細(xì)胞工程在環(huán)境治理中的應(yīng)用

1、細(xì)胞工程在環(huán)境治理方面的應(yīng)用摘要：細(xì)胞工程與基因工程一起代表著生物技術(shù)最新的發(fā)展前沿，伴隨著試管植 物、試管動物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問世，細(xì)胞工程在生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī) 藥、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。本文簡要介紹了細(xì)胞工程 的基本概念及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用狀況，并對其應(yīng)用前景提出展望。關(guān)健詞：細(xì)胞工程，細(xì)胞融合技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞固定化，環(huán)境治理一、細(xì)胞工程概論細(xì)胞工程即是在細(xì)胞水平上應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的理論和 技術(shù)，按照人們的要求，有計(jì)劃地大規(guī)模培養(yǎng)組織和細(xì)胞以獲得生物極其制品，或 以改變細(xì)胞的遺傳組織或以生產(chǎn)新的品種的工程。圍繞著生命活動這一中心，基 因工

2、程研究的是分子水平上DNA的復(fù)制和遺傳信息的表達(dá)、蛋白質(zhì)的合成等;細(xì) 胞水平上的細(xì)胞工程研究的是細(xì)胞的增殖、分化、死亡;而個體水平上的研究則 是遺傳和發(fā)育。與基因工程相比，除被轉(zhuǎn)移物質(zhì)和轉(zhuǎn)移方法不同外,在帶有遺傳信 息的物質(zhì)的選擇、馴化、鑒定等方面二者基本相同；而細(xì)胞工程所要求的技術(shù)條 件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及經(jīng)費(fèi)等均比基因工程要求低一些,尤其是在人們對基因工程的 安全性尚未給出確定的回答之前,細(xì)胞工程的價值格外受到重視。細(xì)胞工程的主 要技術(shù)和應(yīng)用川包括組織和細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞的融合技術(shù)，細(xì)胞器移植技術(shù), 體外受精技術(shù)，物理、化學(xué)技術(shù)等。目前在環(huán)境治理中應(yīng)用較多的是細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)，細(xì)胞的融合技術(shù)及物

3、理、化學(xué)技術(shù)。（一）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括微生物的培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)以及動物的組織與細(xì)胞培 養(yǎng)。微生物的培養(yǎng)主要是指微生物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的研究以及培養(yǎng)方法的研究，其目的 是提供用于研究或生產(chǎn)的微生物菌種。植物細(xì)胞培養(yǎng)包括植物器官、組織、細(xì)胞、 原生質(zhì)體、胚和植株的培養(yǎng)。它是在植物組織技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是指在離 體條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法。與天然植物栽培相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)因具有如下 特點(diǎn)可能會成為能夠解決有用代謝物長期供應(yīng)問題的非常有希望的手段。：（二）細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合（cellfusion），是指兩個或多個細(xì)胞融合成一個雙核或多核細(xì)胞， 使一個細(xì)胞的遺傳物質(zhì)包括細(xì)胞核DNA和核外基因都

4、進(jìn)人另一個細(xì)胞。它是繼轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合之后一種更有效轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的手段。細(xì)胞融合技術(shù)能克服遺傳 障礙，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源雜交，構(gòu)建集雙親優(yōu)良遺傳性狀于一體的融合子，創(chuàng)造有應(yīng)用前 景的生物s。其整個過程包括:遺傳標(biāo)記篩選、原生質(zhì)體的制備、融合與再生、 融合子的鑒定。遺傳標(biāo)記的篩選融合子的篩選是融合過程中的關(guān)鍵。目前采用的親本遺傳標(biāo)記和篩選主要有 下列幾種方法。其一為營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，即融合的雙親為營養(yǎng)缺陷型且為不同的 缺陷型(單缺或雙缺)，雙親缺陷的原生質(zhì)體融合后于基本培養(yǎng)基上選擇融合子。 只有營養(yǎng)缺陷得到互補(bǔ)后的融合子才能恢復(fù)生長，親本不能在基本培養(yǎng)基上生 長。其二為抗藥性標(biāo)記，即利用菌種對藥物的抗性存

5、在差異。其三是利用熒光色 素標(biāo)記，在熒光顯微鏡下用顯微操作挑出具有雙親兩種熒光色素單細(xì)胞即為融合 子。其四為失活原生質(zhì)體供體法。其余尚有溫度敏感型、糖發(fā)酵和同化性能、呼 吸缺陷和形態(tài)等親本標(biāo)記選擇方法。在實(shí)際應(yīng)用中也有將上述某些方法結(jié)合起來 使用，如營養(yǎng)缺陷型與抗藥性、抗藥性與滅活等。原生質(zhì)體制備與再生根據(jù)細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)與組成，菌體的處理方法不同。在制備細(xì)菌、放線菌 的原生質(zhì)體時，主要使用溶菌酶，其中革蘭氏陽性菌(G)用溶菌酶處理，革蘭 氏陰性菌(G)用溶菌酶加乙二胺四乙酸鈉(EDTA)處理。對于酵母、霉菌、大型 真菌、植物，由于其細(xì)胞壁組成更為復(fù)雜，常用纖維素酶、蝸牛酶、幾丁質(zhì)酶等 復(fù)合酶

