáng)度不同的譜線和暗區(qū)相間而成的光譜。（原子光譜）2、帶狀光譜: 由幾個(gè)光帶和暗區(qū)相間而成的光譜。 （分子光譜）3、連續(xù)光譜： 在一定范圍內(nèi)。各種波長(zhǎng)的光都有，連續(xù)不斷，無(wú)明顯的譜線和譜帶。 熾熱的固體物質(zhì)及復(fù)雜分子受激后發(fā)射出的是波長(zhǎng)范圍

9、相當(dāng)廣闊的連續(xù)光譜，稱為固體光譜。自然界的連續(xù)光譜實(shí)驗(yàn)室的連續(xù)光譜實(shí)驗(yàn)室的連續(xù)光譜電磁波譜與現(xiàn)代儀器分析方法波譜區(qū)-射線波長(zhǎng)5140 pm躍遷類型核能級(jí)X-射線遠(yuǎn)紫外光10-310nm10200nm原子內(nèi)層電子近紫外光可見(jiàn)光200400nm400750nm原子外層電子/分子成鍵電子莫斯鮑爾光譜法:-射線原子核 -射線吸收遠(yuǎn)紫外光-真空紫外區(qū)，此部分光譜會(huì)被空氣吸收X-射線吸收光譜法: X-射線/放射源原子內(nèi)層電子（n10) X -射線吸收X-熒光光譜法: X-射線原子內(nèi)層電子 特征X -射線發(fā)射原子光譜：原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、原子熒光光譜分子光譜：紫外-可見(jiàn)吸收光譜、分子熒光/磷光光譜、

10、化學(xué)發(fā)光波譜區(qū)近紅外光中紅外光波長(zhǎng)0.752.5m2.550m躍遷類型分子振動(dòng)遠(yuǎn)紅外光微波射頻501990m0.1100cm1100 m分子轉(zhuǎn)動(dòng)電子、核自旋近紅外光譜區(qū):配位化學(xué)的研究對(duì)象紅外吸收光譜法:紅外光分子吸收遠(yuǎn)紅外光譜區(qū)電子自旋共振波譜法:微波分子未成對(duì)電子吸收核磁共振波譜法:射頻原子核自旋吸收光分析法儀器的基本流程光譜儀器通常包括五個(gè)基本單元：光源單色器樣品檢測(cè)器顯示與數(shù)據(jù)處理光學(xué)分析法中的檢測(cè)器一. 光電轉(zhuǎn)換器（Transducer）二、光電倍增管（photomultiplier tube, PMT） 光的吸收定律1.朗伯比耳定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后

11、于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系： Ab1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系：Ac二者的結(jié)合稱為朗伯比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： AKLc AKLc 式中， A：吸光度；描述溶液對(duì)光的吸收程度 L：液層厚度(光程長(zhǎng)度)，常以cm為單位 c：吸光樣品的濃度，單位molL-1； K：摩爾吸光系數(shù)（k），單位Lmol-1cm-1， k在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度；透光度(透光率)T吸光度A與透光度T的關(guān)系: A lgT 透光度T : 描述入射光透過(guò)溶液的程度: T = It / I0

12、朗伯比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測(cè)定的依據(jù)，應(yīng)用于各種光度法的吸收測(cè)量。偏離朗伯比耳定律的原因標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯比耳定律的偏離。 (1). 由于入射光不是單色光而引起的偏離 目前各種方法所得到的入射光是具有一定波長(zhǎng)范圍的波帶，而非單色光，因而發(fā)生偏離朗伯一比耳定律的現(xiàn)象。單色光的純度愈差，吸光物質(zhì)的濃度愈高，偏離朗伯-比耳定律的程度愈嚴(yán)重。在實(shí)際工作中，若使用精度較高的分光光度計(jì)，可獲得較純的單色光。 (2). 由于介質(zhì)的不均勻性引起的偏離 當(dāng)被測(cè)溶液是膠體溶液、懸濁液或乳濁液時(shí)，入射光通過(guò)溶液后除一部分

13、被吸收外，還有一部分因溶液中存在微粒的散射作用而損失，并使透光度減小。而當(dāng)膠體或其他微粒凝聚沉淀時(shí)，又會(huì)使溶液吸光度下降。(3). 溶液中的化學(xué)變化引起的偏離 溶液中的化學(xué)變化如締合、離解、溶劑化、形成新的化合物、互變異構(gòu)等，使吸光度不隨溶液濃度成正比地改變，而導(dǎo)致偏離朗伯比耳定律。 例如，重鉻酸鉀在弱酸性介質(zhì)中有如下平衡： Cr2O72- +H2O 2HCrO4- 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量不同濃度重鉻酸鉀溶液的吸光度。由于在濃度低時(shí)重鉻酸根的離解度大，而濃度高時(shí)離解度小，同時(shí)由于K(HCrO4-) K(Cr2O72-) ，因此低濃度時(shí)重鉻酸根離子的吸光度降低十分顯著，這就使工作曲線偏離朗伯和耳定律。光分析方法的進(jìn)展1. 采用新光源，提高靈