免疫實驗人外周血單核細胞分離課件

1、免疫學實驗課外周血單個核細胞分離實驗內(nèi)容外周血單個核細胞的分離（實驗）淋巴細胞分離及檢測技術(shù)（講解）實驗目的掌握單個核細胞分離及淋轉(zhuǎn)的原理和方法熟悉淋巴細胞的檢測技術(shù)細胞分離純化的目的 測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。 根據(jù)實驗目的不同，采用不同方法，主要需考慮(1)細胞純度；(2)細胞獲得量；(3)細胞活力；Ficoll密度梯度離心法常用來分離外周血單個核細胞（PBMC）的分層液：比重是 1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分層液。紅細胞、粒細胞比重大(1.092)，離心后沉于管底；淋巴細胞和單

2、核細胞的比重小于或等于分層液比重(1.070)，離心后漂浮于分層液的液面上，吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。 比重：1.070比重：1.077 比重：1.092 FicollFicoll密度梯度離心法實驗材料分組：兩人一組器材數(shù)量試劑數(shù)量滴管2支/2人分層液1ml/2人EP管1個/2人血液1ml/2人計數(shù)板1塊/2人PBS1瓶/4人1ml刻度吸管1支/4人計數(shù)液1管/4人加樣器(tip)1把/4人顯微鏡1臺/4人實驗步驟1. 加樣：吸取1ml稀釋的血液沿試管壁緩慢加至分層液頂部； NOTE：不要打破血液與分層液的界面；2. 分離：2,000r/min離心15min，離心后

3、管內(nèi)液體可分為四層，見后圖；3. 回收：將吸管直接插入灰白層，沿管壁輕輕吸出灰白層單個核細胞，放入EP管中，400ml左右即可； NOTE：盡量少吸分層液； 4. 計數(shù)：將EP管中的細胞液上下顛倒混勻，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml細胞計數(shù)液，混勻后取出10ml，加到計數(shù)板內(nèi)，顯微鏡下計數(shù)。示意圖細胞計數(shù)方法查出四個大方格的總細胞數(shù)(X)算出每個大方格的平均細胞數(shù)：Y=X/4每個大方格的體積為V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細胞懸液的細胞濃度（/ml)=Y104稀釋倍數(shù)4顯微鏡下活細胞形態(tài)淋巴細胞分離及檢測技術(shù)巨噬細胞淋巴細胞DC細胞紅細胞淋巴細胞分離

4、及檢測技術(shù)淋巴細胞的分離淋巴細胞的功能測定技術(shù)淋巴細胞分離一、外周血單個核細胞的分離 淋巴細胞分離液密度梯度離心法二、淋巴細胞亞群的分離及鑒定 1. E花環(huán)分離法 2. 尼龍纖維分離法 3. 流式細胞術(shù) 4. 磁珠分離術(shù)E花環(huán)分離法（純化T細胞）T細胞表面的CD2分子綿羊紅細胞受體（E受體）尼龍纖維分離法 B細胞和單核細胞具有易粘附特性，將淋巴細胞懸液加到尼龍纖維上，37作用12小時后，洗脫的為非粘附性T細胞。T細胞尼龍纖維毛柱PBMCB細胞單核細胞流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） FCM將免疫熒光技術(shù)應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細胞體積等）進行多信息分析，是當代生命科學研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項新技術(shù)。流式細胞儀工作原理免疫磁珠分離術(shù)1. 直接法： 抗細胞表面分子抗體+磁性微球 免疫磁珠+細胞懸液 強磁場 與免