蛋白質(zhì)和氨基酸的測定學(xué)習(xí)培訓(xùn)模板課件

1、第九章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第一節(jié) 概述第二節(jié) 凱氏定氮法第三節(jié) 蛋白質(zhì)的快速測定法第四節(jié) 氨基酸總量的測定第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品中重要的營養(yǎng)指標；測定蛋白質(zhì)含量對于評價食品營養(yǎng)價值、提高產(chǎn)品質(zhì)量等具有重要意義；主要含有C、H、O、N，含N是區(qū)別于其他有機化合物的主要標志；蛋白質(zhì)系數(shù)：指1份氮相當于蛋白質(zhì)的份數(shù)。一般蛋白質(zhì)含氮量16%，蛋白質(zhì)系數(shù)為6.25。不同食品蛋白質(zhì)系數(shù)有所差異。蛋白質(zhì)的測定方法分兩大類：利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。食品種類多，pro含量不同，碳

2、水化合物，脂肪和維生素等干擾成分很多。凱氏定氮法通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)，是測定蛋白質(zhì)最常用的方法。具有準確、簡便的優(yōu)點。其他方法：雙縮脲法、紫外吸收法、水楊酸比色法、福林-酚比色法、考馬斯亮藍比色法等。氨基酸測定的常用方法：雙指示劑甲醛滴定法、茚三酮比色法、自動分析儀法。 新鮮食品中含氮化合物以蛋白質(zhì)占優(yōu)勢，所以檢驗食品中蛋白質(zhì)時，往往只限于測定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實際上包括核酸、生物堿，含氮類脂、卟啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗蛋白質(zhì)。三聚氰胺事件：俗稱密胺、蛋白精，為含氮雜環(huán)有機化合物，被用作化工原料，主要用于木材加工、裝飾板、

3、涂料、紙張、紡織、皮革等行業(yè)。三聚氰胺色白無味，含N約66%，非法摻進奶粉等食品中，可提升蛋白質(zhì)的檢出量。第二節(jié) 凱氏定氮法三聚氰胺原理凱氏定氮法分常量、半微量、微量、自動，原理相同，都要經(jīng)過消化、蒸餾、滴定三步驟。樣品與濃硫酸和催化劑(K2SO4及CuSO4)一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨；然后加堿蒸餾，蒸出氨，用硼酸溶液吸收；以標準鹽酸或硫酸溶液滴定吸收的氨。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。K2SO4 的作用：消化過程中提高溶液沸點從而加快有機物分解。一般純H2SO4沸點為340，K2SO4與硫酸反應(yīng)生成KH

4、SO4，可以提高溫度至400以上，加快有機物分解。硫酸鉀加入量不能太大，否則易造成溫度過高，生成的銨鹽分解損失。 也可用Na2SO4 等其他鹽類來提高沸點。CuSO4的作用：作為催化劑，加速反應(yīng)進程；消化完全的指示作用：反應(yīng)中不斷生成硫酸亞銅褐色沉淀，消化完全后，不再有沉淀生成，變?yōu)樗{綠色澄清透明；也可以用氧化汞、汞、錫粉、二氧化鈦等代替。其他：消化過程通常也加入少量H2O2，KClO等強氧化劑，以加速有機物氧化分解。反應(yīng)式特點優(yōu)應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、回收率好，不需昂貴儀器；缺操作費時，產(chǎn)生有害氣體。操作步驟準確稱取樣品0.50-2.00g(半固體2-5g，液體10-20mL)于500ml凱氏

5、瓶中加10g無水K2SO4+0.5gCuSO4加20ml 濃H2SO4通風(fēng)櫥中先以小火加熱泡沫消失后加大火力消化至透明無黑粒搖動瓶子(使瓶壁炭粒溶于硫酸中)繼續(xù)消化30分鐘至樣液呈綠色透明；停止消化冷卻加200ml水連接蒸餾裝置用硼酸作吸收液在凱氏瓶中加波璃珠數(shù)粒和80ml50% NaOH立即接好裝置加熱至到凱氏瓶內(nèi)殘液減少到三分之一時(200-250mL)，取出用水沖洗；用0.1mol/L HCl滴定(終點:藍色微紅)同時做空白實驗：除不加樣品外，從消化開始所有操作相同。一、常量凱氏定氮法計算公式滴定樣品消耗的標準鹽酸溶液體積滴定空白消耗的標準鹽酸溶液體積鹽酸標準溶液濃度樣品的質(zhì)量蛋白質(zhì)系數(shù)

