第一部分生物化學(xué)技術(shù)概論

1、.：.；第一部分 生物化學(xué)技術(shù)概論本部分內(nèi)容為生物化學(xué)實驗中所涉及的主要技術(shù)原理、實驗記錄和實驗報告的書寫，引見如何正確記錄實驗過程及書寫實驗報告的普通規(guī)那么，是訓(xùn)練學(xué)生進(jìn)展正規(guī)實驗操作的重要內(nèi)容。普通實驗技術(shù)包括玻璃儀器的洗滌、洗液的配制、吸量管的運用、樣品的混勻以及過濾、離心等普通實驗室技術(shù)。實驗樣品的制備著重討論在生物化學(xué)實驗中，血液、尿液、樣品及組織資料的采集和處置，勻漿制備和組織浸出液制備。離心分別技術(shù)、電泳原理、分光分析、層析分析和放射性同位素技術(shù)，重點討論這些重要技術(shù)的原理，內(nèi)容那么盡能夠簡約扼要，作為詳細(xì)實驗內(nèi)容的參考。1 實驗記錄和實驗報告的書寫實驗是在實際指點下的科學(xué)實際，

2、目的在于經(jīng)過實際，掌握科學(xué)察看的根本方法和技藝，培育學(xué)生的科學(xué)思想、分析判別和處理實踐問題的才干，也是培育探求真知、尊重科學(xué)現(xiàn)實和真理的學(xué)風(fēng)，以及培育科學(xué)態(tài)度的重要環(huán)節(jié)。為此，要求學(xué)生在實驗之前必需預(yù)習(xí)、了解根本原理和實驗根本操作步驟、本卷須知，列出所需試劑和儀器，實驗中組織安排好時間，嚴(yán)肅仔細(xì)地進(jìn)展操作，細(xì)致察看變化，照實作好記錄、書寫實驗報告等。一、實驗記錄1. 實驗記錄要整潔、字跡清楚。2. 實驗中察看到的景象、結(jié)果和數(shù)據(jù)，要及時地直接記在記錄本上，原始記錄必需準(zhǔn)確簡練、詳盡、清楚。3. 記錄時，應(yīng)做到照實正確記錄實驗結(jié)果，不可夾雜客觀要素。在實驗條件下察看到的景象，也應(yīng)照實仔細(xì)地記錄下

3、來。在定量實驗中察看到的數(shù)據(jù)，如稱量物的分量、滴定管的讀數(shù)、分光光度計的光密度值等，都應(yīng)設(shè)計一定的表格準(zhǔn)確記錄，并應(yīng)根據(jù)儀器的準(zhǔn)確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。要求對實驗的每個結(jié)果都應(yīng)準(zhǔn)確無脫漏地做好記錄。4. 實驗中運用儀器的類型、試劑的規(guī)格、化學(xué)反響式、分子量、濃度等，都應(yīng)記錄清楚。5. 實驗過程中，應(yīng)一絲不茍，努力培育嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)。6. 完好的實驗記錄應(yīng)包括日期、實驗標(biāo)題、目的、操作、結(jié)果等。二、實驗報告1. 實驗終了后，應(yīng)及時整理和總結(jié)實驗結(jié)果及記錄，寫出實驗報告。2. 實驗報告應(yīng)包括實驗稱號、實驗日期、目的要求、原理、試劑配制、儀器設(shè)備、操作方法、實驗結(jié)果、討論等項內(nèi)容。3. 書寫實驗報告時

4、，目的和要求、原理以及操作方法部分應(yīng)作簡單扼要的表達(dá)，但對實驗條件和操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)必需寫清楚。對于實驗結(jié)果部分，應(yīng)根據(jù)實驗的要求，把所得的實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)展整理、歸納、分析和對比，并盡量總結(jié)成各種圖表，如規(guī)范曲線圖以及實驗組與對照組實驗結(jié)果的比較表。還應(yīng)針對實驗結(jié)果進(jìn)展必要的闡明和分析。討論部分不是對結(jié)果的重述，而是對實驗方法、實驗結(jié)果和異常景象進(jìn)展討論和評論，以及對于實驗設(shè)計的認(rèn)識、領(lǐng)會和建議。4.普通實驗，要有結(jié)論，結(jié)論要簡單扼要，闡明本次實驗所獲得的結(jié)果。2 普通實驗技術(shù)一、玻璃儀器的洗滌與清潔玻璃儀器是生物化學(xué)實驗中不可短少的器具，玻璃儀器的清潔與否，直接影響實驗效果的準(zhǔn)確性。因此，玻

5、璃儀器的清潔任務(wù)是很重要的。一新購玻璃儀器的清洗 新購來的玻璃儀器，其外表附有游離堿質(zhì)，可先用肥皂水洗刷，再用流水沖洗,浸泡于12 HCl中過夜，再用流水沖洗，最后用蒸餾水沖洗23次，在枯燥箱中烤干或晾干備用。二運用過的玻璃儀器清洗1. 普通玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷至無污物，再選用大小適宜的毛刷蘸取洗衣粉或肥皂水，將器皿內(nèi)、外壁細(xì)心刷洗，再用自來水沖洗干凈，洗至容器內(nèi)壁光潔不掛水珠為止，最后用蒸餾水沖洗23次，倒置在清潔處晾干，急用時可用枯燥箱烤干。2. 容量儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，運用后應(yīng)立刻浸泡于清水中，勿使玷污物質(zhì)干涸，并及時用流水沖洗干凈，稍干后再用鉻酸

