內(nèi)蒙古大學(xué)生物技術(shù) 基因工程實(shí)驗(yàn)論文2

1、 分類(lèi)號(hào): Q78 編號(hào): 00911031 本科生基因工程實(shí)驗(yàn)論文納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)指導(dǎo)教師：王 鄭 學(xué) 生： 專(zhuān) 業(yè)： 生物科學(xué) 年 級(jí)： 2009級(jí) 2012年 8月26 日 目 錄摘要11 緒論22 HYPERLINK l _Toc105509704 材料與方法.2 2.1 材料2 HYPERLINK l _Toc105509705 2.1.1 菌株與質(zhì)粒2 2 2.1.2.1 試劑22.1.2.2 試劑與培養(yǎng)基的配制22.1.1.3 主要儀器5 2.2 方法5 HYPERLINK l _Toc105509711 2.2.1納豆激酶（NK)引物的設(shè)計(jì)5 HY

2、PERLINK l _Toc105509712 2.2.2 NK基因的PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)5 HYPERLINK l _Toc105509713 2.2.3 DH5a和BL21(DE3)感受態(tài)的制備7 HYPERLINK l _Toc105509714 2.2.4 pMD19-T-NK的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和鑒定8 HYPERLINK l _Toc105509715 2.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切與回收9 HYPERLINK l _Toc105509716 2.2.6 pET-Trx-NK的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測(cè)9 HYPERLINK l _Toc105509717 2.2.7 pET

3、-Trx-NK的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS檢測(cè)93 HYPERLINK l _Toc105509720 結(jié)果與分析11 HYPERLINK l _Toc105509712 11 HYPERLINK l _Toc105509713 3.2. pMD19-T-NK的構(gòu)建與鑒定11 HYPERLINK l _Toc105509714 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收12 HYPERLINK l _Toc105509715 3.4 pET-Trx-NK的構(gòu)建與檢測(cè)12 HYPERLINK l _Toc105509716 3.5 pET-Trx-NK的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS檢測(cè)13結(jié)論與 HYPERLI

4、NK l _Toc105509727 討論13 HYPERLINK l _Toc105509728 參考文獻(xiàn)14 HYPERLINK l _Toc105509730 致謝與感想16納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)摘要 納豆激酶是一種良好的天然蛋白酶類(lèi)溶栓物質(zhì)。納豆激酶基因長(zhǎng)度約為837bp.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建納豆激酶基因表達(dá)載體，使納豆激酶基因在大腸桿菌中順利表達(dá).我們從經(jīng)克隆在PMD-18-T載體上的納豆激酶基因，用PCR技術(shù)擴(kuò)增后獲得其837bp的DNA片段，將該基因片段同PET-trx載體連接后轉(zhuǎn)入DH5a菌中，篩選出重組子。對(duì)重組子運(yùn)用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后得到納豆激酶基因片段

5、，將該基因片段插入表達(dá)載體puck-NK中，再次轉(zhuǎn)入DH5a菌中，篩選出重組子，再將該重組子基因轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中，通過(guò)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，用SDS檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)物納豆激酶。關(guān)鍵詞：納豆激酶，基因表達(dá)，載體，大腸桿菌Constructing Expression Vector and Expressing NK in li Author： Supervisor: Wang ZhengABSTRACTNattokinase(NK) is a good natural protease thrombolytic substance. It is Gene length about for 837

6、bp. This experiment through building Nattokinase gene expression carrier, make it smoothly expression in Escherichia coli. We acquired Nattokinase gene from clonened in PMD-18-T carrier, with PCR technology expansion increased , we obtained the 837bp of DNA fragment , and connected it with PET-trx c

7、arrier , then, we transferred it to DH5a bacteria , filtered out recombinants. We got nattokinase gene fragment resulting from cutting the recombinants by Restriction endonucleaset , inserted the gene fragment into expression vector puck-NK, Transferred it into DH5a bacteria again , filtered out rec

8、ombinants, and then ,we Transferred the recombinant gene into BL21 (DE3) bacteria, through induced by IPTG , nattokinase Induction products measureed by SDStechnologies.KEY WORDS: Nattokinase, gene expression, vector，li1 緒論由血栓引起的血栓性疾病是一種常見(jiàn)的心腦血管疾病。溶栓劑是預(yù)防與治療心腦血管疾病的主要抗血栓藥物，在人類(lèi)健康上具有重要意義，也具有廣闊的市場(chǎng)潛力。目前國(guó)內(nèi)外