6、處理。原生質(zhì)體的制備過程中受影響的因素主要有培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方法、 菌齡、酶濃度、酶處理溫度與時間、pH值、滲透壓穩(wěn)定劑等。制備的原生質(zhì)體 已經(jīng)失去細(xì)胞壁，僅有一層厚約lOnm的細(xì)胞膜，它具有生物活性，但不是正常 的細(xì)胞，在普通培養(yǎng)基上不能生長，必須涂布于再生培養(yǎng)基上，使之再生為正常 的細(xì)胞。再生培養(yǎng)基需補(bǔ)加兩類物質(zhì):一類是蛋白質(zhì)、糖類或氨基酸等營養(yǎng)因子； 另一類是滲透壓穩(wěn)定劑，如蔗糖(或甘露醇)、T二酸鈉、KC1, Mgz 等。原生質(zhì)體融合1974年，匈牙利的Ferenczyb采用離心力誘導(dǎo)的方法報道了白地霉 (Geotrichumcandidum )的營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體的融合。隨后

7、人們相繼 用NaCI , KCl和Ca ( N03 )等作為誘變劑進(jìn)行融合，但融合頻率都很低。同 年Ka。發(fā)現(xiàn)PEG在適量Cap 存在下能有效地誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合，從而使這 一技術(shù)躍上了新的階段，大大提高了融合頻率。PEG多采用分子量4000和6000 兩種，Hopwood 研究認(rèn)為這兩者融合的效果差別不大。融合率還受PEG和陽 離子的濃度、誘導(dǎo)融合時間、pH值等因素的影響。林紅雨等a采用在融合液 中添加新生磷酸鈣的方法可以促進(jìn)原生質(zhì)體融合。在融合方法上，除了化學(xué)因子 誘導(dǎo)融合外，電場誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新技術(shù)，進(jìn)一步提高了融合頻率。融合子的鑒定在再生培養(yǎng)基上再生出的標(biāo)記得到互補(bǔ)的菌落，

8、我們可以初步判定它是融合 子。由于這樣檢出的融合子中，還有部分雜合子、部分二倍體、異核體的存在， 所以要對檢出的融合子做進(jìn)一步的鑒定。鑒定工作一般從形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)、 生物量、遺傳學(xué)(基因型、DNA含量、GC比值)和同工酶等幾個方面進(jìn)行。近年來， 也有人通過DNA限制性內(nèi)切酶酶切片段的比較、核甘酸序列分析、分子雜交RAPD 技術(shù)等分子生物學(xué)方法來鑒定融合子。到目前為止，雖然關(guān)于融合子中雙親株遺 傳物質(zhì)重組的分子機(jī)制還不很明確，但有些問題人們已形成共識 :原生質(zhì)體 融合后的細(xì)胞處于暫時的二倍體（或多倍體）狀態(tài)，之后有兩種可能:一是染色體 DNA不發(fā)生重組，兩種細(xì)胞的染色體共存于1個細(xì)胞內(nèi)，形

9、成異核體，這是不穩(wěn) 定的融合子;另一類是兩親株的整套基因組（包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)）相互接觸，染 色體DNA發(fā)生多位點(diǎn)交換產(chǎn)生真正的同源重組，從而產(chǎn)生各種各樣的基因組合， 獲得多種類型的重組子，通過連續(xù)傳代分離純化可以將這兩類融合區(qū)分開。另外， 融合后染色體的重組是隨機(jī)的種屬間細(xì)胞對異源DNA的限制作用及染色體DNA 的非同源性，仍是融合的一大障礙。（三）固定化細(xì)胞技術(shù)固定化細(xì)胞技術(shù)（簡稱IMC ），也叫固定化微生物技術(shù)，是指通過化學(xué)或物 理手段，將篩選分離出的適宜于降解特定廢水的高效菌株，或通過基因工程技術(shù) 克隆的特異性菌株進(jìn)行固定化，使其保持活性并反復(fù)利用！ “ 一川。固定化細(xì)胞 有細(xì)胞密度高