6、6.25氮mol質(zhì)量， 14g/mol所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘附在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下未消化完全造成氮損失。 樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，清洗管口再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源(避免造成吸收液倒吸)；吸收液中的混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。說明二、微量凱氏定氮法原理： 與常量法同，3點區(qū)別：原理上蒸餾采用水蒸氣蒸餾法；消化液只取一部分進行蒸餾（常量法為全部）；裝置不同。儀器和

7、試劑、操作方法：P222說明蒸餾前給水蒸汽發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)mL以使其始終保持酸性(避免水中的氨被蒸出)；蒸餾時蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得停火斷汽(否則將發(fā)生倒吸)； 加堿要足量，加后漏斗迅速加蓋，并應(yīng)采用水封措施(避免氨逸出造成損失) 。實驗課用到的微量法裝置1原理 、儀器消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外線加熱裝置組合而成的消化爐。 自動凱氏定氮儀：該裝置內(nèi)具有自動加堿蒸餾裝置、自動吸收和滴定裝置及自動數(shù)字顯示裝置。2試劑 除硫酸銅與硫酸鉀制成片劑外，其它試劑同常量凱氏定氮法。 三、自動凱氏定氮法凱氏定氮法的優(yōu)缺點優(yōu)點缺點可用于所有食品的

8、蛋白質(zhì)分析中測定的是總有機氮，而不只是蛋白質(zhì)氮結(jié)果準確實驗時間長（至少2h以上）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)試劑有腐蝕性1）如何只測出蛋白質(zhì)中的氮：樣品可先在堿性條件下萃取蛋白質(zhì)，然后用三氯醋酸或磺基水楊酸沉淀蛋白質(zhì)。2）除凱氏定氮法和紫外分光法外：其他的所有方法對純化蛋白質(zhì)的測定都需要使用標準或參比蛋白質(zhì)，而對于分析某一具體食品來源的蛋白質(zhì)，選擇適當?shù)臉藴实鞍踪|(zhì)非常重要。第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)原理在堿性條件下，Cu2+和肽類(如雙縮脲、多肽和所有蛋白質(zhì))生成紫紅色復(fù)合物（雙縮脲反應(yīng)），吸收波長為550560nm，比色法測得的吸光度值(OD值)與樣品中的蛋白含量

9、成正比。以標準蛋白質(zhì)制作標準曲線，求出樣品蛋白質(zhì)含量。H2NNH2O+NHNH2OH150-1600CH2NNHNH2OOCuSO4/NaOH有色絡(luò)合物雙縮脲蛋白質(zhì)雙縮脲脲脲第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)應(yīng)用該法已被用于谷物、肉類、大豆及動物飼料的蛋白質(zhì)定性測定。谷物樣品(cereal chemistry, 1961, 38:467-479)雙縮脲溶液：15mL氫氧化鉀溶液（10mol/L）和2.5g酒石酸鉀鈉用900mL蒸餾水溶解，在持續(xù)攪拌下緩慢加入30mL五水硫酸銅溶液（4%），定容至1L。測定：標準曲線繪制：采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標準蛋白質(zhì)樣

10、品，按蛋白質(zhì)含量40、50、60、70、80、90mg分別稱取標準蛋白質(zhì)樣于6支50mL比色管，然后按照以上樣品測定步驟，測定吸光度。第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)谷物樣品測定：樣品測定：稱取5005mg樣品，加入2mL四氯化碳濕潤樣品，加入50mL雙縮脲溶液，塞上瓶蓋（鋁或玻璃材料）在振蕩器上振搖60min，然后4500轉(zhuǎn)/min下離心15min；取上清液于550nm處讀取吸光度。由標準曲線查出蛋白質(zhì)的質(zhì)量（mg），由此可計算出樣品的蛋白質(zhì)的含量。第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)豆類樣品（ Journal of Food Science，

11、1965，30：307-311）雙縮脲溶液：930mL蒸餾水+10mL氫氧化鉀溶液（10mol/L）+20mL酒石酸鉀鈉溶液（25%），在劇烈攪拌下緩慢加入40mL硫酸銅溶液（4%CuSO45H2O）。測定：稱取0.10.2g樣品于125mL錐形瓶中，加入2mL四氯化碳濕潤分散樣品，加入50mL雙縮脲溶液，塞上瓶蓋在振蕩器上振搖15min，靜置60min；然后4000轉(zhuǎn)/min下離心10min；取上清液于550nm處讀取吸光度。第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)肉類樣品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）測定：稱取0.91.