9、各種新型溶栓劑主要包括第三代溶栓劑組織型纖溶酶原激活劑變異體、導(dǎo)向溶栓劑、嵌合體溶栓劑以及有前景的各種天然溶栓劑。1980 年須見(jiàn)【1】教授在美國(guó)芝加哥大學(xué)進(jìn)行血栓溶解酶pro- UK與UK的構(gòu)造分析研究時(shí)，無(wú)意間發(fā)現(xiàn)納豆食品中含有高濃度的血栓溶解成分，納豆食品在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶，將其命名為納豆激酶(Nattokinase, NK)， Nakamura【2】等首次報(bào)道了包括調(diào)控順序在內(nèi)的1473bp的 NK全長(zhǎng)基因序列，NK基因以GTG為起始密碼子，隨后是1143bp組成的閱讀框架，N端的第129個(gè)氨基酸殘基是信號(hào)肽，第30106的77個(gè)氨基酸殘基是前肽，隨后的275個(gè)氨基酸殘

10、基為納豆激酶成熟肽。這使從基因工程角度入手提高納豆激酶活性及產(chǎn)量成為可能。更進(jìn)一步的研究表明，納豆激酶能有效的溶解血栓，與臨床藥物如尿激酶（UK）、鏈激酶（SK）等相比，具有在體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)，易被人體吸收，無(wú)副作用，生產(chǎn)成本低，能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）以進(jìn)一步增強(qiáng)溶栓作用等優(yōu)點(diǎn)，所以納豆激酶可以被開(kāi)發(fā)為同時(shí)具有預(yù)防和治療功效的新型的溶栓藥物【3】。此外納豆激酶還具有降血壓，降血脂，降膽固醇，抗氧化等多方面作用。納豆激酶在所有的纖溶酶類(lèi)產(chǎn)品中研究最早，目前也是開(kāi)發(fā)最多的溶栓劑產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)外對(duì)納豆激酶已有二十多年的研究，其理化性質(zhì) 溶栓機(jī)制 分離純化等已被人們所了解，納豆

11、激酶類(lèi)藥品及保健食品的研究正在進(jìn)行當(dāng)中【4】。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)納豆激酶的研究主要集中在優(yōu)化枯草桿菌發(fā)酵條件以提高產(chǎn)量，蛋白結(jié)構(gòu)分析，生理生化特性，藥理藥效等方面【5】。另外，日本學(xué)者還通過(guò)藥物刺激、紫外線誘變、放射性照射、細(xì)胞融合和染色體插入變異等方法獲得納豆激酶高產(chǎn)菌株。而近年來(lái)以基因工程方法構(gòu)建納豆激酶的高效表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)來(lái)提高納豆激酶的表達(dá)水平一直是研究的熱點(diǎn)，并且取得了很大的進(jìn)展【6-7】。國(guó)內(nèi)主要進(jìn)行了納豆桿菌液體發(fā)酵條件、納豆激酶的春花等方面的研究，目前利用原核（如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）或真核細(xì)胞（如畢赤酵母）進(jìn)行基因表達(dá)純化后獲得的納豆激酶，其活性普遍較低【8】。因此，納

12、豆激酶的研發(fā)潛力和空間都是巨大的，納豆激酶極有希望成為新一代理想的預(yù)防和治療血栓的生化藥物。 本實(shí)驗(yàn)的目的在于構(gòu)建納豆激酶基因重組表達(dá)載體，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行初步研究，首先旨在利用實(shí)驗(yàn)室基本儀器進(jìn)行基因工程以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的熟練操作，也旨在利用基因工程技術(shù)提高納豆激酶的產(chǎn)量，為生產(chǎn)實(shí)踐和藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。2 材料與方法【9】 菌株與質(zhì)粒本研究所采用的是已經(jīng)克隆在PMD-18-T載體上的納豆激酶基因(日本TaKaRa提供，本基因工程實(shí)驗(yàn)室保存提供），菌株為E.coil DH5a、BL21(DE3），表達(dá)載體PET-trx、PUCK-ET來(lái)自美國(guó)基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室公司，為本基因工程保存提供.主要試劑