6、洗液浸泡數(shù)小時，然后用自來水反復(fù)沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗23次，晾干備用。3. 比色杯：用畢立刻用自來水反復(fù)沖洗干凈。如洗不凈時，可用鹽酸或適當(dāng)溶劑沖洗，再用自來水沖洗干凈。切忌用試管刷、粗糙的布或紙擦洗，以免損壞比色杯透光度，亦應(yīng)防止用較強(qiáng)的堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，洗凈后，倒置晾干備用。二、清洗液的原理和配制一肥皂水、洗衣粉溶液和去污粉，是最常用的洗滌劑，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白質(zhì)及其它粘著性物質(zhì)溶解或松弛，普通玻璃儀器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。二鉻酸洗液1. 原理：鉻酸洗液由重鉻酸鉀或重鉻酸鈉和濃硫酸配制而成，其清潔效能主要運用其強(qiáng)氧化性和強(qiáng)酸性。鉻酐越多，硫酸越濃，其清潔效能

7、也就越強(qiáng)，當(dāng)洗液變綠色后那么不宜運用。KK2Cr2O7H2SO4 H2Cr2O7K2SO42CrO3鉻酐紅色H2OCr2O3(綠色)3(O)H2SO4 H2OSO2(O) 2. 配制：稱取重鉻酸鉀5g放于250ml燒杯中，加熱水5ml攪拌，使其盡量溶解，燒杯下墊一石棉網(wǎng)以防過熱，然后漸漸參與工業(yè)用濃硫酸100ml，隨加隨攪拌，盡量防止紅色鉻酐沉淀析出。此時溶液由紅黃色變成黑褐色。冷卻后，儲于指定容器內(nèi)蓋緊以防吸水。3. 運用：運用洗液前必需將玻璃儀器用自來水沖洗數(shù)次，并將儀器上的水分盡量除去，再放入洗液中浸泡，數(shù)小時后取出儀器，用自來水充分沖洗至無洗液為止沖洗時留意勿將洗液濺出水槽，再用少量蒸

8、餾水沖洗數(shù)次，晾干備用。上述兩種洗滌液是最常用的，實驗中遇到一些特殊污物，需用針對性強(qiáng)的洗滌液。三磷酸三鈉洗液 為5 Na3PO412H2O水溶液，此液為堿性，可洗滌油污物，但所洗的儀器不適于作磷的測定。四乙二胺四乙酸二鈉洗液EDTA洗液 為5 %10 的EDTA洗液，加熱煮沸可洗脫玻璃內(nèi)壁的鈣鎂鹽類白色沉淀和不易溶解的重金屬鹽類。五尿素洗液 為45 尿素水溶液，用來洗血污，為蛋白質(zhì)的最好溶劑。六草酸洗滌液 可洗脫高錳酸鉀的痕跡，用時加少量硫酸效果更好。七鹽酸酒精洗液 3 鹽酸酒精液，可除去玻璃器皿上的染料附著物。三、吸量管的種類和運用吸量管是生化實驗中常用的儀器，測定的準(zhǔn)確度與吸量管的正確運

9、用親密相關(guān)。一分類 生化實驗常用的吸量管有三類圖1：1.奧氏吸量管：供準(zhǔn)確量取0.5ml、1ml、2ml液體時運用。每根吸量管上只需一個刻度，放液時必需吹出最后殘留在吸量管尖端的液體。2.移液管：供準(zhǔn)確量取5ml、10ml、20ml等較多體積液體時用。每根吸量管上只需一個刻度，放出液體流畢后，將吸量管尖在容器內(nèi)壁上繼續(xù)停留15秒，留意不要吹出尖端內(nèi)的最后部分。3.刻度吸量管：供量取10ml以下的恣意體積的液體時用。每根吸量管上都有許多等分刻度，普通刻度包括尖端部分，欲將所量取液體全部放出時，須將殘留管尖的液體吹出。刻度吸量管的規(guī)格通常有0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ml等7種。1 2

10、 3 41 2 3 4圖1 三類吸量管簡圖1，2 刻度吸量管 3 奧氏吸量管 4 移液管 二吸量管的運用1.選擇：運用前先根據(jù)需求選擇適當(dāng)?shù)奈抗埽潭任抗艿目側(cè)萘孔詈玫扔诨蛏源笥谧畲笕∫毫?。臨用前要看清總?cè)萘亢涂潭取?.執(zhí)管：用拇指和中指輔以無名指，拿住吸量管上部，用食指堵住管上口和控制液流?？潭葦?shù)字要朝向本人。3.取液：另一只手捏壓橡皮球，將吸量管插入液體內(nèi)不得懸空，以免液體吸入球內(nèi)，用橡皮球?qū)⒁后w吸至最高刻度上端12cm4.調(diào)準(zhǔn)刻度：將吸量管提出液面，吸粘性較大的液體時，先用濾紙擦干管尖外壁；然后用食指控制液體使之緩慢下降，當(dāng)至所需刻度時，立刻按緊吸量管上口此時液體凹面、視野和刻度應(yīng)在

