基礎(chǔ)學(xué)院中藥抗病毒作用靶點的克隆、純化及應(yīng)用體系建設(shè)

1、：抗：20151201612填報日期：2015：抗：20151201612填報日期：2015215為建規(guī)范的協(xié)同創(chuàng)新項目信息管理制信息的管理特設(shè)山東省高抗協(xié)同創(chuàng)新中心項目可行（書格式和填寫要一、請嚴格按照表中要求填寫各項目為建規(guī)范的協(xié)同創(chuàng)新項目信息管理制信息的管理特設(shè)山東省高抗協(xié)同創(chuàng)新中心項目可行（書格式和填寫要一、請嚴格按照表中要求填寫各項目可可以由以由聯(lián)組織牽為項目組織實施的責(zé)目只能有一家責(zé)和一個組長目可由項目抗協(xié)創(chuàng)新中心管匯總目可中第一次出現(xiàn)外文名要寫清全稱和縮寫再出現(xiàn)同一詞時可以使用縮五、組織機構(gòu)代碼是指項目組織機構(gòu)代碼證上的標識代碼它是組織機構(gòu)代碼管理中心所賦予的唯一法人標識代填材料

2、，尊重他人知國家有關(guān)知項目可行中他人研究成須以腳注或其他方式注明出目的應(yīng)是評論與自己的研究的成果或說明與自己的研究相關(guān)的技術(shù)問題對改科襲他人著作或者剽竊他襲他人著作或者剽竊他人科研成果等科研不端一經(jīng)查入信。七、此表為項目可行的基本信息，請務(wù)必填寫正一、項目基本中藥2016 12 中藥靶點篩試劑山東大濟清大學(xué)科技園大學(xué)路4655一、項目基本中藥2016 12 中藥靶點篩試劑山東大濟清大學(xué)科技園大學(xué)路4655濟南男123（萬元二、項目簡二、項目簡500（SV（HBV、單純皰疹 （HSV、手足口 （EV71CPE法活性篩2、運用分子生物學(xué)和 工程 E.Coli為目的工 ，或桿狀 反向遺傳學(xué)等的方法，

3、轉(zhuǎn)接目的 ，克隆其有效作用靶點，并將其分離純化，測3、采用液相 技術(shù)（ 型微球流式熒光技術(shù)建立激光激發(fā)光藥物篩選方法，最終建立快速高通量抗 靶點篩選和中藥抗機制研究體系；并利用該體系發(fā)現(xiàn)作用于靶點的中藥抗 有效部位、組分或成分，闡明所篩選的中藥抗 作用機理。4 建立完善的中 抗 多組分、二、項目立二、項目立項的必要性分是危害人類健康的重要 ，人類健康迫切要求發(fā)現(xiàn)新的安全有效的抗 藥物，抗 藥物的研發(fā)屬于國家重點鼓勵支持的研究領(lǐng)域。近年來， SARS、 、甲型 流感等全球性傳染病的爆發(fā)和 ，給人類生命和健康帶來嚴重的 。由 引起的疾病多具有傳染性強、 高、流行面廣及 率高等特點，是人類至今尚不能

4、有效控制的世界難題。因此，針對新康安全具有 的意義。傳染病防治是提高 健康水平和保持社會和諧穩(wěn)定的 需求 “健康是促進人的全面發(fā)展的必然要求在中外 見規(guī)劃綱要（2006-202016個科技 專項，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要涉及到傳染病防治和新藥創(chuàng)制。國家十二五規(guī)劃“ 和 性肝炎等 傳染病防治2015年， 傳染病的應(yīng)急和綜合防控能力顯著 ，有效降低 、 性肝炎、結(jié)核病的新發(fā) 率和病死率。這對國家整個傳染病SARSH5N1和 流感爆發(fā)期間起到出色防治成果的中 抗 領(lǐng)域，也是人類健康迫切要求發(fā)現(xiàn)新的安全有效的抗 藥物性疾病對人類的健康危害就上升為傳染性疾類疾病有 60%由（SARS（H5N1（HBV毒（HI毒（H

5、IV、手足口病 （CA16和EV71、人巨細胞 （CMV）等。人類迫切需要 安全有效的藥物來預(yù)防和治療 引起的疾病。此外，養(yǎng)殖業(yè)因為 危害，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟損失，并且 給人的案例也時有發(fā)生。2.1.3中藥及天然藥物是抗 和期總結(jié)前人經(jīng)驗結(jié)合當時的具體情況寫成世界第一部傳染病專證 方法也奠定了中醫(yī)臨床實踐的基礎(chǔ)。 吳有性著溫疫論，提出戾氣 “由口鼻而入是對 性流感的初步認識，在治療中采用 苦寒、辟穢解毒的治療原則，對溫病學(xué)派的形成做出了巨大貢獻。清代以 、 、吳瑭、 等醫(yī)家為代表的溫病學(xué)派，對外感溫?zé)岵〉牟∫?、病機、證治規(guī)律進行系統(tǒng)闡發(fā)，進一步豐富和發(fā)展了傳染病防治理論。近年來，尤其是 2003