13、及其配制.1 試劑 RNase A；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)：DNA HindIII，Tiangen 公司的 Marker II 或 Marker III 等。EcoR I 和 BamH I 內(nèi)切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、dNTP 混合液、X-gal、 IPTG、低分子量蛋白分子量 Marker：97.4、66.2、43、31、2，14.4 kDa等。其他常用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。.2 試劑與培養(yǎng)基的配制1、LB培養(yǎng)基（按 1L的量計(jì)算） 胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加200ml dd water攪拌完全溶解

14、，用約200uL 5N NaOH調(diào)PH至7.0，加dd water至1L，121C 20min分裝滅菌。在培養(yǎng)菌種時(shí)，向里面加入20%葡萄糖，終濃度為 0.2%。提取質(zhì)粒時(shí)，向里加入氨芐青霉素，終濃度100ug/mL.2溶液 稱(chēng)取60mmol/L的CaCl2 ,充分溶解；稱(chēng)取10mmol/LPIPES，充分溶解；量取15%的甘油75ml。三者混勻后，加蒸餾水至500ml，121C 20min分裝滅菌后4C保存。3、50TAE緩沖液（pH約8.5） Tris堿242g2EDTA-2H2O,dd water定容至1L，用時(shí)稀釋 成1.4、1000溴化乙錠儲(chǔ)存液（0.5mg/mL)： 50mg溴化乙

15、錠溶于100mldd water,4C避光儲(chǔ)存。使用時(shí)在蒸餾水里滴入適量，使水看起來(lái)微微發(fā)紅即可。氨芐青霉素儲(chǔ)存液 無(wú)菌水配制100mg/mL,分裝后-20C保存。6、 0.5mol/L EDTA pH8.0 稱(chēng)取 Na2EDTA-2H2O，加入約80mL的去離子水，充分?jǐn)嚢?。用NaOH顆粒調(diào)節(jié)pH值至（約2g NaOH）,使其完全溶解。加去離子水將溶液定容至100mL。高溫高壓滅菌。7、1mol/L Tris HCl pH7.5 稱(chēng)取 Tris堿,加80mL蒸餾水，緩慢地加濃鹽酸至 pH6.8（約加6.5mL）。讓溶液冷卻至室溫，調(diào)至pH7.5，加蒸餾水至100mL。高溫高壓滅菌后4C保存.

16、8、1mol/L Tris HCl pH8.0 稱(chēng)取 Tris 堿, 加80mL蒸餾水緩慢的加濃鹽酸至 pH8.0（約加4.2mL）。讓溶液冷卻至室溫，調(diào)至pH8.0，加蒸餾水至100mL。高溫高壓滅菌后 4C保存.9、去鹽分溶液的配制（1）溶液I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA,調(diào)pH8.0.（2）溶液II（NaOH/SDS 溶液)：mol/L NaOH，1% SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配.（3）溶液III KAc 溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸調(diào)至 pH4.8 ，

17、 補(bǔ)dd water至100mL.TE-緩沖液的配制 10mmol/L Tris HClpH8.0.1mmol/L EDTA pH8.0，高溫高壓滅菌.加樣、上樣緩沖液的配制（1）10加樣緩沖液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍(lán)；（2）6加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液。（3）2上樣緩沖液：mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油 2mL，20%SDS 2mL， %溴酚藍(lán)mL.（4）5電泳緩沖液：Tris ，甘氨酸 36g，SDS g，加 dd water至 500mL，使用時(shí)稀釋5倍12

18、、95%和70%乙醇（各配制100ml)（1）95%的乙醇配制：量取95ml無(wú)水乙醇，加水至100ml,混勻即可。（2）70%的乙醇配制：量取75ml無(wú)水乙醇，加水至100ml,混勻即可。13、10%SDS 蒸餾水配制，室溫保存。14、30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亞甲基雙丙烯酰胺）：30g Acr+ Bis，用 dd water 定容至100mL，4C棕色瓶避光保存。 17、20（M/V）%IPTG無(wú)菌水配制，過(guò)濾滅菌。18、100mg/mL（M/V）IPTG 無(wú)菌水配制，過(guò)濾除菌19、2%（M/V）X-gal：用 N,N-二甲基甲酰胺配制，過(guò)濾滅菌?？捡R斯亮藍(lán) R250 染色