11、同一程度面上。5.放液：放松食指，讓液體自然流入容器內(nèi)，放液時，管尖最好接觸容器內(nèi)壁，但不要插入容器內(nèi)原有的液體中，以免污染吸量管和試劑。6.洗滌：汲取血液、血清等粘稠液體及尿液標(biāo)本的吸量管，運用后要及時用自來水沖洗干凈；吸普通試劑的吸量管可不用馬上沖洗，實驗終了后再沖洗。沖洗干凈后，晾干，再浸泡于鉻酸洗液中，數(shù)小時后取出，再用流水沖凈，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。四、溶液的混勻樣品與試劑的混勻是保證化學(xué)反響充分進(jìn)展的一種有效措施。為使反響體系內(nèi)各物質(zhì)迅速地相互接觸，必需借助于外加的機(jī)械作用。混勻時須防止容器內(nèi)液體濺出或被污染。嚴(yán)禁用手指直接堵塞試管口或錐形瓶口振搖?；靹虻姆绞酱笾掠幸韵聨追N，

12、可隨運用的器皿和液體容量而選用。一旋轉(zhuǎn)混勻法 用手持容器，使溶液作離心旋轉(zhuǎn)，適用于未盛滿液體的試管或小口器皿，如錐形瓶。旋轉(zhuǎn)試管時最好用手腕旋轉(zhuǎn)。二指彈混勻法 左手持試管上端，用右手指悄然彈動試管下部，使管內(nèi)溶液作旋渦運動。三倒轉(zhuǎn)混勻法 適用于有塞量筒和容量瓶、試管內(nèi)容物的混勻。普通試管內(nèi)容物的混勻可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒轉(zhuǎn)混勻。四吸管混勻法 用吸量管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，使溶液充分混勻。五玻棒攪動法 適用于燒杯內(nèi)容物的混勻，如固體試劑的溶解和混勻。六甩動混勻法 右手持試管上部，悄然甩動振搖，即可混勻。七電磁攪拌混勻法 在電磁攪拌機(jī)上放置燒杯，在燒杯內(nèi)放入封鎖于玻璃或塑料管中的小鐵

13、棒，利用磁力使小鐵棒旋轉(zhuǎn)以到達(dá)混勻杯中液體的目的，適用于酸堿自動滴定，pH梯度滴定等。八振蕩器混勻法 利用振蕩器使容器中的內(nèi)容物振蕩，到達(dá)混勻的目的。五、過濾是分別沉淀和濾液的一種方法，可用于搜集濾液，搜集或洗滌沉淀。生化實驗的過濾，操作與化學(xué)實驗中的操作一樣，應(yīng)留意以下幾點：一制備血濾液等實驗過濾時，要用干濾紙而不能用水把濾紙弄濕，由于濕濾紙會影響血液稀釋的體積。二折疊濾紙與漏斗壁完全吻合，不留縫隙。普通采用平折法即對折后再對折。三向漏斗中加溶液時最好運用玻棒引流，倒入速度不要太快，不得使液面超越濾紙上緣。四組織勻漿等較粗樣品的過濾可用脫脂棉或紗布替代濾紙，有時可用離心沉淀法替代過濾法。六、

14、離心機(jī)的運用方法欲使沉淀與溶液分開，過濾和離心都可到達(dá)目的，但當(dāng)沉淀粘稠、顆粒太小且能經(jīng)過濾紙或總?cè)萘刻儆中瓒繙y定時，運用離心沉淀法優(yōu)于過濾法。運用離心機(jī)前，應(yīng)檢查離心機(jī)轉(zhuǎn)動形狀能否平穩(wěn)，以確定離心機(jī)的性能；檢查套管與離心管大小能否相配，套管能否鋪好軟墊用棉藥或橡皮，檢查套管底部應(yīng)無碎玻璃片或漏縫。檢查合格后，將一對離心管放入一對套管中，然后連套管一同分置粗天平兩側(cè)，用滴管向較輕的一側(cè)離心管與套管之間加水，直至天平兩側(cè)彼此相等為止。將各對平衡的套管連同內(nèi)容物放置于離心機(jī)內(nèi)，兩個等重的離心管必需放于對稱位置。放妥后，接通電源開關(guān)，逐漸扭動轉(zhuǎn)速旋鈕，緩慢添加離心機(jī)轉(zhuǎn)速，直到所需的轉(zhuǎn)速。達(dá)規(guī)定時

15、間后，將轉(zhuǎn)速旋鈕逐漸伐回零，待離心機(jī)停穩(wěn)后，取出離心管。3 實驗樣品的制備在生物化學(xué)實驗中，無論是分析組織中各種物質(zhì)的含量，或是探求組織中的物質(zhì)代謝過程，都需求利用預(yù)先處置過的特定生物樣品。掌握實驗樣品的正確處置與制備方法是做好生物化學(xué)實驗的先決條件。在根底生物化學(xué)實驗中，最常用的實驗樣品是人或動物的血、尿和組織等。血樣品常采用全血、血漿、血清或無蛋白血濾液。組織樣品那么常用動物的肝、腎、胰、胃粘膜或肌肉等組織。現(xiàn)將這些樣品的制備方法扼要引見如下：血液樣品搜集動物或人的血液時應(yīng)運用清潔枯燥的試管或器皿，以防止溶血。一全血 取出血液后，迅速置于含有抗凝劑的試管內(nèi)，同時悄然混勻，使血液和抗凝劑充分