6、年 SARS爆發(fā)以來，我國先后經(jīng)歷了 感、 的流行，在與 流行性疾病抗 的效果獲得了廣泛承認。關(guān)靶點的研究進作用于 穿入或脫殼的抗 作用于 穿入或脫殼的抗 的附著蛋白和細胞受體的結(jié)合部位之后，就可設(shè)計或生產(chǎn)某些制劑來與 競Epstein-Barr(EB) 、人免疫缺損 (HIV)、脊髓灰質(zhì)炎 、鼻 (RV)及巨細胞 (CMV)的宿主細胞表面受體成分。這些受體成分及其配體(對應(yīng)的 附著蛋白)就成為要研制的抗 物質(zhì)或藥物的重作用于 組 組制劑多作用于這-環(huán)節(jié)，也是當前設(shè)計抗 制劑最活躍的領(lǐng)域。這些制劑有如抑制 DNA多聚酶HSV 的DNAp組的-個3.5kb區(qū)域內(nèi)，可編碼1236個氨基、CMV、E

7、BV 及噬菌體T4 的 DNAp，以及人a多聚酶和酵母a 多聚酶具有同源性，表明這-保守區(qū)域具有重DNAp 墓因的克隆成功，片段重組于質(zhì)粒載體中已獲得HSV和噬菌體T4 的DNAp克隆?？寺〉腍SV DNAp昔、碘昔、無環(huán)鳥昔等等，從下列幾方面直接或間接地影響著DNAp (l)DNAp的替代底物；(2)DNA中，形成 、缺損的 DNA；(3)能DNA 鏈的延伸。抑制 RNA 作用于RNA 聚合酶的抗RNA 聚合酶的作用，抑制mRNA抑制 特異性胸苷激酶HSV 在時，其TKHSV 在時，其TK將3端的磷酸基團加至脫氧嘧啶(胸腺嘧啶或胞嘧啶)上形成單磷酸鹽形式，供DNA則需要TK 以提供底物。因此

8、TK 與誘生的 TK 激酶的磷酸特異性DNA 多聚酶的抑制致使DNA 的HSV 的 TK已弄清。TK 處于活性時為雙體分子，可與脫氧嘧啶核昔酸和 ATP 結(jié)合。特異性TK 如何識別無環(huán)鳥苷等制劑并將它們磷酸化，其確切機制仍不清楚。雖然已發(fā)現(xiàn)TK 抑制劑，但單獨使用時并無抗抑核苷酸還原酶RR催化核糖核苷二磷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷二磷酸，是 DNA-步。需要鐵離子作為協(xié)同因子。RR 由-個大亞 及-個 所組成。在 HSV、EBV和水痘-帶狀瘡疹 (VZV)的 組中，編碼 RR兩個亞 的基因是相鄰的。由于 RR 的兩個亞 必須形成雙體才具有活性，這就為抗治療提供了-個重要的作用靶點。按照 與大亞 間反

9、應(yīng)區(qū)的氨基酸順序，人工 了相同的 9個氨基酸肽段。這-肽段可競爭性地與大亞 結(jié)合，從而 正常雙體復(fù)合物的形成。盡管這-肽段太大尚不能應(yīng)用于實際，但研制可穿過細胞膜的類似小肽段可能會成為有效的抗 制劑。逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄 所特有,是依賴于RNA 的DNA 多聚酶。它以RNA為模板催化dNTP DNA逆轉(zhuǎn)錄酶由pol 編碼pol 還編碼蛋白酶和整合酶。HIV-1pol 編碼分子量為51000和64000 兩種逆轉(zhuǎn)錄酶，后者包含-個 15000的蛋白質(zhì)具有RNA酶H的活性它參與RNA降解tRNA前體清除等反應(yīng)，以利雙鏈DNA的 。若RNA酶H發(fā)生突變可致前 合成缺陷。因此，RNA酶H有可能成為另-種抗