12、2g樣品于含有20mLNaOH溶液（0.5mol/L）的50mL錐形瓶中，用玻棒攪拌分散，與沸水浴中加熱10min，冰浴冷卻；轉(zhuǎn)于到50mL容量瓶中加水定容。用Whatman 3號濾紙過濾，吸取15mL濾液于聚乙烯離心管中，加入1518mL無水乙醚，塞上塞子，充分振搖，于5820轉(zhuǎn)/min離心，吸取1.0mL下層水相液體，加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻，于550nm處讀取吸光度。第三節(jié) 蛋白質(zhì)快速測定方法(一)雙縮脲法(Biuret法)優(yōu)缺點優(yōu)點缺點費用低，速度快（30min內(nèi)）靈敏度偏低，分析時至少需要24mg蛋白質(zhì)幾乎沒有物質(zhì)干擾測定不同蛋白質(zhì)其最終反應(yīng)產(chǎn)物的顏色不同不需要測定非多肽或非蛋

13、白質(zhì)來源的氮若有高濃度的脂或碳水化合物存在時，最終的反應(yīng)溶液可能會呈乳白色不是一個測量絕對值的方法，必須用已知濃度的蛋白質(zhì)或經(jīng)凱氏定氮法校正。含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去(二)福林酚比色法(Lowry法)原理蛋白質(zhì)與福林酚(Folin)試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍色復(fù)合物。作用機理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，同時蛋白中存在的酪氨酸與色氨酸同試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強度（750nm）與蛋白質(zhì)含量呈正比，是檢測水溶性蛋白含量的最靈敏的經(jīng)典方法之一。(二)福林酚比色法(Lowry法)方法1）將待測的蛋白質(zhì)樣品稀釋成合適的濃度(20100g)2）加入酒石酸鉀鈉-碳酸鈉溶液3

14、）冷卻并在室溫下放置10min后，加入硫酸銅-酒石酸鉀鈉-氫氧化鈉溶液4）加入新配制的福林酚溶液，混勻，在50保溫10min5）與750nm處比色讀數(shù)6）建立標準曲線(二)福林酚比色法(Lowry法)優(yōu)缺點優(yōu)點缺點非常靈敏反應(yīng)產(chǎn)生的顏色比雙縮脲更易因蛋白質(zhì)種類的不同而發(fā)生變化測定結(jié)果較少受到樣品渾濁的影響蔗糖、脂類、磷酸鹽緩沖液、單糖等會不同程度干擾反應(yīng)特異性要高于其他大多數(shù)方法高濃度的還原糖、硫酸銨和巰基化合物會干擾(三) 考馬斯亮藍比色法（Bradford布蘭德福特法）原理考馬斯亮藍G250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色（藍色），在595620nm出呈現(xiàn)最大吸收值

15、，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。試劑牛血清蛋白標準液：稱取牛血清蛋白10mg，用蒸餾水配成100g/mL標準溶液。染料試劑：稱取考馬斯亮藍G250 60mg，溶于100mL3%過氯酸溶液中，濾去未溶解的染料，儲存于棕色瓶中備用。測定吸取樣品溶液2mL加染料試劑2mL混勻以介質(zhì)溶液調(diào)零測定A620nm 查標準曲線，求出蛋白質(zhì)含量。說明及適用范圍已成功應(yīng)用于測定麥芽汁、啤酒和馬鈴薯中的蛋白質(zhì)含量。適用于可溶性蛋白質(zhì)含量的測定本法快速、簡單，適合大量樣品測定，靈敏度與福林-酚法相近，但不受酚類、游離氨基酸和小分子肽的影響。優(yōu)缺點優(yōu)點缺點快速，反應(yīng)可在2min內(nèi)完成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物可與石英比色皿結(jié)合，必須