16、混合，以免血液凝固。獲得的全血如不能立刻進(jìn)展實驗，應(yīng)儲存于冰箱中。 常用的抗凝劑有草酸鹽、檸檬酸鹽、氟化鈉等，根據(jù)實驗的要求而定，普通情況下運用肝素鈉或肝素。抗凝劑的用量不宜過多，以免影響實驗結(jié)果。通常每毫升血液加草酸鹽12mg，檸檬酸鈉5mg或氟化鈉510mg，肝素僅需求0.010.2mg?？蓪⒖鼓齽┡涑蛇m當(dāng)濃度的水溶液，按需求量加到預(yù)備盛血的試管中，并涂布于試管壁，橫放烘干肝素不宜超越30 二血漿 將上述抗凝全血在離心機(jī)中離心，血細(xì)胞下沉，上清液即為血漿。分別血漿時，必需嚴(yán)厲防止溶血，除采血時一切器具注射器、針頭、試管等都需求清潔枯燥外，取出之血液也不能猛烈振搖。 三血清 搜集的血液假設(shè)不

17、加抗凝劑，在室溫下約510分鐘即自行凝固。血液凝固3060分鐘后，即可采用離心方式分別出血清。假設(shè)血塊粘附于容器壁過于結(jié)實、血清不易分別出來時，可用細(xì)玻璃棒悄然剝離血塊。四無蛋白血濾液 分析血液中某些成分時如血液中的非蛋白氮、葡萄糖、肌酸等為了防止蛋白質(zhì)的干擾，需預(yù)先除去血中的蛋白質(zhì)成分。常用三氯醋酸，鎢酸等沉淀劑與蛋白質(zhì)作用，然后用過濾或離心方法制備無蛋白血濾液。二、尿液樣品 普通定性實驗可以用隨時搜集的新穎尿液。定量測定尿液中各種成分時，應(yīng)把搜集的24小時的尿液混合后再取樣。由于一天之中各次排出尿液的成分，隨食物、飲水及一晝夜體內(nèi)生理變化等的影響而有很大的差別。 搜集尿液的方法普通在早晨一

18、定的時間先排棄剩余尿，再將每次尿均搜集于清潔大玻璃瓶中，到第二天早晨同一時間搜集最后一次尿液即可。把搜集24小時尿液充分混合后用量筒量準(zhǔn)其總體積，然后取樣分析。 搜集的尿液如不能立刻進(jìn)展實驗，應(yīng)置于冷處保管。必要時可在搜集尿液的瓶中預(yù)先放入防腐劑，通常每升尿中約參與甲苯10ml或濃鹽酸10ml。搜集實驗動物的尿液時，可將動物置于代謝籠中，按以上方法經(jīng)過籠下的漏斗搜集動物24小時的尿液。 三、組織樣品在生物化學(xué)實驗中，經(jīng)常利用離體組織研討各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系的作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)展研討。但是生物組織離體過久，其所含物質(zhì)的含量和生物活性都將發(fā)生變化。因此，利用離體組織作為

19、提取資料或代謝研討資料時，應(yīng)在冰冷條件下迅速取出所需組織，并盡快進(jìn)展提取或測定。 普通采用斷頭法或注射空氣于動物心臟處死動物，放出血液，立刻取出實驗所需之臟器或組織，去除外層的脂肪及結(jié)締組織后，用冰冷的生理鹽水洗去血液，必要時也可用冰冷的生理鹽水灌注臟器以洗去血液，再用濾紙吸干。迅速稱重后，根據(jù)實驗的不同要求，用以下不同的方法制成不同的組織樣品。 一組織糜 將組織用剪刀迅速剪碎，或用絞肉機(jī)絞成糜狀即可。 二組織勻漿 向剪碎的新穎組織中參與適量冰冷的勻漿制備液，用高速電動勻漿器或玻璃勻漿器制成勻漿。常用的玻璃勻漿器有5ml和10ml兩種，由一個磨砂玻璃套管和一個帶有磨砂玻璃杵頭的杵組成。玻璃杵的

20、外壁必需緊靠玻璃套管的內(nèi)壁。用時將套管放入冰浴中，玻璃杵與調(diào)速馬達(dá)銜接，將剪碎的組織懸浮于勻漿制備液中并傾入套管中，然后再把玻璃杵插入套管中。開動馬達(dá)并調(diào)理杵的轉(zhuǎn)速，小心地用手扶住套管口部，不斷上下挪動，直至組織碎塊磨成勻漿為止。 常用的勻漿制備液有生理鹽水、緩沖液或0.25mol/L蔗糖溶液等，可根據(jù)實驗的不同要求，加以選擇。 三組織浸出液 將上法制成的組織勻漿進(jìn)展離心，其上清液即為組織浸出液。4 離心分別技術(shù)原理 離心機(jī)是利用離心力把溶液中的粒子進(jìn)展分別的一種儀器。所謂離心力是指物體作圓周運動時構(gòu)成的一種迫使物體脫離圓周運動中心的力。 離心力的單位為g即重力加速度980.6cm/s2，離心

21、力的大小可根據(jù)離心時的旋轉(zhuǎn)速度Vr/min，每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，revolution per minute和物體離旋轉(zhuǎn)軸中心的間隔 r g = r V2 1.118 10-5或按下式計算所需的轉(zhuǎn)速V=V=g89445/r在離心場中物體所受離心力的大小，與物體離旋轉(zhuǎn)軸中心的間隔 有關(guān)，離軸心越遠(yuǎn)，所遭到的離心力越大。計算時通常采用平均間隔 。 根據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，常將離心機(jī)分為普通離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速4 000 r/min、高速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速20 000r/min和超高速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速60 000r/min以上。超速離心機(jī)又可分為分析超速離心機(jī)和制備超速離心機(jī)兩類，前者能準(zhǔn)確控制離心力，并且可用照相方法或者

