遺傳學(xué)各種技術(shù)總結(jié)

1、1、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-RFLP技術(shù))CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)技術(shù)又稱為限制性片段 長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)。是用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)材料時， 由于特定位點(diǎn)的堿基突變、插入或缺失數(shù)很少，以至無多態(tài)出現(xiàn)，往往需要對相應(yīng)PCR擴(kuò) 增片段進(jìn)行酶切處理，以檢測其多態(tài)性。CAPs標(biāo)記在二倍體植物研究中可發(fā)揮巨大的作用， 是PCR標(biāo)記的有力補(bǔ)充。但在多倍體植物中的應(yīng)用有一定的局限性。另外，CAPs標(biāo)記需使 用內(nèi)切酶，這又增加了研究成本，限制了該技術(shù)的廣泛

2、應(yīng)用。原理：PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消 化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同， 產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而 且方法簡便，分型時間短?；玖鞒蹋焊鶕?jù)基因名稱查詢序列，設(shè)計(jì)引物；提取基因組DNA； PCR擴(kuò)增；產(chǎn)物酶 切，凝膠電泳。2、TGF超家族轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor)家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長因子 亞家族組成，其中包括TGF-。、活化素(activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長分化因子(

3、GDF) 等。TGF-P除了影響細(xì)胞的增殖、分化，還在胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建 等方面起著重要作用。TGF-P家族成員廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，對 正常細(xì)胞、癌變細(xì)胞都有著顯著作用。TGF-P超基因家族成員共同的特征：N -端有1段信號肽序列，可借以跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；緊挨著生物活性區(qū)有由4個氨基酸(RSRR)組成的蛋白酶加工位點(diǎn)；C -末端包含9個保守的半胱氨酸的生物活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體。3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP技術(shù))日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是 由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用

4、力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少 地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠 中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象 上有差異的分子分離開。作者稱該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析。在隨后的研究中，作者又將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基 因突變，從而建立了 PCR-SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性。其基本過程是：PCR擴(kuò)增靶DNA;將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一

5、定空間結(jié)構(gòu)的單鏈 DNA分子；將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或漠化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn) 而推斷該DNA片段中有堿基突變。4、單核苷酸多態(tài)性(SNP指由于單個核昔酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體 或同一位點(diǎn)的核昔酸序列中，絕大多數(shù)核昔酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。包括單堿基的轉(zhuǎn)換，顛換、插入及缺失SNP在基因組內(nèi)的形式：遍布于基因組的大量單堿基變異；分布在基因編碼區(qū)(coding region)，稱其為cSNP，屬功能性突變。特點(diǎn)

6、:密度高、富有代表性、遺傳穩(wěn)定性、易實(shí)現(xiàn)分析的自動化5、全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是應(yīng)用基因組中數(shù)以百萬計(jì)的單核昔酸多態(tài)性(SNP)為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組 的水平上的對照分析和相關(guān)性分析，通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜形狀的基因變異的新策略。目前GWAS研究主要采用兩階段或多階段研究：第一階段：用覆蓋全基因組范圍的SNP進(jìn)行病例對照分析，統(tǒng)計(jì)分析后篩選出較少數(shù) 量的陽性SNP進(jìn)行第二階段或隨后的多階段中采用更大樣本的病例對照樣本群進(jìn)行基因分 型，然后結(jié)合兩階段或多階段的結(jié)果進(jìn)行分析。這種設(shè)計(jì)需要保證第一階段篩選與疾病相關(guān) 的SNP的敏感性和特異性，盡量減少分析的假陽性與假陰性的發(fā)生，第二階段：應(yīng)

7、用大量樣本人群，甚至在多種人群中進(jìn)行基因分型驗(yàn)證。6、基因芯片技術(shù)基因芯片又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray)0其原理是采 用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經(jīng)過相應(yīng) 處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上然后加入標(biāo)記的待測樣品，進(jìn)行多元雜交,通過雜 交信號的強(qiáng)弱及分布，來分析目的分子的有無、數(shù)量及序列，從而獲得受檢樣品的遺傳信息?；蛐酒軌蛲瑫r平行分析數(shù)萬個基因,進(jìn)行高通量篩選與檢測分析，解決了傳統(tǒng)核酸印 跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少等不足。根據(jù)所用探針類型，基 因芯片可分為cDNA

8、( comp lement DNA)芯片和寡核昔酸芯片;根據(jù)檢測目的又可分為表達(dá) 譜芯片和單核昔酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)芯片7、衛(wèi)星DNA標(biāo)記是一種新型的分子遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量大、分布廣且均勻、多態(tài)信息含量高、檢測快速 方便等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動、植物基因定位、連鎖分析、血緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性 評估、系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建、標(biāo)記輔助選擇等方面。特點(diǎn)：多態(tài)性和保守性，高靈敏性和高度特異性微衛(wèi)星DNA標(biāo)記原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù) 目不同，則通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰

9、胺凝膠電泳， 根據(jù)擴(kuò)增分離片段的大小決定基因型，并計(jì)算等位基因頻率。保守的側(cè)翼序列使微衛(wèi)星特異 地定位于染色體某一區(qū)域，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。微衛(wèi)星側(cè)翼 序列在相近的物種中具有一定的保守性。因此，某一物種的微衛(wèi)星引物可以在其相近的物種 中得以使用，這就使微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測丁作大幅度減少，從而加快對不同物種間比較基因圖 譜的制作速度。為此，常利用微衛(wèi)星標(biāo)記來檢測個體基因型，統(tǒng)計(jì)群體中等位基因的數(shù)目和 頻率，結(jié)合分子遺傳學(xué)和數(shù)量分類學(xué)原理，計(jì)算各個品種的遺傳變異程度、生存穩(wěn)定性，從 而初步評估品種的遺傳多樣性及品種間的親緣關(guān)系與分化關(guān)系。8、高通量測序技術(shù)(NGS技術(shù))又稱下

10、一代測序，是相對于傳統(tǒng)的桑格測序(Sanger Sequencing)而言的。目前高通量 測序的主要平臺代表有羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch GS FLX sequencer)， Illumina 公司的 Solexa基因組分析 (Illumina Genome Analyzer)和 ABI 的 SOLiD 測序 (ABI SOLiD sequencer)0原理：酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)PCR擴(kuò)增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、 三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一輪測序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對

11、，聚合酶就可以將其 摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP, ATP就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光， CCD檢測后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。單分子測序技術(shù)基于全內(nèi)反射顯微鏡(total Internal reflection microscopy,TIRM)的測序技術(shù)原理待測DNA樣品隨機(jī)打斷成小片段，在每個小片段的末端加上poly-dA；小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位，并逐一加 入熒光標(biāo)記的末端終止子；滌、成像，切開熒光染料和抑制基團(tuán)；滌、加帽，允許下一個核苷酸的摻入；樣通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時讀取大量序列。變性梯度凝膠電泳(DGGE)原理：雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和 電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一 樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑(尿素和甲酰胺)梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定 的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain, MD)和解 鏈