10、HIV-1 制劑的作用靶點。 的逆轉(zhuǎn)錄酶 已被克隆并在大腸桿菌中表達。逆轉(zhuǎn)錄酶已被高度純化，其結(jié)3-3-ZT 三磷酸所抑185IV藥ZT IV IV 逆轉(zhuǎn)錄酶活B區(qū)和F區(qū)的-個氨基酸發(fā)生ZT BFZTB區(qū)-留酶活性，說明B區(qū)參與焦磷酸鹽的交換。這些結(jié)合部位都位于酶的氨基端。I-lEPT 和TIOI-1 。TIBO及其衍生物的作用機理可能是干擾逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)過程，確切機制尚待闡明。TlBO HIV-2 逆轉(zhuǎn)錄酶幾乎無影響TIBO HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶上的HIV-2 逆轉(zhuǎn)錄醉者不同的決定簇。HIV-l編碼的蛋白酶在 中非常重要，因而也成為抗 制劑的作用HIV-1蛋白酶 己被克隆并在大腸桿菌中表達，所以

11、此蛋白酶是 1199個氨基酸鏈連接成二聚體，就成為有活性的酶，預(yù)防或 二聚體形成可阻斷酶活性。 較高的濃度。人工 多肽也可有效地抑制逆轉(zhuǎn)錄 蛋白酶。糖蛋白加工發(fā)生于 周期之末，受細胞酶所控制。HIV-1gp120在復(fù)3 個糖苷殘墓，如果抑制這-過程，就不能形成成gp120可能有功能缺陷-葡萄糖苷酶1的抑制物，如精氨粟堿(Casterospermine，CAS)和N-T 基脫氧野尻霉素(N-butylDNJ)能在體外干擾 HIV-1 的模型中，已證實CAS 的抗對N-butyl DNJ 的動物毒理學(xué)已進行了研究，并已開展I 期臨床試驗。（5）（5）對于慢性HIV作用靶點。在HIV- 階段中，有3

12、 個重要的措施用于治療：抑制HIV-1蛋白酶，利用sCD4-KDEL 突變蛋白；殺死白酶是的 gpl20 結(jié)合，使之停滯在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，放。sCD4-毒素或CD4 單克隆抗體-毒素可定位和殺死2.2.2 關(guān)于中藥作用機制研究進特異性和非特異性免疫功能而達到抑的目的（1）用 3 種方式分別檢測大黃提取物，大誘導(dǎo)的CPE 程度明顯減輕，且對輪醋甜素等5種藥物對于2例SARS 患者的作用結(jié)果顯示甜素對SARS-CoV都是非常有效的。雞血藤水提物水相成分經(jīng)過101 大孔吸附樹脂75%乙醇洗脫組分在濃度為16g/ml 時可以完全抑制CVB3 的致細胞病變效應(yīng),特別是其粗提物治療指數(shù)達到19.60，顯示其

13、較低的細胞毒性和較高的抗CVB3效果。雞胚表現(xiàn)有抑制作用，藥物質(zhì)量濃度在表現(xiàn)有抑制作用，藥物質(zhì)量濃度在31.25 mg/ ml 時即可抑制濃度在250 mg /ml 時能完全抑制有4 倍的抑制細胞的早期階段可以降低胸腺嘧啶核苷激酶和 DNA 多聚酶的mRMA，發(fā)揮抗作用。余HSV-1 和HSV-2 均有一定的抑制作用其中最強醋酸乙酯提取物活性最強對HSV-1 和HSV-2 的半數(shù)抑制濃度IC50 分別是 階段抑制 hexon 蛋白的表達有關(guān)。穿心蓮內(nèi)酯磺化物體外對甲型流感、H3N2以及乙型流感 B表面的血凝素的活性而實現(xiàn)的。 等發(fā)現(xiàn) 鶴草的總黃酮提取物有非常強的體內(nèi)外抑制 的作用，尤其在體內(nèi)試

14、驗中發(fā)現(xiàn)該提取物強烈抑制血清中 DNA的 ，且與對照藥 相比，停藥后的反跳率低，其中的成分 草素、蹂花酸、金絲桃苷具有一定的抑制 的作用，尤其HBsAg 和 HBeAg的能力非常強，200g/ml 的非細胞毒性濃度對HBsAg 和HBeAg 的抑制分別達85.8%和63.7%?？鄥A和氧化苦參堿在體外均具有較好的抑制HepG2 2.2.15 細胞HbsAg，HBeAg 的作。而苦參堿和氧化苦參堿相比較，兩者抗HBV 作用無顯著差別。pre-S1 抗原為HBV 的一種外殼蛋白，他和前S2 蛋白(Pre-S2)一起在 HBV 附著和侵入肝細胞的機制中起重要作用?？鄥A和氧化苦參堿在濃度為0.001