10、、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物分離容易、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用低、維護(hù) 管理簡單和剩余污泥少等優(yōu)點(diǎn)，因此，固定化細(xì)胞技術(shù)已越來越受到人們的重視。按照固定載體與作用方式不同，固定化細(xì)胞的制備方法可分為3種類型:吸 附法、包埋法和交聯(lián)法。吸附法（載體結(jié)合法）通過物理吸附、化學(xué)或離子結(jié)合的方法，將細(xì)胞固定在 非水溶性載體上。該方法操作簡單，細(xì)胞活性損失小，載體可反復(fù)使用，但所能固定的細(xì)胞 數(shù)量有限，細(xì)胞和載體結(jié)合不牢，易脫落。廢水處理中的生物膜法是其代表性例 子。包埋法是使細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)人多孔性載體內(nèi)部或?qū)⒓?xì)胞包裹在凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中 或半透性聚合薄膜內(nèi)，小分子的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散，而細(xì)胞卻不會擴(kuò)散到 周圍介質(zhì)中去

11、。該法操作簡單，對細(xì)胞活性影響小，制作的固定化細(xì)胞球強(qiáng)度高， 是目前研究最廣泛的固定化方法，但包埋材料會一定程度阻礙底物和氧擴(kuò)散，并 對大分子底物不適用。交聯(lián)法（架橋法）是不用載體的，它利用兩個以上功能團(tuán)試劑，直接與細(xì)胞表 面的反應(yīng)基團(tuán)如氨基輕基等進(jìn)行交聯(lián)，形成共價鍵來固定細(xì)胞。此法化學(xué)反應(yīng)條件劇烈，對 細(xì)胞活性影響大，實(shí)際常與其他方法結(jié)合。聚集一交聯(lián)固定法是使用凝聚劑將菌 體細(xì)胞形成細(xì)胞聚集體，再利用雙功能或多功能交聯(lián)劑與細(xì)胞表面的活性基團(tuán)發(fā) 生反應(yīng)，使細(xì)胞彼此交聯(lián)形成穩(wěn)定的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這樣，高效菌體不易流失， 生物濃度高，而提高了處理效果iz0二、細(xì)胞工程在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用(一)植物細(xì)胞

12、培養(yǎng)用于可降解塑料的生產(chǎn)利用植物本身作為生物反應(yīng)器進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，發(fā)揮植物的生物合 成能力，為人類生產(chǎn)出人類所需的原料，業(yè)已成為一頗具前途的新領(lǐng)域，現(xiàn)在已 經(jīng)有多種物質(zhì)可以用培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行生產(chǎn)，例如利用植物可以進(jìn)行可生物降 解塑料的生產(chǎn)。聚經(jīng)基烷醋(PHA)是一種可以用來制備可生物降解塑料的單體原 料。以乙酞一 CoA為前提合成的，現(xiàn)在主要用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。自從1992年美國科學(xué)家首次進(jìn)行了植物生產(chǎn)PHB的嘗試 ”后，Somerville、小組于1994年改進(jìn)了策略，將PHB定位于質(zhì)體ya.u;。英國Zenica 公司將phbA, phbB, phbC基因?qū)肆擞筒?，利用Ru

13、bisco小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)膚將三個 基因定位于葉綠體中表達(dá)，提高了產(chǎn)量。美國Monsanto公司的科研人員正在同 時進(jìn)行轉(zhuǎn)基因油菜和大豆生產(chǎn)PHB的研究。德國Trethewey利用，今鈴薯在塊莖 的胞質(zhì)和線粒體中合成PHB6 o Padgett。等to 1在研究轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)PHB 的同時將植物生產(chǎn)共聚物PHBV也擺上了日程。利用環(huán)基因植物進(jìn)行PHA的生產(chǎn) 可以極大地降低成本，從而有利于推廣可生物降解塑料的生產(chǎn)和使用。(導(dǎo))細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建環(huán)境治理工程菌1纖維素降解菌原生質(zhì)體融合和沼澤紅假單抱菌在PEC催化下得到光合細(xì)菌 種間融合子19J。其融合子對降解底物中COD的能力優(yōu)于任一親本菌株，表現(xiàn)出 高

14、效降解、利用有機(jī)污染物的優(yōu)勢。隨后對光合細(xì)菌球形紅假單胞菌 P9479 (NtrSms)與釀酒酵母Y9407 (NtsSms)的融合細(xì)胞Fo。和Fzl的性能研究zap表 明:兩融合子耐酸性能與釀酒酵母相似;Foa耐熱性近與釀酒酵母，F(xiàn)zl的耐熱性 近與球形紅假單胞菌.在B. Braun反應(yīng)器中，融合子Fzl的觀測產(chǎn)率系數(shù)Yobs 和菌體產(chǎn)量X高于球形紅假單胞菌;對廢水中污染物BOD，的去除率E和容積負(fù) 荷U在底物濃度BOD，為4b00m歲L時均優(yōu)于雙親;融合子Fzl的生物負(fù)荷Ub 和菌體比降解率9高于釀酒酵母，絮凝效率P優(yōu)于任一親株。融合子在多方面綜 合了雙親菌株優(yōu)勢，可見將原生質(zhì)體融合技術(shù)引