19、液 考馬斯亮藍(lán) R250 + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸，用dd water定容至 100mL21、脫色液的配制95%乙醇/冰醋酸/水= 5（體積比）.3 主要儀器Biometra公司的PCR儀、北京六一儀器廠的GYY-1型電泳儀及DYCP-31D型水平凝膠電泳槽、英國(guó)Grant的凝膠成像儀 、德國(guó)Eppendorf的AG5415R型臺(tái)式離心機(jī)，太倉(cāng)科教器材廠的旋渦混合器，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的微量移液取樣器，金壇市富華公司的SHE-723G的恒溫振蕩器，雙面微量離心管架，試管架，標(biāo)簽紙，制冰機(jī)。英 國(guó) Grant 公司的PHC -19干式 恒 溫 器

20、、LG公 司 的 微 波 爐、太倉(cāng) 科 教 器 材 廠的 渦 旋 振 蕩 器、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)等。2 .2 實(shí) 驗(yàn) 方 法2 .2 .1 納 豆 激 酶（ N K )引 物 的 設(shè) 計(jì)上游引物（5端帶 BamHI 酶切位點(diǎn)） 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3下游引物（5端帶 EcoRI 酶切位點(diǎn)） 5-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3待擴(kuò)增的 NK 片段長(zhǎng)度：837bp（825bp NK+5BamH I 位點(diǎn) GGATCC，3EcoRI 位點(diǎn) GAATTC）。 NK基因的PCR擴(kuò)增及

21、電泳檢測(cè)取 1L自己提取的質(zhì)粒 pMD18-T-NK，加入 9L dd water 稀釋作為 PCR 模板。2. 在 mL PCR 微量離心管中按下列參考劑量配制 50L 反應(yīng)體系。；45LPCR supermix ；1L模板 ；1L引物1 ； 1L引物2，1Ldd water; 共計(jì)50L。 3. 根據(jù) PCR 儀的操作手冊(cè)設(shè)置 PCR 儀的循環(huán)程序：（1） 94C 5min （2） 94C 1min （3） 60C 1min （根據(jù)引物的 Tm 值設(shè)定）（4） 72C 1min50s （根據(jù)所擴(kuò)增的 DNA 的長(zhǎng)度設(shè)定）（5） go to（2） 29 times（6） 72C 10min4

22、、PCR 結(jié)束后，取 510L 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠上是否有預(yù)計(jì)分子量的主要產(chǎn)物帶。 電泳步驟：稱(chēng)取 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入 25mL 1TAE 電泳緩沖液（注意原液是 50 ，需要自己 稀釋?zhuān)。?，用保鮮膜蓋住，放入微波爐中燒開(kāi)（0.5min）。25mL 正好能倒 滿(mǎn)一塊小膠。（2）注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐。（3）戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻至不燙手。（4）把梳子（最細(xì)的齒）插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模 具的矮邊 緣相差 12mm 即可，但盡量不要太厚，更不要把膠溶液溢到外面。在桌面 上靜置 1020 分鐘

23、 待膠完全凝固。在水平電泳槽中加滿(mǎn)1TAE 電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長(zhǎng)度把電泳儀的電壓 調(diào)至 10V/cm（170V），注意正負(fù)電極的位置連接正確。待膠完全凝固后（1520 分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出 模具和凝膠 放入電泳槽中間的平臺(tái)上，凝膠要沒(méi)入電 泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極（黑 色電極）。（7）取 1小片光面紙，點(diǎn) 6L蒸餾水、1L 10加樣緩沖液，再加入 3L 質(zhì)粒 DNA 溶液制成 10LDNA混合樣品。在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用 10L的吸液頭分別將紙上的混合樣品加入凝膠的加 樣孔中。在電泳 PCR 產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物時(shí)，在相鄰的加樣孔中加

24、入 2LDNA 分子量 標(biāo)準(zhǔn)物。（9)打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，170V 電泳。樣品將形成一條藍(lán)色的橫帶向前移動(dòng)（如果發(fā)現(xiàn)藍(lán)色向后移動(dòng)，立 即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進(jìn)行約 30min。(10)當(dāng)藍(lán)色的溴酚藍(lán)遷移到距凝膠邊緣1cm時(shí)，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。(11)把帶有樣品的凝膠小心放入盛有 EB 的搪瓷盒中。以下需戴手套到專(zhuān)門(mén)的染色區(qū)操作。放置約 10 分鐘后，取出來(lái)在自來(lái)水中浸泡 10min。用自來(lái)水沖洗后放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。(12)染有 EB 的凝膠和手套（只要手套沒(méi)破，可以節(jié)約使用：將手套脫下來(lái)以后張開(kāi)口放在染色區(qū)， 下一次把手伸進(jìn)去即可）要放到專(zhuān)用的垃圾袋中作專(zhuān)門(mén)處理，以免污染環(huán)境。