15、 mol/L 時對HepG2 2.2.15 細胞B)NR8383 細胞后TNF-、 MCP-1 的轉(zhuǎn)錄和表達 ，降低了素E2(PGE2)、磷脂酸A2(PLA2)、 NR8383Toll7(TLR7)88(MyD88)，NF- B65mRNA 水平，抑制TLR7 介導(dǎo)的 MyD88 依賴性信號通路，抑制了 NF- B65 的核轉(zhuǎn)位及表達，從而減輕流感 中的炎癥反應(yīng)。黃芩苷，槲皮素可拮抗甲型流感 細胞病變，調(diào)控細胞周期分布，并通過抑制Caspase8的激活，進一步抑制Caspase 3 活性，從而發(fā)揮抗 作用。黃芩苷能夠明顯抑制FM1 小鼠肺組織細胞的凋亡其可能通過影響細胞凋亡受體途徑 FAS/F

16、AS-1 系統(tǒng)而發(fā)揮抗流感 作用。是引起 性心肌炎的主要原因余 中的PhyllaemblicinB 在體外抑制奇 B3HeLa細胞病變效應(yīng)，并降低鼠體內(nèi) 濃度，降低鼠 中 LDH和CK的活性，減輕 性心肌炎小鼠心肌細胞的損傷，可在體外和體內(nèi)CVB3 誘導(dǎo)的細胞凋亡和心肌炎。 等研究黃芪對 性心肌炎(VMC)小鼠熱休克蛋白(HSP)70 及凋亡相關(guān) 蛋白產(chǎn)物表達的影響。黃芪可能通過上 肌細胞Bcl-2、HSP70的表達來抑制 所致的心肌細胞凋亡。蛇葡萄根HBsAg、HBeAgHBVDNA的 而初步顯示其抗 效果。藥物HBsAg、HBeAgHBvDNA的 抑制作用越明顯，呈濃度依賴性， 與作用時間

17、沒有明顯依賴關(guān)系。蛇葡萄根能夠抑制 p53 的活性， HepG22.2.15.細胞具有促凋亡作用，蛇葡萄根能選擇性抑制 HepG2 細胞中 HBv啟動子活性(cp,slpFp)tl,t4ts的活性。蛇葡萄根的抗 作HBv轉(zhuǎn)錄及p53p53細胞凋亡從而抑細胞凋亡從而抑（2） 免桂枝揮發(fā)油及桂皮醛對流 10-7、5.7710-7 g/mL，TI 分別為27.04、9.51。與和桂皮醛0.2510-5 g/mL 顯著升高細胞上清液中細胞干擾素-(IFN-)的量，作用機制可能與其激活Toll樣受體 -1受體相關(guān)激酶4(IRAK-4)誘導(dǎo)細胞干擾素- 甜素(GL)對 HepG2.2.15 變異株的及e抗

18、原及e 抗原呈負相關(guān)，TLR2 在變異株低表達，GLTLR2、4表達，至少在該細胞株 HBVTLR2、4信號的改變無關(guān)，但有可能在體內(nèi)通過免疫HBV。通過誘生、促進誘生干擾素免疫作用等達到的目的FM1 株小鼠的 CD4+/CD8+的比值降低IFN-/IL-4 的比值從而增強毒FM1株小鼠T 輔助細胞效應(yīng)，調(diào)整小鼠T 淋巴細胞亞群平衡和Th1/Th2 細-1型的作用和對小鼠免疫功能的影響。小鼠后可導(dǎo)致小鼠免疫功能降低，表現(xiàn)在胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、T 淋巴細胞刺激指數(shù)都較正常對照組降低，而經(jīng)過藥物治療后各指標均較 對照組返魂草提取物及其有效成分綠原酸，咖啡 有抑制流感 神經(jīng)氨酸酶的作NDV 誘生人全血

19、細胞及單核細胞產(chǎn)生干擾素，在發(fā)揮其抗 作用的同時又可促進機體產(chǎn)生干擾素，從不同途徑發(fā)揮其抗 作用。穿心蓮內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、苦參堿、綠原酸和 次 IMMVECsIFN- ，發(fā)揮抗 作用。從苦味 HBeAg從苦味 HBeAg 的作用。針對 HBeAg HBeAg 誘導(dǎo)轉(zhuǎn) 小鼠的動物模HBeAb和細胞毒T淋巴細胞產(chǎn)生、恢復(fù)T/B細胞應(yīng)答、IgG抗體和細胞因子產(chǎn)HBV HBeAg誘導(dǎo)宿主免疫耐受的藥物。 酸單銨鹽能顯著減輕 H9N2 FM 1 兩種流感 引起的小鼠肺部炎癥，調(diào)整 H9N2 T 淋巴細胞亞群比例的作用，小鼠的免疫趨向正常狀態(tài)。預(yù)防給藥能抑制 在雞胚內(nèi)的 。 的吸附、改善和調(diào)整 小鼠的