22、電子技術(shù)記錄沉降粒子在離心過程中的行為，對這些記錄進(jìn)展分析，可以測定粒子的物理性質(zhì)，如沉降系數(shù)、分子量、分散系數(shù)、沉降物質(zhì)的不均一性等。 制備離心技術(shù)包括兩種方法：一種是分級離心法，另一種是密度梯度離心法。 一、分級離心法非均一的粒子懸浮液在離心機(jī)中離心時，各種粒子以各自的沉降速度移向離心管底部，逐漸在底部構(gòu)成一層沉淀物質(zhì)。這層沉淀物質(zhì)含有各種組分，但是最多的是那些沉降得最快的組分圖2。為了分出某一特定組分，需求進(jìn)展一系列離心。通常先選擇一個離心速度和離心時間，進(jìn)展第一次離心，把大部分不需求的大粒子沉降去掉，這時所需求的組分大部分仍留在上清液內(nèi)；然后將搜集到的上清液用更高的轉(zhuǎn)速離心，把需求的粒

23、子堆積下來。離心時間要選擇得當(dāng)，使大部分不需求的小粒子仍留在上清液中。經(jīng)過較高速度離心后，傾去上清液，把沉淀懸浮起來，再用較低轉(zhuǎn)速離心。如此反復(fù)高速、低速離心，直至到達(dá)所需粒子的純度為止。這種基于粒子沉降速度不同而分別的方法，用得非常普遍，對病毒和亞細(xì)胞組分的濃縮特別有用；但是要得到一個純組分較困難，即使沉降最慢的組分較純，它的收得率也是很低的。1 2 3 41 2 3 4圖2 分級離心法 二、密度梯度離心法 密度梯度離心法較分級離心法復(fù)雜，但是具有很好的分辨才干。密度梯度離心可以同時使樣品中幾個或全部組分分別，這是分級離心法所不及的。這個方法是把樣品粒子在一個密度梯度介質(zhì)中離心，這個介質(zhì)由一

24、適宜的可使小分子和樣品粒子在其中懸浮的溶劑組成。離心時，離軸心愈遠(yuǎn)介質(zhì)密度愈大。密度梯度離心法又可分為兩種操作方法：速率區(qū)帶離心技術(shù)和等比重技術(shù)，兩者的原理是不同的。一速率區(qū)帶技術(shù) 用速率區(qū)帶技術(shù)分別樣品依賴于樣品中粒子或高分子的大小和沉降速度的不同。如圖3所示，把一層樣品溶液鋪于一種密度梯度介質(zhì)液柱的頂部，樣品在液柱頂部構(gòu)成一個負(fù)梯度，不過底部存在著一個陡的正梯度，防止樣品的過早沉降。離心力作用下粒子在梯度介質(zhì)中呈分別的區(qū)帶狀沉降，每一條區(qū)帶粒子的特征是具有同一沉降速度。根據(jù)不同的實驗?zāi)康目梢栽O(shè)計不同的梯度。要使速率區(qū)帶離心得到勝利，樣品粒子的密度必需大于梯度液柱中任一點的密度，并且必需在區(qū)

25、帶到達(dá)離心管底部以前停頓離心。以以下舉了速率區(qū)帶法的典型實驗運轉(zhuǎn)參數(shù)表11 2 3 1 2 3 圖3 在程度式轉(zhuǎn)頭中進(jìn)展速率區(qū)帶分別1.充溢密度梯度溶液的離心管 2.樣品加于梯度頂部 3.離心力作用下粒子按照它們的質(zhì)量以不同的速度挪動 表1 速率區(qū)帶法的典型實驗和運轉(zhuǎn)參數(shù)樣 品 沉降系數(shù) 轉(zhuǎn)頭 * 蔗糖梯度 轉(zhuǎn) 速 時 間 溫度 S %W/W r/min 小時 血清 4，7 SW60 520 60 000 5 5血清 4，7，19 SW60 1040 60 000 16 5多核糖體鼠肝 80以上 SW50.1 1050 50 000 1.5 5核糖體亞單位 30，50 SW50.1 1040

26、50 000 3 5血清 4，7 SW50.1 1020 50 000 14 5血清 4，7 SW50.1 35 50 000 6 5酶大部分 2.54.5 SW60 1040 60 000 18 5亞細(xì)胞組分無線粒體 SW27 25/35 27 000 3 5核糖體RNA鼠肝 18.28 SW50.1 520 50 000 5 5核糖體RNA鼠肝 18.28 SW60 1040 60 000 4.5 5DNA大部分 22 SW60 堿性1040 55 000 5 5*Beckman離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭型號，以SW50 .1為例，SW是程度式轉(zhuǎn)頭，50表示最高轉(zhuǎn)速為5 000，最后數(shù)字1是型號。SW4

27、0/41是二種程度轉(zhuǎn)頭，最高轉(zhuǎn)速分別為40 000 r/min和41 000 r/min。二等比重技術(shù) 等比重技術(shù)是按粒子浮力密度分別的方法。選擇介質(zhì)的密度梯度，要使其梯度的密度范圍包括一切待分別粒子的密度。樣品可以鋪在密度梯度液柱上面或均勻分布于密度梯度介質(zhì)中。離心過程中粒子移至與它本身一樣密度的地方構(gòu)成區(qū)帶。因此平衡時，它們的分別完全是由于它們之間密度的差別，和時間無關(guān)圖4。等比重梯度實驗中最常用的介質(zhì)是堿金屬的鹽溶液，如銫鹽或銣鹽。實驗開場時往往是一個密度均一的溶液，在離心過程中自動構(gòu)成梯度。這個過程稱作“自生梯度。構(gòu)成梯度過程中，原先均勻分布的樣品粒子也下沉或上浮至其等比重位置。這種“