25、不可用接觸過(guò) EB 的手套接觸電腦或凝膠成像儀的門(mén)。 DH5a和BL21(DE3)感受態(tài)的制備取一支無(wú)菌的搖菌試管,在超凈工作臺(tái)中加入 2mL LB 培養(yǎng)基（不含抗菌素！） 冰柜中取出 DH5a菌種和 BL21(DE3)菌種，放置在冰上。在超凈工作臺(tái)中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含 2mL LB 培養(yǎng)基的試管中，37搖床培養(yǎng)過(guò)夜。3. 在超凈工作臺(tái)中取 mL 上述菌液轉(zhuǎn)接到含有 50mL LB 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37下 250r/min搖床培養(yǎng) 23h。4. 取少量菌液測(cè)定 OD590 為 （0.4 OD 0.6），細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)?。?。以下除離心外，都在超凈工作臺(tái)

26、中進(jìn)行。5. 將菌液分裝到mL預(yù)冷的無(wú)菌微量離心管中，于冰上放置 10min，然后于4，5000r/min 離心 10min。棄上清，并將離心管倒置以倒盡上清液。加入 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶 液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置 30min。7. 4，5000r/min 離心 10min。棄上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液垂懸，插入冰中放置 30min。8. 4，5000r/min 離心10min。棄上清液后，用 200L冰冷的mol/LCaCl2溶液垂懸，超凈工作臺(tái)中按每管 50L分裝到 mL的無(wú)菌微量離心管中。分裝好的感受態(tài)

27、菌可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八），或立即放入-80超低 溫冰柜中保 藏（可存放數(shù)月）。以后用的時(shí)候每次用完一管，不可反復(fù)凍融。2.2.4 pMD19-T-NK的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和鑒定壓滅活的 mL 微量離心管，加入載體連接體系：2L PCR產(chǎn)物；2L pMD19-T載體；1L 10Buffer緩沖液；4L dd Water ，1LT4DNA連接酶。共計(jì)10L.2.將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14水中保溫3h。3.從-80超低溫冰柜中取出一管（50L）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴510min。5L連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過(guò) 100ng） 輕輕震蕩后放置冰上

28、 20min。后，42水浴 12min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 35min。作臺(tái)中向上述管中加入 300L LB 培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的 彈簧架上 37震蕩 45min。轉(zhuǎn)化混合液 50300L（根據(jù)轉(zhuǎn)化效率和載體連接效率而定），滴到含合 適抗菌素的固體 LB 平板培養(yǎng)皿中。從酒精中取出玻璃涂布棒，在火上點(diǎn)燃，熄滅后稍等片刻， 待其冷卻后輕輕涂布均勻。和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話(huà)，滴完菌液后再在平板上滴加 40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。9.在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在 37恒溫培養(yǎng)箱中約 1030min

29、 直到表面的液體都滲透 到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)放入 37恒溫培養(yǎng)過(guò)夜.10.在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取 3 個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部 玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。11.在超凈工作臺(tái)中取 3 支無(wú)菌搖菌管，各加入 3mL LB（含 100g/mL 氨芐青霉素），用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。作臺(tái)中將 70%乙醇浸泡過(guò)的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。用牙簽的尖 部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有 3mL LB（含 100g/mL 氨芐 青霉素）的搖菌管中。搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液暫保留在 4冰箱中。14.將提取到的 3

30、 管質(zhì)粒樣品與已知分子量的質(zhì)粒同時(shí)電泳，根據(jù)分子量判斷和選取有插入片段的質(zhì)粒。 HYPERLINK l _Toc105509715 2.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切與回收先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。混合下列溶液于一個(gè)高壓滅菌的mL 微量離心管中：8L 質(zhì)粒DNA ；4L 10酶切緩沖液(BamHI) ；1L EcoRI ; 1L BamHI .共計(jì)40L。動(dòng)微量離心管，使管中的溶液混勻。再在離 心機(jī)中 2000r/min 離心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在 37水浴中酶切 3.5 h。3.取少量（約 10L）酶切產(chǎn)物，與合適的已知分子量的 DNA（先前的 PC