20、免疫功能等多種途徑而達到抗三、項目內(nèi)三、項目內(nèi)容和研究3.1研究目標和考核指標針對本中心重點研（S（HBV（EV71，靶點機理研究模型采用液相 技術(shù)（ 型微球流式熒光激光激發(fā)光中藥篩選方法，最終建立快速高通量抗 靶點篩選和中藥抗 機制研究體系；并利用該體系發(fā)現(xiàn)作用于靶點的中藥抗 有效部位、組分或成分，闡明所篩選的中藥抗 作用機理?？寺?有效作用靶點，包括流感 （ 、呼吸道合胞 （RSV、乙肝 （HBV、手足口 （EV71，本項目擬采用分子克隆技術(shù)，克隆表達與以上 致病機制相關(guān)的靶蛋白（結(jié)構(gòu)和功能蛋白，每個 克隆并純化 5個靶點蛋采用液相 技術(shù)（ 型微球流式熒光 靶點篩選和中藥抗 機制研究體系。

21、在此基礎(chǔ)上，對重點研究的目標 建立完善的中醫(yī)藥抗 多組分、多靶點篩選體系，并發(fā)現(xiàn) 5 個以上中藥新藥候選藥物。相關(guān)SCI 累計IF102中藥活性篩選技術(shù)創(chuàng)新團隊重點培養(yǎng)12名青年技術(shù)骨培養(yǎng)35、233.2 在活性篩選發(fā)現(xiàn)有效部位、組分、成分的基礎(chǔ)上，針對具有最優(yōu)作用效果的 ，運用分子生物學(xué)和 工程 ，以 E.Coli為工 載體，轉(zhuǎn)接目的 ，克隆其有效用分子生物學(xué)和 工程 ，以 E.Coli為工 載體，轉(zhuǎn)接目的 ，克隆其有效作用靶點，接入微球，采用液相 技術(shù)繼續(xù)篩選，最終建立快速靶點篩選和機制研各 研究內(nèi)容和實驗方案（重點為EV71RSV （1）EV71 Geneb 及本 已 的EV71 全 別

22、設(shè)計各蛋白全序列引物，其中 VP1-VP4、2A、2B、3A、3B 蛋白的 5端和 3端酶切位點分別為NdeIXhoI，2C3C3D5端和3端酶切位點分別為BamHIXhoI。 組的提?。簩⒈?200804作為 全 EV71 MA104 細胞進行 傳代擴增后，滅活 提取 RNA。調(diào)取目的 ：以提取得到的RNART-PCRPR 1.2A擴增的目的 。表達載體構(gòu)建：將回收的目的 片段雙酶切后將酶切片段與經(jīng)相同雙酶切的 p ET30(+)質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化 Transetta ( DE3 )感受態(tài)菌株，以PCR 鑒定陽性菌落。表達純化條件的優(yōu)化：挑取PCR鑒定陽性菌落接種于小體積LBSDS電泳鑒His

23、的蛋白過鎳柱純化，以不同濃度洗脫緩沖液優(yōu)化純化條件。（1）設(shè)計引物：根全序列設(shè)計以下引物，委托公GG TCCCCATCCGCTGAGGCA G GGGTTCCCCACCGAGCTA 3.2：CTCGAG CTGGATGGTGCCCGTCTGCA 4.2：CTCGAG CTTCAGTGGCGCTGCCA3D：3D1：（2）提常規(guī)培養(yǎng)MA104細胞， 待細胞生長成單層后以 復(fù)數(shù)量常規(guī)培養(yǎng)MA104細胞， 待細胞生長成單層后以 復(fù)數(shù)量( MOI )5的EV71接種90時收取細胞。棄培養(yǎng)上清，5630min R N A提取試劑盒提取RNA。提取步驟如下：向一支1.5ml 離心管中加入560L AVL

24、裂解緩沖液（含Carrier RNA，再向140L 的 分離培養(yǎng)物，充分混勻至少 15s。室溫下（15-25）10min Free加入約630L的混合溶液至置于收集管中8000rpm 離心 1min。 將吸附柱置于新的收集管的打開吸附柱向吸附柱中加入500L的緩沖液，8000rpm1min將吸附柱置于新的收集管的打開吸附柱向吸附柱中加入500L的緩沖液，14000rpm3min1.5ml離心管中，14000rpm1min1.5ml離心管中， 的打開吸附柱，向吸附柱中加入 60 L 的洗脫緩沖液，室溫靜置 2min 后，8000rpm 離心 1min，離心所得到的洗脫液即為所要獲取的EV71 組