28、自生梯度技術(shù)需求長時間離心，例如，DNA在氯化銫梯度中構(gòu)成等比重區(qū)帶需求36到48小時。特別要指出的是，離心時間不會因轉(zhuǎn)速添加而減少，提高轉(zhuǎn)速只能使梯度物質(zhì)重新分布，區(qū)帶位置有所改動。許多密度梯度實驗經(jīng)常把速率區(qū)帶方法和等比重法合并運用。例如選擇一個密度梯度使得樣品中一部分組分沉降到離心管底部，而另一部分組分停留在它的等比重區(qū)。1 2 1 2 圖4 “自生梯度等比重分別1.樣品與梯度物質(zhì)混合物的均勻溶液 2.離心力作用下，梯度物質(zhì)重新分布，樣品區(qū)帶保管在等比重處 5 電泳原理一、電泳的根本原理帶電荷的粒子在一定條件的電場作用下，可向一極挪動，如帶正電荷的粒子移向負(fù)極，帶負(fù)電荷的粒子移向正極，這

29、種景象稱為電泳。許多生物分子都帶有電荷如蛋白質(zhì)、核酸等，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH和組成，由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，因此，在一定時間內(nèi)，由于各組分挪動間隔 的不同，從而到達(dá)分別鑒定各組分的目的。設(shè)一帶電分子在電場所受的力為F，F(xiàn)的大小取決于質(zhì)點所帶電荷Q和電場強(qiáng)度X，即 F = QX根據(jù)Stoke氏定律，一球形的分子運動時所受的阻力F與分子運動的速度V、分子的半徑r、介質(zhì)的粘度的關(guān)系為： F= 6rV當(dāng)F=F即到達(dá)動態(tài)平衡時：QX = 6rV 移項得：Q 6rQ 6rVX=VVX表示帶電分子在單

30、位電場強(qiáng)度下的運動速度，稱為遷移率，也稱為電泳速度，以V表示 ，即：VVXV =Q 6r= 2由式2可見，一個帶電分子的遷移率不僅取決于其本身所帶的電荷，而且還與電場強(qiáng)度，介質(zhì)的pH、離子強(qiáng)度、粘度、電滲等要素有關(guān)。二、影響電泳的主要要素一電泳介質(zhì)的pH 當(dāng)介質(zhì)的pH等于某種兩性物質(zhì)的等電點時，該物質(zhì)處于等電形狀，即不向正極或負(fù)極挪動；當(dāng)介質(zhì)pH小于其等電點時，那么呈正離子形狀，移向負(fù)極；反之，介質(zhì)pH大于其等電點時，那么負(fù)離子形狀，移向正極。因此，任何一種兩性物質(zhì)的混合物電泳均受介質(zhì)pH的影響，即決議兩性物質(zhì)的帶電形狀及其量，為了堅持介質(zhì)pH穩(wěn)定性，常用一定pH的緩沖液，如分別血清蛋白質(zhì)常用

31、pH8.6的巴比妥或三羥甲基氨基甲烷Tris緩沖液。二緩沖液的離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度對電泳的影響是：離子強(qiáng)度低，電泳速度快，分別區(qū)帶不易明晰；離子強(qiáng)度高，電泳速度慢，但區(qū)帶分別明晰。如離子強(qiáng)度過低，緩沖液的緩沖量小，不易維持pH恒定；離子強(qiáng)度過高，那么降低蛋白質(zhì)的帶電量緊縮雙電層使電泳速度減慢；所以常用離子強(qiáng)度為0.020.2之間。 溶液離子強(qiáng)度的計算： I=CiZi2 I=離子強(qiáng)度 Ci=摩爾濃度指離子而言 Zi2=離子的價數(shù)如：0.154mol/L氯化鈉溶液離子強(qiáng)度為：I=0.154120.15412=0.1540.1mol/L硫酸鋅溶液的離子強(qiáng)度為： I=0.1220.122=0.4三電場強(qiáng)

32、度 電場強(qiáng)度和電泳速度成正比關(guān)系。電場強(qiáng)度以每厘米電勢差計算，也稱電勢梯度。如紙電泳的濾紙長15，兩端電壓電勢差150V，那么電場強(qiáng)度為150/15=10V/，電場強(qiáng)度愈高，那么帶電粒子移愈快。電壓添加，相應(yīng)電流也增大，電流過大時易產(chǎn)生熱效應(yīng)可使蛋白量變性而不能分別。四電滲作用 在電場中，液體對固體的相對挪動，稱為電滲圖5。如濾紙含有外表帶負(fù)電荷的羧基，溶液那么向負(fù)極挪動。由于電滲景象與電泳同時存在，所以電泳的粒子挪動間隔 也受電滲影響，如紙上電泳蛋白質(zhì)挪動的方向與電滲景象相反，那么實踐上蛋白質(zhì)泳動的間隔 ，等于電泳挪動間隔 減去電滲間隔 。如電泳方向和電滲方向一致，其蛋白質(zhì)挪動間隔 ，等于二

