免疫細胞培養(yǎng)流程20180528

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2、wiO；n*:免疫細胞生產(chǎn)流程匚i:KiI細胞生產(chǎn)流程細胞生產(chǎn)流程符合GMP規(guī)渝A級細胞生產(chǎn)線1細胞采集2細胞分離3細胞培養(yǎng)4細胞質檢5細胞收獲除細胞采集外，所有操作均在符合GMP標準的潔凈環(huán)境下操作。1細胞采集機米（單米）血細胞分離機采集PBMC達到109數(shù)量級，細胞數(shù)量多，培養(yǎng)周期短。對患者（顧客）身體要求高。手米采集患者外周血50-200ml,PBMC達到10*數(shù)量級，細胞數(shù)量較少，培養(yǎng)周期略長。2細胞分離PBMCPBMCB|Jperipheralbloodmononuclearcell,外周血單個核細胞。外周血各種血細胞的密度不冋，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一

3、定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞分離。血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.0921.0751.0901.030-1.035Ficoll：1.0770.0012細胞分離血液收集生物安全柜紫外照射30min,開機運行至少5min；銀子夾取酒精棉球；酒精棉球擦拭手術剪及止血鉗“頭部”，單向擦拭;夾取新的酒精棉球擦拭rfn袋管路;止血鉗夾住血袋管路，手術剪剪掉血袋管路前段，利用重力，使血液通過管路收集至離心管中。2細胞分離密度梯度離心新鮮抗凝血與生理鹽水1:1混勻后，小心滴加丁淋巴細胞分離液之液面上。離心機升速降速都設置為低檔。離心。2細胞分離密度梯度離心稀釋的血漿、血小板PBMCF

4、icollFicoll紅細胞粒細胞細胞收集：吸取白膜層，離心洗滌。細胞培養(yǎng)基（1640）或其他緩沖溶液洗滌兩次收集PBMCo2細胞分離注意事項血液、分離液及環(huán)境溫度在2025C之間,分離效果較好；抗凝血稀釋時要去除抗凝劑體積；吸取PBMC時不可避免會吸取部分分離液,要足夠稀釋，才可以把PBMC離心下來；離心時，升降加速度要調到足夠低檔；嚴格無菌操作。3細胞培養(yǎng)一,PBMC收集約bd06/ml外周血（因人而異）；計數(shù)；根據(jù)計數(shù)結果，收集到的PBMC,用初始培養(yǎng)基重懸，按l3xl06/rrd的密度接種于初始瞬容器（瞬wm#袋）;置于5%COz、37C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期顯微鏡觀察細胞，計數(shù)

5、，依據(jù)細胞生長狀況補加擴增培養(yǎng)基。初始培養(yǎng)基及擴增培養(yǎng)基或者相關細胞因子添加依據(jù)培養(yǎng)目的配制或添加。3細胞培養(yǎng)一,PBMC收集約bd06/ml外周血（因人而異）；計數(shù)；根據(jù)計數(shù)結果，收集到的PBMC,用初始培養(yǎng)基重懸，按l3xl06/rrd的密度接種于初始瞬容器（瞬wm#袋）;置于5%COz、37C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期顯微鏡觀察細胞，計數(shù)，依據(jù)細胞生長狀況補加擴增培養(yǎng)基。初始培養(yǎng)基及擴增培養(yǎng)基或者相關細胞因子添加依據(jù)培養(yǎng)目的配制或添加。3細胞培養(yǎng)培養(yǎng)過程中,顯微鏡觀察:細胞甘流程細胞生產(chǎn)流程4細胞質檢細胞收獲前48小時取樣檢測。計數(shù)、細胞活率檢測；內毒素檢測；細菌、真菌檢驗；支原體檢測；流式表型檢測；細胞殺傷檢測。根據(jù)不同的培養(yǎng)目標制定相關的質檢合格標準。5細胞收獲收集細胞培養(yǎng)液;移入250