31、R 產(chǎn)物或 Marker 等） 對(duì)比電泳，確認(rèn)酶切成功后，進(jìn)行片段的回收。4.電泳結(jié)束后用薄塑料片（如 卡）切下含有少量 DNA 酶切產(chǎn)物的泳道，EB 染色。在紫外燈 下找到目的 DNA 帶，用刀片在目的 DNA 帶的下上下邊緣各切一個(gè)小口作為標(biāo)記。含有大量 DNA 酶切產(chǎn)物的凝膠既不用 EB染色，也不用紫外燈照射。5.將做好切口標(biāo)記的凝膠條用保鮮膜包住，與未染色的凝膠原位對(duì)齊，根據(jù)小膠條上的切口標(biāo)記 估計(jì)未染色的大膠上 DNA 酶切產(chǎn)物的位置，用刀片切下大膠中 DNA 產(chǎn)物所在的凝膠。6.按照上海生工 UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒操作步驟回收pMD19-T-NK片段。2. pE

32、T-trx-NK的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測(cè)菌的 mL 微量離心管，加入連接體系：4L NK回收片段；1L DNA連接酶（TAKARA,350L/mL);1L連接酶緩沖液。共計(jì)10L。2.將上述混合液輕輕震蕩后離心1min，然后置于14干式恒溫儀中保溫過(guò)夜。DH5a菌中，再進(jìn)行檢測(cè)，篩選出連接產(chǎn)物。 HYPERLINK l _Toc105509717 pET-Trx-NK的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS檢測(cè)1.按下列組合用 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：BL21（DE3）空菌 不加 IPTGpET-his 轉(zhuǎn)化的 BL21（DE3）菌 加 IPTG 至 100g/mLpET-his-NK 轉(zhuǎn)化的 BL21（DE3）菌 加

33、IPTG 至 100g/mL0170r/min 37C 搖菌 1.53h。04000r/min 離心 15min，棄掉上清液，收獲菌體。的菌體與 2上樣緩沖液按 1：1 混勻于微量離心管中。量離心管用封口膜封住管蓋，插入水漂中，放在電磁爐鍋里的沸水中煮 35min。然后 立即插入冰中。（可在-20C 冰柜中保存）。6.清洗并擦干電泳玻璃板，組裝電泳槽。 10%分離膠：按順序和量取下列溶液混在一個(gè) 50mL的小燒杯中（Tris為pH8.8）：Acrylamide-Bis 3.96 mL1M Tris PH8.8 4.38 mLD.dWater 3.432 mL10%SDS 1LTL10%APS

34、1L：按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤夯煸谝粋€(gè) 50mL 的小燒杯中（注意 Tris ）：Acrylamide-Bis mL Tris pH6.8 mL dd water 3.165 mL10%SDS 45L45L10%APS 4545L8、按實(shí)驗(yàn)手冊(cè)規(guī)范倒膠。 400mL 1電泳緩沖液。將電泳槽傾斜，在電泳槽的下部緩慢加入 1電泳緩沖液。同時(shí) 觀察在玻璃中膠下緣的氣泡隨液面被趕出，然后放平電泳槽。在上部倒?jié)M電泳緩沖液（約 250mL),緩慢小心地拔出梳子。如發(fā)現(xiàn)加樣孔形狀歪斜，用注射器針頭（剪平尖部）或細(xì)鐵絲修平加樣 槽底部和側(cè)面的膠面。取幾個(gè)形態(tài)好的加樣槽，在實(shí)驗(yàn)記錄本上做好對(duì)應(yīng)的標(biāo)

