轉基因食品的檢測方法材料

1、生命科學前沿講座論文轉基因食品的檢測方法姓名：陳繼款系另上生命科學學院專業(yè)：生物信息學年級：2008級學 號：080567011指導老師：薛李春總成績：2010年07月02日轉基因食品的檢測方法自1983年世界第一例轉基因作物問世以來，目前全球轉基因農(nóng)作物種植面積已達到5 000萬hm2以上， 大量的轉基因農(nóng)產(chǎn)品被直接或間接的制成人類的食品，呈迅猛發(fā)展的趨勢。但是轉基因作物作為一種新物種， 其對人體健康、生態(tài)平衡是否具有危害還未確定。許多國家以立法或其他形式要求對轉基因產(chǎn)品進行標記。 我國于2001年5月23日頒布農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例，2002年3月20日開始實行的農(nóng)業(yè)轉基 因生物標識管

2、理辦法規(guī)定，國家對農(nóng)業(yè)轉基因生物實行檢驗檢疫和標識制度。世界各國均對轉基因食品及 其加工產(chǎn)品出具是否為轉基因產(chǎn)品的認定報告。因此轉基因產(chǎn)品的檢測就顯得尤為重要。轉基因食品的檢測 主要從兩個方面人手，一是核酸水平，即檢測遺傳物質中是否含有插入的外源基因；二是蛋白質水平，即通 過插入外源基因表達的蛋白質產(chǎn)物或其功能進行檢測，或者是檢測插入外源基因對載體基因表達的影響，主 要檢測外源基因對插入位點附近基因影響及對其代謝產(chǎn)物的影響，由于該類型檢測成本高，所需時間長，且 被認為重要性較低，目前該類檢測實際工作中較少涉及。本文分別對核酸和蛋白質兩種水平上的檢測方法進 行綜述。1核酸水平主要檢測報告基因、啟

3、動子和終止子，是當前轉基因產(chǎn)品檢測的重要手段。椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟 動子、胭脂堿合酶NOS終止子等10多種基因和基因片段廣泛存在于轉基因植物中，這就為檢測轉基因食品提 供了便利。核酸水平的檢測可以分為定性和定量兩種。1定性檢測1. 1聚合酶鏈式反應(PCR)1996年德國伯恩斯坦大學的Meyer Rolf等論證了 PCR檢測轉基因食品的可能性。利用該方法在鑒定轉 基因抗除草劑大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和轉基因抗蟲玉米系列標準品Btl76 Maxi maizer的實驗 中，可以檢測到僅為0. 5%轉基因成分。Matsuoka等通過對7種轉基因玉米轉入

4、的外源基因的序列分析，設 計了 14對檢測該7種轉基因玉米啟動子、終止子和結構基因的引物，分別對轉基因玉米、非轉基因玉米、轉 基因大豆、非轉基因大豆進行了 PCR擴增檢測，同時為檢測所設計引物的特異性，還對其他作物如水稻、大 麥、小麥等進行了 PCR擴增，檢驗結果表明該方法能夠快速有效地檢測轉基因玉米品種。每一次實驗均需要 設有陰性及陽性對照以確保實驗結果可靠性。在樣品采集及處理過程中也需要注意防止污染。1. 2 多重 PCR多重PCR是常規(guī)PCR方法的改進，它是在同一個反應中同時擴增兩個或多個目標基因序列。這種方法具 有更大的可靠性和適應性，并且能降低檢測成本。多重PCR可以同時針對幾個靶位

5、點進行PCR技術檢測。V. T. Forte等利用其設計的多重PCR方法對轉基因大豆和Bt玉米樣品進行實際檢測，結果表明該方法能夠 準確的檢測食品中是否含有轉基因成分，其檢測結果可以精確到2%0. 1%的范圍。Permingeat等僅用兩 對引物就可同時檢測出轉基因玉米Btl76、MON810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重PCR也可同 時準確地擴增出Roundup Ready大豆的NOS和epsps序列片段。1. 1. 3 巢式和半巢式 PCR(nested PCR and semi-nested PCR)巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基礎上發(fā)展起來的

6、一種PCR技術。其原理是設計兩對引物，其中一 對引物在另一對引物擴增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應對某個基因進行檢測。1. 1. 4 核酸印記法(southern blot)以放射性或熒光標記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農(nóng)產(chǎn)品的總DNA進行雜交。首先 用限制酶消化受體總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從 凝膠轉移至一固相支持體上。DNA轉移至固相支持體的過程中，各個DNA片斷的相對位置保持不變，用放射 性或熒光標記的探針與各個DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補的電泳條帶的位置。核酸印記法技 術用于食品外源基因的檢測可檢測出

