瘦肉精在大鼠體內(nèi)代謝

1、關(guān)于瘦肉精在大鼠體內(nèi)的代謝第一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月瘦肉精簡介理化性質(zhì)：通常我們所說的瘦肉精是指克倫特羅(Clenbuterol)，學名為鹽酸克侖特羅，簡稱克侖特羅，又名克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯喘通。為白色結(jié)晶狀粉末，味略苦。結(jié)構(gòu)簡式： 分子式：C12H18Cl2N2O 理化特性：白色或類白色的結(jié)晶粉末，無臭、味苦，熔點161，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。 第二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 當鹽酸克林特羅以超過治療劑量5-10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應(yīng)”促進動物體蛋白質(zhì)沉積、

2、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。 1ug/mL的鹽酸克倫特羅添加于豬飼料中用于促生長，人食用豬肝或豬肺足夠引起中毒。世界沒有任何正規(guī)機構(gòu)批準克倫特羅作為飼料添加劑用于動物促生長。“瘦肉精”包括鹽酸克侖特羅在我國已經(jīng)被禁用。由于美國人不吃畜禽的內(nèi)臟，因此允許使用一定量的瘦肉精。第四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月摘要 本實驗研究了14C標記的克倫特羅在雌雄大鼠體內(nèi)的代謝。喂食每只大鼠200g/kg體重的14C克倫特羅，并在之后8天期間研究其代謝產(chǎn)物和過程。發(fā)現(xiàn)有大約60%的放射性物質(zhì)（14C

3、）從尿液中排出，雄鼠和雌鼠分別有20%和30%的放射性物質(zhì)（14C）從糞便中排出。利用HPLC（高效液相色譜法）檢測放射性物質(zhì)（14C）可以對克倫特羅的代謝產(chǎn)物進行鑒定和定量，發(fā)現(xiàn)尿液中的一些代謝產(chǎn)物是不穩(wěn)定的。大部分尿液和糞便中的克倫特羅代謝產(chǎn)物可以使用各種MS（質(zhì)譜）分析技術(shù)進行分離和鑒定。在大鼠被給藥后，分析方法也可以建立克倫特羅在糞便和組織中代謝產(chǎn)物長達72h的圖譜?？藗愄亓_的主要代謝過程包括：N-脫烷基化（仲胺），N-氧化和硫酸共軛（伯胺）。另外，對不同性別大鼠的克侖特羅代謝產(chǎn)物中N-脫烷基化比率的差異進行觀察。大鼠尿液中檢測到的主要代謝產(chǎn)物是4-N-羥胺，而糞便中的放射性物質(zhì)（14

4、C）大多與氨基磺酸克侖特羅有關(guān)。第五張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗材料和方法1.實驗試劑：克倫特羅和用于標記的分子14 C CL4-氨基-3,5-二氯-（叔丁基氨基甲基）芐基醇。甲酸、乙酸、解旋酶、VI型硫酸、D型葡糖二酸-1,4-內(nèi)酯。2.實驗動物：8只成年大鼠（4只雄性和4只雌性）。第六張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.實驗樣品的采集：大鼠的排泄物的采集：8只成年大鼠被單獨飼養(yǎng)在不銹鋼籠中。允許大鼠自由飲水并且有一個標準的日常飲食。大鼠的平均重量分別為427 21g（雄性）和299 24g（雌性）。一周的環(huán)境適應(yīng)期后，每只大鼠被強制喂食200 g/kg體重的14

5、C標記的克倫特羅。后面的8天，每天把尿液和糞便收集起來備用。最后，大鼠被放血致死。鼠籠要單獨用500ml的甲醇/水（1：1，v / v）清洗干凈，并從中取1ml作為樣品做放射性物質(zhì)測定。取下肝臟，如果不立即使用，這些樣品都要儲存在-20下。第七張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月組織樣品的采集：4只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上文所述的環(huán)境中。分別在喂食克侖特羅后12h，24h，48h和72h通過放血處死大鼠。切除肝，肺和腎并存儲在-20下。鹽酸克倫特羅劑量的影響：3只雄性大鼠（年齡，10周）被安置在如上所述環(huán)境中。分別強制喂食5，20，40 mg/kg體重14C標記的克侖特羅。3

6、天內(nèi)，每天收集3次尿液和糞便并儲存在-20下用于研究。第八張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4.儀器設(shè)備：主要有HPLC（高效液相色譜儀）、放射性物質(zhì)檢測器、吉爾森模型202餾分收集器、UV（紫外）分光光度計、帕卡德液體閃爍計數(shù)器。第九張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.實驗過程：尿液：尿液樣品與甲醇混合（1：2，v/v），攪拌，以10000rpm（4）離心10 min，將沉淀物丟棄，上清液在真空下濃縮并用微孔濾膜（0.5g，0.45m）過濾，最后用HPLC進行分析。糞便：通過初步分析這4只大鼠的糞便來確定大鼠組織中瘦肉精代謝產(chǎn)物的概況，目的是判斷大鼠糞便中是否存在不穩(wěn)定或揮