35、記。用微量移液器在側(cè)面的一個(gè)加樣 槽中加入 510L低分子量蛋白分子量 Marker，其它槽中加入 1020L 自己制作的樣品。極，將電流調(diào)至10mA，待溴酚藍(lán)移到分離膠后，再將電流調(diào)至 20 mA，電泳約 23h，期間隨時(shí)觀察電泳槽下部膠的前沿是否有氣泡。當(dāng)溴酚藍(lán)移到玻璃距底部 cm 時(shí)切斷電源。12.在一個(gè)搪瓷盤(pán)里準(zhǔn)備適量的考馬斯亮藍(lán)染色液。13.倒掉電泳槽中的緩沖液，取下玻璃。小心用或 卡從下部將帶有缺口的玻璃板撬起14.染色 1045min后,把膠移入脫色液，輕輕搖動(dòng)脫色過(guò)夜。15.觀察脫色后膠里的藍(lán)色帶紋，與對(duì)照比較或?qū)ふ耶惓４值膸Ъy，并比較其分子量（NK 蛋白約3340kDa），判

36、斷是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物。3 結(jié)果與分析3.1 NK基因的PCR擴(kuò)增（圖1：基因的PCR產(chǎn)物電泳圖：號(hào)泳道為DNA arker,3、號(hào)泳道都為PCR產(chǎn)物）NK基因全長(zhǎng)約837bp，電泳圖的3、4號(hào)泳道分別為PCR產(chǎn)物，3號(hào)可能由于在提取質(zhì)粒的過(guò)程中出現(xiàn)了問(wèn)題，或者是加樣式出現(xiàn)了問(wèn)題，導(dǎo)致了幾乎沒(méi)有PCR產(chǎn)物，因此，電泳只能隱約看見(jiàn)條帶，而號(hào)泳道中顯示，該樣品質(zhì)粒含量較高，即提取成功，下一步實(shí)驗(yàn)可用。3.2 pET-Trx-NK的構(gòu)建與檢測(cè)（圖：提取得三種質(zhì)粒電泳圖：、號(hào)泳道分別為：PET-Trx、PET-NK、PUCK-NK）電泳圖顯示，PET-Trx、PET-NK、PUCK-NK的質(zhì)粒提取都不

37、是很理想，條帶模糊而且不太明亮，但質(zhì)粒的存在說(shuō)明了這三個(gè)菌種在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行了增值，可能由于某些原因，導(dǎo)致了菌液濃度過(guò)低、或者是在提取過(guò)程中質(zhì)粒有所損失，但該電泳結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)材料是可用的，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.3 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收（圖：pET-Trx及pMD19-T-的酶切電泳圖：、泳道分別為pET-Trx小樣、大樣：、號(hào)泳道分別為PET-NK小樣、大樣。5、6號(hào)泳道分別為PUCK-NK小樣、大樣；、號(hào)泳道為NK PCR產(chǎn)物小樣、大樣其中，小樣為L(zhǎng)樣1L Buffer,大樣為39L樣1L Buffer ）電泳條帶清晰明亮、三個(gè)菌種的質(zhì)粒DNA酶切效果比較好，同

38、PCR產(chǎn)物相比，他們的分子量比較低。（圖4：從凝膠中回收的NK片段電泳圖：1號(hào)泳道為劉杭州小組的，2號(hào)泳道為王文朋小組回收到的NK片段回收?qǐng)D。圖中顯示，回收效果并不理想，條帶清晰度明顯不夠，甚至沒(méi)有，原因可能是剛開(kāi)始的酶切效果就不好，或者是回收過(guò)程中沒(méi)有將NK片段從凝膠中全部回收回來(lái)，大部分都被遺棄，所以導(dǎo)致回收結(jié)果并不理想，所以他們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)也不是很成功。下一步實(shí)驗(yàn)是借用田文嘉小組的回收片段進(jìn)行的。3.4 pET-Trx-的構(gòu)建與檢測(cè)（圖：pET-Trx-的構(gòu)建與檢測(cè)：、號(hào)泳道分別為隨機(jī)挑取的三個(gè)菌落質(zhì)粒提取電泳圖）電泳圖顯示，2、3號(hào)菌中含有目的基因pET-Trx-NK，而1號(hào)菌中質(zhì)粒含量

39、幾乎為零，進(jìn)一步分析得知：3號(hào)菌中的質(zhì)粒含量較高，2號(hào)菌質(zhì)粒含量較低，所以進(jìn)行下一步誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，理論上最好采用3號(hào)菌來(lái)進(jìn)行，但考慮到后來(lái)的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒濃度不能過(guò)高，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，所以我們?cè)谶M(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)時(shí)，就分別對(duì)2、3號(hào)菌進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。 3.5 pET-Trx-的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS檢測(cè)（圖：pET-Trx-的誘導(dǎo)后，在BL21(DE3)中表達(dá)后， 用SDS檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物。1道為低分子量蛋白質(zhì)arker，號(hào)泳道為IPTG轉(zhuǎn)化的pET-Trx-NK轉(zhuǎn)化菌BL21(DE3)菌體提取物電泳圖、號(hào)泳道為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)菌體提取物電泳圖） SDS電泳效果圖顯示，目的基因已經(jīng)成