16、用玻璃或塑料比色皿重現(xiàn)性好反應(yīng)產(chǎn)生的顏色因蛋白質(zhì)種類的不同而發(fā)生變化，必須仔細地選擇作為標準的蛋白質(zhì)靈敏度高，比福林酚法高出好幾倍不受多酚和碳水化合物如蔗糖的干擾廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化過程中的含量測定(四) 280nm紫外吸收法原理由于蛋白質(zhì)中存在含有共軛雙鍵的的酪氨酸和色氨酸，因此具有紫外吸收性質(zhì)，在280nm處，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其濃度成正比，可定量測定。特點優(yōu)操作簡便迅速；缺干擾多（非蛋白成分紫外吸收；光散射作用）；在食品分析中應(yīng)用不多。試劑 標準蛋白質(zhì)溶液(兩種，任選其一) ：牛血清蛋白標準液：稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，用水配成1mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。卵清蛋白標準液：稱

17、取經(jīng)凱氏定氮法校正的卵清蛋白，用0.9%NaCl配成1mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。測定吸取1mL樣品溶液加蒸餾水至4mL以蒸餾水調(diào)零測280nm處的吸光值A(chǔ)查標準曲線得樣品蛋白質(zhì)含量。說明本法測定與標準蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，誤差較大。(五) 水楊酸比色法原理樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍色的化合物，在660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質(zhì)含量。試劑氮標準溶液(1.0mg/mL，配制方法P230)：使用時稀釋至2.50g/mL?？瞻姿崛芤?、磷酸鹽緩沖溶液、水楊酸鈉溶液、次氯酸鈉溶液等(配制方法見課本)測

18、定方法標準曲線繪制取6個25mL容量瓶加空白酸溶液2mL加磷酸緩沖液(控制適宜酸度)5mL加水至15mL加水楊酸鈉溶液5mL37水浴15min加次氯酸鈉溶液2.5mL37水浴15min取出于660nm比色繪制標準曲線。樣品消化準確稱樣0.201.00g于凱氏瓶加15mlH2SO4和5g催化劑電爐上加熱到沸騰加大火力消化出現(xiàn)暗綠色搖動瓶子至完全澄清冷卻移至25ml容量瓶定容。測定準確吸取消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容準確吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸緩沖液以下操作與標準曲線繪制的步驟相同。并以試劑空白對照，測得樣液的吸光度，從標準曲線查出其含氮量。計算式中：c從標準曲線上查得的

19、含氮量， g；K為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量，g；F為單換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)說明樣品消化后當天測定重現(xiàn)性好；顯色與溫度有關(guān)，嚴格控制溫度。(一)雙指示劑甲醛滴定法(二)茚三酮比色法第四節(jié) 氨基酸的測定原理氨基酸具有酸性-COOH和堿性-NH2。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結(jié)合，堿性消失。用強堿標準溶液滴定-COOH，測定氨基酸總量。操作方法移取含氨基酸約20-30mg的樣品溶液2份，分別置于250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(中和樣液中其它酸性物質(zhì))

20、；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別記錄兩次所消耗的堿液mL數(shù)。(一)雙指示劑甲醛滴定法計算c為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L;V1為用中性紅指示劑滴定時消耗的氫氧化鈉標準溶液體積，ml;V2為用百里酚酞指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，ml;m為測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g;0.014為氮的摩爾質(zhì)量，g/mol說明及注意事項此法簡便快速，適用于測定食品中的游離氨基酸。發(fā)酵工業(yè)中常用于測定發(fā)酵液氨基氮含量；若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定；脯氨酸測定結(jié)果偏低；酪氨酸偏高；銨存在也使結(jié)果偏高。原理 堿性條件下，氨基酸的氨基與茚三酮中的羰基縮合，生成藍紫色化合物?？捎帽壬ǘ繙y定。試劑磷酸緩沖液(pH.8.04)、氨基酸標準溶液 2%茚三酮溶液稱茚三酮1g溶于35mL熱水加入40mg氯化亞錫(SnCl2H2O)( 氯化亞錫有還原性，防止茚三酮氧化)攪拌過濾于冷暗處過夜定容至50mL(二)茚三酮比色法操作方法繪制標準