7、發(fā)性的克侖特羅代謝產(chǎn)物。冷凍干燥前后的這些糞便樣品中的放射性物質(zhì)含量需要通過完全燃燒和液體閃爍計數(shù)器來確定。通過對糞便提取物進行分析，比較新鮮和凍干樣品中克侖特羅代謝產(chǎn)物。第十張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 研究期間將每天收集到的大鼠糞便進行冷凍干燥，然后利用球磨床均質(zhì)化，再對每個樣品中的14C進行測定。將大約0.5g的冷凍干燥樣品與甲醇/ 100mM的乙酸銨混勻2min，pH值3.2（1：6：3，w/v/v），然后在10000rpm下（4）離心10min。將沉淀再用相同的溶劑混合萃取兩次，再與甲醇/ 1mM的氫氧化銨（1：6：3，w/v/v）混均萃取一次。放射性物質(zhì)計數(shù)完成后，將

8、4個上清液合并，用異辛烷去脂，并在N2條件下濃縮。將所得提取物在微濾膜（0.5g，0.45m）下進行過濾，然后利用HPLC進行分析，最后通過燃燒分析來確定離心沉淀中的放射性物質(zhì)殘留。對每只大鼠的2天和3天的糞便以及雌性大鼠4天的糞便分別進行處理并分析，以確定糞便中代謝產(chǎn)物的組成和變化。喂食大鼠較高劑量的克侖特羅并對其糞便進行同樣的分析流程。第十一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月組織：提取約5 g的肝臟組織對肝臟代謝產(chǎn)物進行分析。將樣品切成小片，并使用6ml/g的乙腈/甲醇/ 50mM乙酸銨緩沖液均質(zhì)化，pH 3.2（6：3：1，v/v/v），然后在10000rpm和4離心10min。

9、將上清液立即存儲在-20下，將沉淀物再進行5次萃取，即2次使用同樣的溶劑，1次用乙腈/甲醇/ 50mM的碳酸氫鈉緩沖液在pH 8.35（6：3：1，v/v/v）條件下進行萃取，最后2次用乙腈/甲醇/ 1mM的氫氧化鈉（6：3：1，v/v/v）進行萃取。最后殘留的每個樣品的離心沉淀通過燃燒分析測定放射性物質(zhì)殘留。合并上述6個上清液，用乙腈飽和異辛烷去脂，真空濃縮，并在如上所述的條件下過濾，最后用HPLC分析。肺和腎臟中的代謝產(chǎn)物的檢測是使用相同的提取方法。腎樣品使用前，要用水洗滌兩次再進行提取。第十二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酶解：將粗制尿20l（或2l純化代謝產(chǎn)物加入20l水中

10、）與480l0.1M乙酸鈉緩沖液（pH4.8）和20l的培養(yǎng)液（即2000菲什曼單位B-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶活性的20000羅伊單位）混合，并在42酶解16h。對酶解后的產(chǎn)物進行離心，然后用微濾膜（0.5g，0.45l）過濾，再用放射性-HPLC進行分析。復測定在相同的條件下進行，不同的是加入了10lD-葡糖二酸-1,4-內(nèi)酯來抑制b-葡糖醛酸酶的活性。更具體的是通過對純化后的代謝產(chǎn)物進行測定，來檢測是否有硫化反應(yīng)的發(fā)生。在每個2l代謝產(chǎn)物樣品中加入450l 20mM Tris緩沖液和50ml產(chǎn)氣桿菌、VI型硫酸酯酶在pH為7.1和37的條件下培養(yǎng)16h，然后進行和上文中同樣的分析。第十三張

11、，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月尿液中代謝產(chǎn)物的分離：主要有兩種方法1.使用HPLC結(jié)合餾分收集器進行分離。2.使用C8柱進行分離。第十四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果分析與討論1.大鼠的代謝平衡。每只大鼠被喂食200g/kg 的克倫特羅，并通過8天的研究發(fā)現(xiàn)：雄性大鼠代謝了87.1 2.5的14C，雌性大鼠代謝了90.2 4.2的14C。放射性物質(zhì)(14C）主要通過尿液排出，而通過糞便排出的14C比較少（見表1），雌性大鼠尿液中的14C所占比例更高（P0.05）。與雄性大鼠比較，14C通過雌性大鼠尿液的排泄較慢。并且直到第5天（見圖1），14C在雌性大鼠糞便中的含量還

12、是比較可觀的。 在研究結(jié)束時，雄性大鼠尸體中殘留的放射性物質(zhì)含量相當于克侖特羅3.62 0.36ng/g,而雌性大鼠尸體中放射性物質(zhì)含量只有相當于瘦肉精2.20 0.62ng/g（P0.05）。第二十三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大鼠組織中代謝產(chǎn)物的特征。所有大鼠肝臟提取物的放射性-HPLC分析從本質(zhì)上是相似的。通過觀察，除了克侖特羅以外（在放射性物質(zhì)中，其含量始終在一半以上），具有相同保留時間的兩個代謝產(chǎn)物為M10和M13。在給藥后48h，肝臟代謝產(chǎn)物M10和M13分別占肝臟組織中放射性物質(zhì)的32%和17（見圖5B）。一些肝臟樣品在進行溶劑萃取之前，加入了已知量的3H標記的N-OH-CL。在這些實驗中，整個萃取過程中近100的3H標記的N-OH-CL還原為克侖特羅，而當使用一種快速的制備方法時，只有80%的N-OH-CL被還原。只對前兩只大鼠的腎臟和肺提取物進行分析，相應(yīng)的放射性-HPLC分析結(jié)果見圖5C和5D。大多數(shù)在腎臟中的放射性物質(zhì)是未代謝克侖特羅（約70）和另一種與M11類似的化合物。在肺提取物中同樣只觀察到了克倫特羅和另一種