25、RNA 溶液。 1）反轉(zhuǎn)錄：以獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄引模模RNaseFree總體3760min2）PCRPCR反應(yīng)。10XTaqReaction上游引物下游引物TaqDNA聚合dNTPs（10mM模板 在PCR儀上按下列條件進行PCR32 分別選取優(yōu)化合適的退火溫度X 回收目 目的條帶，得到擴增的目目的條帶，得到擴增的目10mlK B 100l PET-30a DH5大腸桿菌，37200rpm 5ml 菌種的PET-30a 質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒放置于-20保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物和PET-30a 在Microtube中配制下列混合液（10 X 高鹽酶切緩沖NdeI限制性內(nèi)切XhoI限制性內(nèi)切PCR產(chǎn) 在P

26、CRPCR PCR 產(chǎn)物純化試劑盒按照其說 在Microtube中配制下列混合液（總體積40l）: 10T4 DNA 連接Buffer10T4 DNA連接酶 質(zhì)粒pET-質(zhì)粒pET-目 在PCR16轉(zhuǎn)化：按照Transetta (DE3) Chemically Competent Cell 大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化操體LB 選擇性培養(yǎng)基中，37過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落進行PCR 反應(yīng)。PCR1：10010mlKana LB 培養(yǎng)基，37搖床5ml，按照質(zhì)粒提取試劑盒中說明書操作獲取質(zhì)粒溶液。 雙酶切鑒定：酶切反應(yīng)體系如下： 10H 酶切緩沖液質(zhì)粒溶 序列測定將PCR陽性菌獲得所表達蛋白編的核苷酸序列

27、分析（5） 表達條件優(yōu)化：挑取PCR 鑒定陽性菌落接種于小體積LB 培養(yǎng)液中增菌培養(yǎng)，然后以1:10、1:100、1:200 三積比轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液中，分別以20、30、 37劇烈震蕩培養(yǎng)3h，加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmoL/L 的異丙基 -D 硫代半乳糖苷(IPTG) 繼續(xù) 37劇烈震蕩培養(yǎng)1 好、2、4h 和6h，分別取1mL菌液，4000 rpm 離10min 收集菌體，加入去離子水和 2SDS 蛋白凝膠加樣緩沖液各100L 重懸，煮沸10min，12000rpm離心10min。取上清液20L 與蛋白Marker同時行 SDS電泳，用考藍同時行 S

28、DS電泳，用考藍R250 染色，脫色液脫色后觀察目的條帶濃30mL結(jié)合液重懸，0（冰浴、400W 2sec間2sec40min A鎳離子(Ni2+)B50mL 101 滴/5sec（1.0mL/minC 將 30mL 細胞超聲破碎液 0.45m 濾膜過濾后上樣。流速為 1 滴/5sec（約1.0mL/minD40mL 81滴/5sec（1.0mL/minE30mL1滴/5sec（1.0mL/min）收集各階段洗脫液，用 SDS檢測融合蛋白的分子量大小和純度；F 用純水流洗 10 個柱床體積，再用 20%的乙醇流洗 10 個柱床體積，流速為組共編碼11種蛋白質(zhì)，其中結(jié)構(gòu)蛋白7種，包括F、G、N、

29、P、L、SH、 M；非結(jié)構(gòu)蛋白 4 種，包括 NSl、NS2、M2.1、M2.2。根據(jù) Geneb引物，RT-PCR 調(diào)取相應(yīng)蛋白RSV11種蛋白編的獲得引物設(shè)計.根據(jù)引物設(shè)計.根據(jù)Genb查得RSV11種蛋白的5 設(shè)計引物并引入酶切位點，委托公司F：5-A：5-PCR：提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR方法獲得各目片段片段連接到克隆載體 pMD-18T，挑選正確克隆后以相應(yīng)內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與經(jīng)相同酶切的表達載體pET30a（+）將構(gòu)建好的帶有目的 片段的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達系統(tǒng) BL21(DE3)中，挑LB液體培養(yǎng)基中，37200rpm1的LB A66

30、0 0.8 IPTG 至終濃度 1.0mmolL 37誘導(dǎo)表達4h。10000g 離心4min 收集菌體，PBS 洗滌菌體、超聲后做SDS電泳(120V，1.5h)，考 藍染色觀察。His 親和方法純化目的蛋白：常規(guī)增菌誘導(dǎo)，收集菌體10000g 10 分鐘，棄上清，盡可能流凈培養(yǎng)液4ml 1Bingding Buffer 重懸0.1%加入NP- His.band5ml 于層析柱中， Buffer，31BindingBuffer依次過柱。加入準備好的裂解液，流速大約每小時 10 倍的層析柱體積10 體積的1Binding Buffer、6 體積1Washing Buffer 沖洗61Elute