33、者相加。電滲景象所呵斥的挪動間隔 可用不帶電的有色染料或有色葡聚糖點在支持物的中間，察看電滲方向和間隔 。+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 支持物電滲流+ 固相液相圖5 電滲表示圖三、區(qū)帶電泳的分類：一按支持物物理性狀不同，可分為：1濾紙及其他纖維素膜如醋酸纖維膜、玻璃纖維膜、聚酰胺纖維膜電泳。2粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。3凝膠電泳，如瓊脂糖瓊脂、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳。4絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。二按支持物的安裝方式不同，可分為：1平板式電泳，支持物程度放置，是

34、最常用的電泳方式。2垂直板式電泳。3延續(xù)-流動電泳，首先運用紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，緩沖液和樣品自頂端下流，與電泳方向垂直。可分別較大量的蛋白質(zhì)。以后有用淀粉、纖維素粉或玻璃粉末替代濾紙，分別效果更好。三按pH的延續(xù)性不同，可分為：1延續(xù)pH電泳：電泳的全部過程中緩沖液pH堅持不變。如紙電泳、乙酸纖維膜電泳。2非延續(xù)pH電泳：緩沖液和支持物間有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳、等電聚焦電泳、等速電泳等，能使分別物質(zhì)的區(qū)帶更加明晰，并可對極微量物質(zhì)進(jìn)展分別。四、電泳技術(shù)的運用電泳技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)研討的重要手段。它可分別各種有機(jī)物氨基酸多肽、蛋白質(zhì)、酶、脂類、核苷、核苷酸、核酸等

35、和無機(jī)鹽。并可用于分析某種物質(zhì)的純度及分子量的測定。電泳技術(shù)和層析法結(jié)合和指紋圖可用于蛋白質(zhì)構(gòu)造的分析；與免疫原理結(jié)合的免疫電泳，提高了對蛋白質(zhì)的鑒別才干；與酶學(xué)方法結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了同工酶。電泳技術(shù)是目前分別物質(zhì)的一種很好方法，也是醫(yī)學(xué)科學(xué)中的重要研討技術(shù)。 6 分光分析原理一、根本原理有色溶液對光線有選擇性的吸收作用，不同物質(zhì)由于其分子構(gòu)造不同，對不同波長光線的吸收才干也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。有些無色溶液，雖對可見光無吸收作用，但所含物質(zhì)可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質(zhì)圖6。分光分析法常用于測定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其實際根

36、據(jù)是Lambert- Beer定律。一Lambert定律 當(dāng)一束單色光經(jīng)過一均勻溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱，假設(shè)溶液的濃度(C)不變那么液層的厚度(L)愈大，光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著。假設(shè)C不變： OD L 二 Beer定律 當(dāng)一束單色光經(jīng)過一均勻溶液時，假設(shè)液層的厚度不變，那么溶液濃度愈高，光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著。假設(shè)L不變： OD C三Lambert-Beer 定律及其運用1Lambert-Beer 定律：I0I0IT= =10KCL兩邊取對數(shù)得：lgT=KCL II0ICL圖6 一束單色光經(jīng)過溶液時的情況表示圖式中T為透光度，I0為入射光強(qiáng)度，I為透過光的強(qiáng)度，C為溶液

37、的濃度，lgIlgII0假設(shè)將 用光密度OD表示該溶液對光線吸收的情況有的也用吸光度A表示，那么它們之間的關(guān)系如下： ODOD或A=lgT=KCLlgII02待測溶液濃度的計算： 根據(jù)Lambert-Beer定律 規(guī)范溶液：ODs=KsCsLs待測溶液：ODu=KuCuLu當(dāng)兩種溶液的液層厚度相等Lu = Ls、溫度一樣、且波長也一樣一樣物質(zhì)的兩種不同濃度時，那么Ku=Ks。ODsODuODsODuCsCu=Cu= Cu= CsODuODs即：二、721型分光光度計 這是一種采用光電管為受光器的較高級的可見光分光光度計。其波長范圍為360-800nm，在410-710nm之間的靈敏度較好圖7。

38、運用方法如下： 1. 靈敏度選擇鈕放在“1檔如調(diào)不到“OD=0 時選用較高的檔次。2. 轉(zhuǎn)動波長選擇鈕，選用所需的波長。3. 接通電源指示燈亮。4. 揭開比色杯暗箱蓋，轉(zhuǎn)動“0電位器使電表指針對準(zhǔn)T=0處。5. 將比色杯放入比色杯架，使空白管對向光路，蓋好比色杯暗箱蓋。轉(zhuǎn)動“100電位器，調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向OD=0T=100處。6. 拉動比色杯座的拉桿，使測定杯進(jìn)入光路，迅速從電表上讀出光密度值，并記錄。測讀過程中，隨機(jī)拉回拉桿到原位，使空白杯進(jìn)入光路，隨時調(diào)整OD=0。7. 比色終了后，關(guān)上電源開關(guān)，取出比色杯，將比色杯暗箱蓋好，清洗比色杯并晾干。圖7圖77 層析分別原理層析法又稱色譜法，