7、外源基因與內源基因有高度同源性的DNA片斷，且準確可靠，但對樣品 的純度要求較高，費用也較高。1.2定量檢測1. 2. 1競爭性PCR通過比較要擴增的樣品中目標DNA和在同一體系中進行擴增的已知量的競爭性DNA而得到的，競爭性DNA 必須與目標DNA具有相同的引物和不同的分子量，以便二者既能同時進行擴增反應又能使擴增后的兩種產(chǎn)物 通過凝膠電泳區(qū)分開來。Anastasia k等在競爭性PCR的基礎上，對雙競爭性定量PCR(Double cmantitative competitive PCR，DCPCR)進行了研究，并與實時PCR進行了比較，證明競爭性PCR具有靈敏度高、探針價格 更低廉的優(yōu)點。

8、1. 2. 2 實時熒光定量 PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR)這是在轉基因食品檢測中非常重要的一種檢測技術。在該體系中，除了兩條普通的引物外，還有一條在 5和3端分別標記了報告熒光染料基團(R)、粹滅熒光染料基團(Q)，并與PCR產(chǎn)物特異片段結合的寡核苷 酸探針。熒光染料也有報道用SYBR Green021。陳穎等利用該方法對轉基因玉米Mon 810和Event 176的定 量檢測低限均小于0. 01%031。劉冰峰等利用該方法對轉基因煙草K358進行了檢測。它通過分析起始拷 貝數(shù)的方式以標準品制備標準曲線，從而判定待檢產(chǎn)品中的轉基因含量

9、。在整個檢測過程中閉管操作，使用 熒光染料特異標記PCR產(chǎn)物，實時顯示PCR產(chǎn)物的動態(tài)積累，且沒有繁雜的后續(xù)處理過程，避免了產(chǎn)物的污 染，方法快捷、靈敏、有效。2. 3多重熒光PCR多重PCR和實時熒光定量PCR的結合，劉光明等利用該技術對馬鈴薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共11份 實物樣品進行檢測，結果顯示馬鈴薯樣品2份及大豆、玉米、甜椒樣品各l份中檢出35S和Nos雙組分，另 6份樣品均未檢出。2蛋白質水平上的檢測1蛋白質印跡法(Western blot)蛋白質印跡法將電泳較高的分離能力、抗體的特異性和顯色酶反應的靈敏性結合起來，是檢測復雜混合 物中特異蛋白質的最有力的工具之一。普遍用于分離、

10、檢測特異的目的蛋白質，靈敏度為1 ng5 ng。它可 確定一個樣品中是否含有低于或超過預定限值水平的目的蛋白質，特別用于不可溶蛋白質的分析。vanDuijn 等用蛋白質印跡法檢測Roundup Ready大豆中的CP4合成酶，檢測限在0. 5% 1%。驗證該方法可對大豆 蛋白質產(chǎn)品進行檢測。2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)Rogan等用ELISA法檢測出傳統(tǒng)大豆加工產(chǎn)品中混有2%Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白質。這 種蛋白質檢測方法具有商業(yè)可利用性并具有高度選擇性和靈敏性。免疫測定的主要缺點之一

11、是復雜基質對它 的準確性和精確度有干擾，如加工的蔬菜和食品。某些導入蛋白質并不是在植物的所有組織中均有表達，例 如在玉米中一些蛋白質大部分表達在葉子中，而不在谷粒中。3其它檢測方法隨著國內外對轉基因產(chǎn)品檢測研究的深入以及各國對轉基因產(chǎn)品檢測要求的提高，迫切地需要更準確、 快速、安全、高效且成本低廉的檢測技術的問世。除了上面介紹的方法外，還有一些其它的檢測方法。目前， 色譜技術(HPLC)、近紅外波譜技術(NIR)、毛細管電泳技術(CE)、超分支滾環(huán)擴增技術(HRCA)以及基于一些成 熟技術建立起來的試劑盒技術、試紙條技術在轉基因食品的實際檢測中都有所應用。4結束語轉基因食品的檢測方法多種多樣，

12、各有其優(yōu)缺點。在實際的檢測中，并非任何一種檢測方法對某種轉基 因食品的檢測都行之有效。應該根據(jù)食品種類和加工類型的不同，以及食品中可能含有的轉基因片段的不同， 選擇最有效的檢測方法。同時，現(xiàn)有的檢測方法也在不斷的改進中，隨著各國有關轉基因成分標簽法的建立 和不斷完善，對轉基因成分的準確定量檢測顯得日趨重要。這就要求，轉基因食品的檢測方法向著高質量、 高靈敏度、高準確性、自動化和低成本的方向發(fā)展。轉基因產(chǎn)品檢測儀器轉基因產(chǎn)品的檢測，就是檢測產(chǎn)品中有否外源基因，其實是檢測啟動子、終止子、標記基因片斷、目的 基因片斷、外源基因轉錄產(chǎn)物的豐度等。就方法而言，又分為基因水平的檢測(各種PCR擴增、定性、定量 方法和基因芯片技術)和基因轉錄水平檢測(酶聯(lián)免疫吸附反應技術、蛋白芯片技術以及Southen雜交Western 印跡法等)，主要使用儀器按檢測程序分三部份：1、用于DNA樣品制備的儀器設備：試劑盒、微量