31、 Buffer 洗脫目的蛋白。SDS電泳觀察蛋白純度，BCA 法測定蛋白濃度。3.3 解決抗 中藥作用機理不明確，缺乏靶點水平篩選體系 解決抗 中藥作用機理不明確，缺乏靶點水平篩選體系 解決抗 中藥藥效物質(zhì)篩選技術(shù)效率低、客觀性差等問題，針對 和宿主相互作用環(huán)節(jié)，以靶點篩選為 內(nèi)容，重點研究中藥抗 的作用機制；利用蛋白液相 等技術(shù)，建立中藥抗 高通量篩選技術(shù) 。3.4 3.4 EV71RSV關(guān)鍵有效102015 3.4 EV71RSV關(guān)鍵有效102015 1231 、HBV關(guān)鍵有2-3獲得10個關(guān)鍵靶點，建立可系，并獲得5 個以上高活 2016 1231 （萬元RSV2-3 個（萬元RSV2-

32、3 個相 技2-3 個2-3四、項目技術(shù)四、項目技術(shù)路線、對策及市場分4.1項目技術(shù)路線及其先進性和可行性分析（說明其主要技術(shù)創(chuàng)新點50 種中藥的50 種中藥的抗 部位、組分、成分的篩選同時進行，并全部進行抗 初步篩選，為 的EV71、RSV 等四種 主要致病結(jié)定成熟，利用本 情況保障，本 和聯(lián)合 山東省醫(yī)學(xué) 基礎(chǔ) ，組成11 人的團隊，高級、中級、初級研究知和技術(shù)標準分析及對策（含國內(nèi)、國際競爭力分析知識 完全屬于本 和聯(lián)合 ，有協(xié)議規(guī)定，可申請國際 PCT專利。技術(shù)水150億-200億中藥抗 研發(fā)的技術(shù)水平，尚處于傳統(tǒng)的研究水平，迫切需要機制清楚，成分相對明確的中藥新藥，本課題將提供這個

33、，快速高效的發(fā)現(xiàn)抗 中藥新藥候選靶點篩選液相 技術(shù)的建立，將極大的方便中藥研發(fā)，不僅是抗 中藥，這種五、基礎(chǔ)條五、基礎(chǔ)條件和優(yōu)5.1項目責(zé)任 和聯(lián)合 、團隊的基本情況（包括與項目實施相關(guān)的山東中 3 個博士后科研 站（中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)和中西醫(yī)結(jié)合，1 個教育部重點 （中 經(jīng)典理論 4 個國家中 管理局三級 （中藥質(zhì)量控制 、中藥制劑技術(shù) 、微循環(huán) 、細胞生物學(xué) ，2 個山東省 （天然藥物 、中藥制劑 3 個山東省工程技術(shù)；1個 SPF 實驗動物中心，2 個國家科研（7 個道之一，國家支持經(jīng)費 1 億元4 個山東省教育廳，2 個國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，1 個教育部工程技術(shù)中心；以及作為教育部重

34、點學(xué)科、國家中管局重點學(xué)科和山東省重點學(xué)科強化建設(shè) A 級學(xué)科的中醫(yī)文獻 ；建有山東中 GMP 中試 ，擁有學(xué)?？毓傻纳綎| 藥業(yè) ；實驗動物中心建筑面積 4000 平米，科研實驗中心建筑面積 4000 9000 為中藥創(chuàng)新藥物研究提供了共享科研 。課題聯(lián)合 山東省醫(yī)學(xué) 擁有生物安全2 級(BSL-2)和2 級生物安全柜活具有完善的 分離增殖、細胞培養(yǎng)和保存系統(tǒng)，如生物安全柜、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、液氮罐、超凈工作臺、高精密恒溫水浴系統(tǒng)、超低溫冰箱等。另外，梯度 擴增儀、低溫擁有面積達860m2的研發(fā)大樓技術(shù)上聯(lián)合 大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、 大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、國家 學(xué) 、 加州大學(xué) 分校公共衛(wèi)生學(xué)

35、院等眾多尖端科研機構(gòu)， 、技術(shù)與資源共享。在HIV、人皰疹病毒、高致病性流感 等 病原體的研究方面處于國內(nèi)領(lǐng)先，水平。中心已經(jīng)建立了較為齊全的學(xué)科發(fā)展方向，形成了 學(xué)基礎(chǔ)性研究、 方法研究、抗 藥物研究和抗體工程研究等幾個攻關(guān)課題組，同時已經(jīng)建立并繼續(xù)完善5個技術(shù)體系，包括： 組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、 、生物安全和實驗動物泰州承擔(dān)部省級項目5項， 學(xué)國開放課題2項，包含RD 細胞、MDCK 細胞、a 細胞在內(nèi)，研制開發(fā)快速試劑50 余種。公司建有裝備先進的生物 擁有 點樣儀 掃描儀熒光PCR合國家GMP 要求的生產(chǎn)廠房和生物安全二級 。江蘇省疾控中心生物安全三級 ， 學(xué)國家生物安全三級 及實驗動物生