39、色層法或?qū)与x法chromatography，是廣泛運用的一種生物化學(xué)技術(shù)。層析法有多種類型，液體作為流動相的稱為液相層析，氣體作為流動相的稱為氣相層析。按層析過程的機(jī)理不同，層析法可以分為以下幾種類型：一吸附層析 利用吸附劑外表對不同物質(zhì)吸附性能的差別進(jìn)展分別。二分配層析 利用不同物質(zhì)在流動相和固定相之間的分配系數(shù)或溶解度不同，使物質(zhì)分別。三離子交換層析 利用不同物質(zhì)對離子交換劑的親和力不同而分別。四凝膠層析 利用某些凝膠對不同分子量的物質(zhì)的阻滯作用不同進(jìn)展分別，亦稱分子篩層析。五親和層析 利用某些蛋白質(zhì)能與配體分子特異而非共價地結(jié)合進(jìn)展分別。層析法采用的方式主要是柱層析和薄層層析，前者將固定

40、相或載體裝入柱內(nèi)，使被分別物質(zhì)沿一個方向挪動而到達(dá)分別。后者將吸附劑涂布成薄層，使樣品在薄層上進(jìn)展分別。一、吸附層析absorption chromatography氧化鋁，硅膠等物質(zhì)具有吸附其它一些物質(zhì)的性質(zhì)，而且對各種被吸附物質(zhì)的吸附才干不同。吸附力的強(qiáng)弱，除與吸附劑本身的性質(zhì)有關(guān)外，也與被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。一柱層析法 柱層析是用一根玻璃管，管內(nèi)加吸附劑粉末，用溶劑潮濕后，即成為吸附柱；然后在柱頂部參與要分別的樣品溶液，假設(shè)樣品內(nèi)含兩種成分A與B，那么兩者被吸附在柱上端，構(gòu)成色圈。樣品溶液全部流入吸附柱之后，參與適宜的溶劑洗脫，A與B也就隨著溶劑向下流動而挪動，最后到達(dá)分別圖8。在洗脫過

41、程中，管內(nèi)延續(xù)發(fā)生溶解，吸附，再溶解，再吸附的景象。假設(shè)被吸的A粒子被溶解隨溶劑下移，但遇新的吸附劑，又將A吸附，隨后，新溶劑又使A溶解下移。由于溶劑與吸附劑對A與B的溶解力與吸附力不完全一樣，A與B挪動的間隔 也不同。延續(xù)參與溶劑，延續(xù)分段搜集洗脫液，各個成分即可順序洗出。最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁。硅膠的吸附才干和含水量關(guān)系極大，硅膠吸水后，吸附才干下降。甘油酯、磷脂、膽固醇等非極性的與極性不強(qiáng)的有機(jī)物，用這種方法分別效果較好。圖8 二元混合物之柱層析圖8 二元混合物之柱層析1加溶劑潮濕成吸附柱 2頂部加樣品溶液3樣品兩種成分被吸附留在柱的上端 4加純?nèi)軇┫疵?樣品中兩種成分得到分別 二

42、薄層層析法 薄層層析法是將吸附劑在玻璃板上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用適宜的溶劑展開，而到達(dá)分別鑒定的目的。其優(yōu)點是：設(shè)備簡單，操作容易，層析展開時間短，分別效率高，并可采用腐蝕性顯色劑，而且可以在高溫下顯色。二、分配層析partition chromatography溶質(zhì)在兩種不相混溶的溶劑中溶解分配，是逐漸到達(dá)平衡的。平衡后，溶質(zhì)X在兩種溶劑中的濃度取決與分配系數(shù)a：X在溶劑1中的濃度X在溶劑1中的濃度X在溶劑2中的濃度=a分配層析即是利用物質(zhì)在兩種溶劑中的分配平衡。溶劑之一通常是水，它是堅持在固定的支持相之中用淀粉，纖維素粉，濾紙等惰性資料制成，另一溶劑是挪動相，由以

43、水飽和過的有機(jī)溶劑組成。被分別的物質(zhì)，假設(shè)彼此之間分配系數(shù)相差較大，就容易被別分開來。三、離子交換層析(ion-exchange chromatography)離子交換層析，是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分別的各種離子間親和力的不同，經(jīng)過交換平衡到達(dá)分別的一種柱層析法。目前大多采用合成的離子交換劑，例如：以苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)聚合的樹脂為母體的離子交換劑如下式。CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2 CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2 合成樹脂是一類高分子化合物，在苯核上可接上酸性或堿性基團(tuán)，而具有電離的才干，離子交換樹脂因此分為兩大類：分子中具有酸性

44、基團(tuán)，能交換陽離子的稱為陽離子交換樹脂；分子中具有堿性基團(tuán)，能交換陰離子的稱為陰離子交換樹脂。離子交換樹脂的外形通常做成微球形或無定形的粒狀；按其解離度的大小，可分為強(qiáng)，弱二類。即： 磺酸基SO3HOH 強(qiáng)酸型 OH陽離子交換樹脂 酚羥基 弱酸型 羧基COOH強(qiáng)堿型 季胺基NR3 陰離子交換樹脂 伯胺基NH2 弱堿型 仲胺基NHR叔胺基NR2 R SO3R SO3HR COOHR SO3R SO3HR NHR NH3OHR NR3OH 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 弱堿性陰離子交換樹脂 交換反響如下：RSO3HMX RSO3MHX RNROHHX RNRXHOH雖然交換反響都是平衡反響，但在層析柱上進(jìn)展時，由于延續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正反響方向進(jìn)展直至完全。結(jié)合到樹脂上的離子，可經(jīng)過改動緩沖液的PH或添加離子強(qiáng)度被洗脫下來。四、 凝膠層析gel chromatography凝膠層析即分子篩層析，是選用孔徑大小一定的凝膠，將混合液中的小分子和大分子物質(zhì)“篩開來的一種