15、人廢水資源化處理的應(yīng)用領(lǐng)域具 有良好前景。4.利用細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建抗污染型植物工業(yè)革命以來，人類活動特別是工業(yè)活動造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。當(dāng)生物群 落受污染物脅迫時，不同物種的適應(yīng)性反應(yīng)不可能完全相同，某些物種因無抗性 基因而被淘汰。有研究表明由于大氣高濃度SO,的影響，美國俄亥俄州北部白 松群體至少有40%的種質(zhì)已丟失 ” 一。熏蒸實(shí)驗(yàn)和野外調(diào)查表明，在顫楊 (Populustremuloides)和紅械(Acerrubrum)中也有類似的情況！污染脅迫的最顯著效應(yīng)是消除敏感物種或個體，改變生物群落的物種構(gòu)成。 研究表明，污染脅迫導(dǎo)致植物居群進(jìn)化。礦山和冶煉廠污染區(qū)出現(xiàn)抗重金屬生態(tài) 型 “。農(nóng)

16、業(yè)雜草中發(fā)現(xiàn)抗除草劑進(jìn)化 ”?？箽怏w污染物進(jìn)化也有若干報道!w1。 在研究過的實(shí)例中，除少數(shù)例外，抗污染性均表現(xiàn)為可遺傳性狀，而目前關(guān)于抗 污染特性的遺傳基礎(chǔ)仍然研究得不充分!” ，所以我們可以利用細(xì)胞融合技術(shù)的 優(yōu)勢，將抗污染性植人其他植物體內(nèi)以保證該物種對環(huán)境污染良好的適應(yīng)性。美 國紐約州厄普頓Brookhaven國家實(shí)驗(yàn)室的微生物學(xué)家Daniel van der Lelie 和比利時林堡大學(xué)中心的環(huán)境生物學(xué)家aco Vangronsveld領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā) 現(xiàn)，向植物中注射一種細(xì)菌的菌株能夠使植物降低甲苯致病的能力。于是研究人 員采集了一種通常存在于黃羽扁豆內(nèi)部的細(xì)菌，這些無害的細(xì)菌多位

17、于細(xì)胞的表 面，并且將它們與那些具有降解甲苯能力的細(xì)菌進(jìn)行原生質(zhì)融合，結(jié)果本地的黃 羽扁豆在與細(xì)菌之間的基因交換過程中獲得了能夠降解甲苯的基因。這種新加載 的細(xì)菌使得黃羽扁豆能夠在受過污染的土壤中茁壯生長，而此前那些未經(jīng)過改良 的普通黃羽扁豆卻無法生存。三、細(xì)胞工程在環(huán)境治理中的應(yīng)用前景細(xì)胞工程技術(shù)是發(fā)展迅速的一項(xiàng)污染環(huán)境治理技術(shù)。實(shí)踐證明，采用細(xì)胞工 程技術(shù)治理污染環(huán)境，可以最大限度地去除環(huán)境中的污染物。是保障可持續(xù)發(fā)展 的一項(xiàng)最有力的措施。隨著細(xì)胞工程菌的出現(xiàn),細(xì)胞工程技術(shù)將不斷應(yīng)用于更多 的污染環(huán)境的治理工程中。培養(yǎng)出新的特效物種并進(jìn)一步提高其應(yīng)用效率、降低 應(yīng)用成本；運(yùn)用各種相關(guān)技術(shù)加

18、以優(yōu)化組合，尤其是高效、低能耗易普及的特種 微生物與特殊工藝的最佳結(jié)合；加強(qiáng)不同專業(yè)、不同學(xué)科之間的合作，如將毒理 學(xué)和微生物學(xué)和環(huán)境工程學(xué)相結(jié)合；從根本上消除污染源充分協(xié)調(diào)人與自然之 間的關(guān)系，充分實(shí)現(xiàn)廢物資源化。參考文獻(xiàn)Zhong.PIantCells.AdvancesinBiochemicalEneering/BiotechnoiogyM.Heidelberg; Springer 一、er1aK, 2001，72:1 一 26.林紅雨，陳策實(shí)，尹光琳.歐文氏菌和棒桿菌的屬間融合研究.微生物學(xué)通報， 1999, 26 (1); 3 一 6.馮玉杰.現(xiàn)代生物技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004. 3.孫劍秋，周冬坡.微生物原生質(zhì)體融合J.生物學(xué)通報，2002 , 37 ( 7 ):9 一 11.陳銘，周曉云