36、物安全三級實驗室都能夠供 進行相關(guān)的試驗工作。同時可以充分利用園區(qū)建立的公共科技服務(wù)體系，確保項目的順利進行。公司擁有 資源數(shù)十種，細胞資源十余種，3 4.7 80005.2 項目責(zé)任 及聯(lián)合 與國內(nèi)外同類機構(gòu)的優(yōu)勢比較分析（完成項目預(yù)期目標的技術(shù)、 、機制、設(shè)施設(shè)備優(yōu)勢等）5.3（人月1男副2男3女學(xué)64男學(xué)65男66男6泰州7女88男69男45.3（人月1男副2男3女學(xué)64男學(xué)65男66男6泰州7女88男69男4女4清女4女4清女45.4項目 5.4項目 及主要骨干 的情況(從事過的主要相關(guān)研究及所負責(zé)任和作用相關(guān)研究和 成果、發(fā)明專利和獲獎情況，在國內(nèi)外主要 上1、個人簡介（應(yīng)包含本項目

37、中承擔(dān)的任務(wù)，21998年11 月1999年11月，德國PhilippsMarburg 大學(xué)生物藥物系學(xué)2004年 8月2010 年1 月藥學(xué)院，博32000 年至今，山東省中醫(yī)經(jīng)方工程技術(shù)3科技部2014 年“機理研究及服液12山東省高等學(xué)校協(xié)同創(chuàng)新計劃-中 抗 協(xié)同創(chuàng)新中心 基于毒-效 評價導(dǎo)向的千金子 制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究。國家自然科學(xué)基金，72 萬元，藥理及作用機理研究，在研。第四位?！案咧Y”病證結(jié)合診療優(yōu)化方案研究，國家科技部支撐計劃 2013 年入庫 （30772848國家自然科學(xué)基金，2008.01-2010.1230萬元，已結(jié)（ 30472193，國家自然科學(xué)基金

38、，2005.01-2007.1221 萬元，已結(jié)題，第四位?！捌礁畏剿幐深A(yù)高血壓病肝 證的代謝機制（ 30772865學(xué)基金，2004.01-2006.1230萬元，已結(jié)題，第五位20. HPLC 法測定. 降糖康膠囊質(zhì)量標準研究J. 中國藥業(yè),2007,01:25-,韓文正. HPLC 法測定舒筋活血片的含量J. 中國藥師,2007,02:150- 的影響J. 山東中,馬山. 毛細管電泳法(HPCE)測定克心痛滴丸中阿魏酸的含J. 中成藥,2005,01:41-庭,莊嚴. 毛細管電泳法拆分腎上腺素手性對映體J. 中國當,2010,17:125-,2010,17:125-. 大黃不同粒徑粉末在

39、大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究J. 山東中醫(yī)雜HPLC同時測定心腦治膠囊中三七皂苷R_1Rg_1、人參皂苷Rb_1 含量J. 中成藥,2006,05:655-658. 烏頭類藥物的毒性研究及烏頭的研究概述J. 食品與. 毛細管電泳法測定含成藥中鹽酸小檗堿的含量J. 山. 北蟲草多糖和多肽提取物的體外抗腫瘤研究J. 山東中醫(yī) 10年來，開始從事藥物及其藥理學(xué)研究。近幾年相關(guān)研究如下相成果 項。項目轉(zhuǎn)讓濟南金牛生物科，每年利稅超過1000一種真菌產(chǎn)活性物質(zhì)的確定和機制的研究國家自然基金（2006草糖苷20122013新型通用粘膜免疫佐劑（2010-2012腸71型致乳鼠免疫應(yīng)答變化的研究，省自然基金免疫牛

40、乳在預(yù)防手足口2015（3）一種新生33(4):343-志, 28(1):54-56,2009中國藥業(yè), 18(23) :5-6, 2009.近3年的相YuehuaQiao,LingjianMeng,JunWang,HongMeng,EffectofGanciclovironMurine -induced Hearing Loss in a Mouse M, Cell Biochem Biophys, 61(2):407-12, 2011QiaoYuehua, Zhang Longzhen, Xu Kailin, Zeng Lingyu, Meng Lingjian, Wang Jun, Hong Meng:Inflammatory Les of Cochleaurine Cytomegalo-InfectedMice HearingLoss, CellBiochemBiophys,62(2):281-7, Zhang M, Wang L, Zhao X, Zhao K, Meng H, Zhao W,C, TRAF-protein(TRIP)negativelyregulatesIFN-productionandantiviralresponsebypromoting proteasomal degradation of-bindingkinase1, JExp Med, 2