40、功與pET-Trx連接，并且在轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中后，成功表達(dá)出了蛋白質(zhì)，但是否為納豆激酶，可能還需進(jìn)一步測(cè)算分子量來(lái)確定。4 結(jié)論與討論 NK基因的擴(kuò)增效果比較好，電泳條帶顯示，擴(kuò)增的NK片段長(zhǎng)度大約為837bp，在目的基因NK轉(zhuǎn)入DH5a菌后，通過(guò)提取質(zhì)粒，我們可以得知其轉(zhuǎn)化情況，我們小組采用了傳統(tǒng)的、未改進(jìn)的治理提取方法，從預(yù)期上講，該方法的治理提取效率應(yīng)該相對(duì)較高，但實(shí)際結(jié)果并非如此，電泳結(jié)果顯示，質(zhì)粒的濃度很低，經(jīng)過(guò)分析，我認(rèn)為原因可能有以下幾點(diǎn)：1、所用的菌液濃度太低，由于該實(shí)驗(yàn)并未用分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌的濃度，所以，不確定其濃度。2、在提取質(zhì)粒的過(guò)程中，有幾步要求輕微震蕩

41、混勻，可能在實(shí)際操作過(guò)程中，振蕩過(guò)于劇烈，將DNA片段破碎也是有可能的。在pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切實(shí)驗(yàn)中，效果還是比較好的，酶切產(chǎn)物片段大小符合預(yù)期。 pET-Trx-的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中，我們的菌種來(lái)自其它小組，從電泳圖上可以看出，轉(zhuǎn)化效率還是很高的。 實(shí)驗(yàn)中關(guān)于所有小組將擴(kuò)增的NK片段轉(zhuǎn)入DH5a菌中失敗的原因，分析如下：培養(yǎng)基的配制可能存在問(wèn)題；無(wú)菌操作不規(guī)范，導(dǎo)致培養(yǎng)基被污染；凃菌不規(guī)范，后來(lái)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化率也很低，這說(shuō)明在凃菌的操作上存在問(wèn)題，凃菌不可來(lái)回涂抹，這樣會(huì)損壞感受態(tài)菌的細(xì)胞壁、致其死亡，在實(shí)際操作過(guò)程中，我們沒(méi)有注意到這一點(diǎn)。關(guān)于藍(lán)白斑的篩選問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)中因?yàn)?/p>

42、轉(zhuǎn)化失敗而沒(méi)有操作，但這是本實(shí)驗(yàn)中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，白斑是我們所需要的轉(zhuǎn)化菌，但只憑借這一點(diǎn)還不足以說(shuō)明挑選出來(lái)的白斑就是轉(zhuǎn)化菌，因?yàn)樵谶@個(gè)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化菌很可能有假陰性菌的存在，對(duì)篩選造成干擾，所以，我們應(yīng)該提取質(zhì)粒，通過(guò)電泳條帶來(lái)判斷其是否為轉(zhuǎn)化菌。實(shí)驗(yàn)中存在很多問(wèn)題，例如從凝膠中回收NK片段時(shí)，誤將大樣電泳條帶也置于EB中染色，導(dǎo)致回收工作無(wú)法進(jìn)行，最后不得不借用其它小組的回收片段繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)前未能提前進(jìn)行很好地策劃，導(dǎo)致時(shí)間上的緊張；通過(guò)提取質(zhì)粒的過(guò)程，我認(rèn)為相對(duì)于試劑盒提取質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)方法耗時(shí)而且提取效果極有可能不佳，需要加以改進(jìn)，可適當(dāng)去掉一些重復(fù)步驟。納豆激酶作為一種新型的研究型藥物，很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了研究，有人通過(guò)改進(jìn)PCR擴(kuò)增方法，利用二次PCR來(lái)提高產(chǎn)物量【10】，同時(shí)，納豆激酶在大腸桿菌其他