熒光原位雜交技術(shù)原理及操作步驟

1、熒光原位雜交技術(shù)原理及操作步驟1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合 應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒 光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷 貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得 了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于 繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展 和廣泛應(yīng)用。原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是 一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測(cè) 的染色體或DNA纖維切片上

2、的靶DNA與所用的核酸探針是同源互 補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜 交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素.地高 辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化 學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性.定量或相對(duì) 定位分析。實(shí)驗(yàn)流程FISH樣本的制備一探針的制備一探針標(biāo)記一雜交 一染色體顯帶一熒光顯微鏡檢測(cè)一結(jié)果分析。特點(diǎn)原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非 放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢(shì)在于對(duì)制備樣品的 要求不高，可以通過延長(zhǎng)曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，故較靈敏。缺 點(diǎn)是探針不穩(wěn)定.自顯影時(shí)間長(zhǎng).放射線的散射使得空

3、間分辨率不 高.及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不 足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測(cè)體系，具有以 下優(yōu)點(diǎn)：熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì).安全；探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；實(shí)驗(yàn)周期短.能迅速得到結(jié)果.特異性好.定位準(zhǔn)確；FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探 針相當(dāng)；多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多 種序列；既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可 以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí) 效率明顯下降。應(yīng)用該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，

4、而 且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因 定性.定量.整合.表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢(shì)。熒光原位雜交FISH操作規(guī)程一.主要試劑1變性液20SSC4mlddH2O8ml甲酰胺28ml2PBD液 1000ml20SSC 中加入1.25gTween20二.操作流程1硅化玻片切片烤片60過夜2脫蠟入水斜置切 片空干32SSC洗滌三次每次5min下簡(jiǎn)寫為354 0.2M HCl處理室 溫10接步驟35 0.25mg/ml蛋白酶K處理室溫1530接步驟36切 片入20梯度酒精脫水各2空干7切片入85變性液88迅速入20 梯度酒精脫水各2空干9雜交液85變性50冰浴10滴加至切片加 蓋玻片37過夜10反應(yīng)體系中加入等體積的甲酰胺4510112SSC洗 滌405min2SSC洗滌375min12 PBD洗滌切片3213滴加異硫氫酸熒 光素標(biāo)記的親和素AvidinFITC,塑膜封片3730min14洗滌同步驟 1215 滴加抗