細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用

1、細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞 免疫），細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（cell mediated immune response, CMI）也是人們所關(guān)注 的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附 法（ELISA）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體K 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi) 的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立 了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) （ELISPOT

2、）。作為一項(xiàng)新型的免疫酶技每聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT），是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞ASC）或分泌細(xì)胞 因子（CK）細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性， 易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分溉K細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè) 定中，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的 發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：（1）ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)

3、曲線比較得出可溶 性蛋白總量。（2）ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯 現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn) 進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研 究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬 -30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素 單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。下面將從發(fā)展、原理、具體實(shí)驗(yàn)操作、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用

4、幾方面進(jìn)行介紹。ELISPOT技術(shù)的發(fā)展（1）ELISPOT技術(shù)的過去ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky等人率先在1983年， 運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時(shí)起世界各國免疫學(xué) 者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競(jìng)賽，每個(gè)團(tuán)隊(duì)都希望能率先將此一技術(shù)推 廣來研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵迥細(xì)胞分 泌的各類細(xì)胞因子，來定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大 小，同時(shí)預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡(jiǎn)單，

5、但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng) 用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn) 生的第一個(gè)主要問題，便是靈敏度的提升，因?yàn)門細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn) 量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì) 等幾個(gè)技術(shù)性的問題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不 夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué) Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn) PVDF薄膜的應(yīng)用(Forsthuber et al., Science, 1996)，才釜 底抽薪地解決了

6、該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相 比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因 子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高 ELISPOT Cytokine分析的敏感度。第二個(gè)技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個(gè)基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí) 證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基 礎(chǔ)但很重要的問題，諸如；實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定1細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級(jí)效 應(yīng)？斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？能否相信斑點(diǎn)是由單一

7、的細(xì)胞造成？ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍？如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙？及到什么程度？ELISPOT技術(shù)的現(xiàn)在1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT分析技術(shù)已經(jīng)逐 漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特茴細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。藉 由檢驗(yàn)新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT分析技術(shù)可提示T細(xì)胞 免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要參數(shù)：抗原特定！細(xì)胞的clone族群大??；和免疫效應(yīng)細(xì)胞的信 號(hào)傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。多年來經(jīng)過數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于ELISPOT分析技術(shù)本身的

8、幾個(gè)問 題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平 上識(shí)別抗原特定T細(xì)胞，主要針對(duì)經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)下，ELISPOT Cytokine斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑 點(diǎn)形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也 因?yàn)槿绱?，ELISPOT是個(gè)免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理 條件下，觀察細(xì)胞實(shí)際分泌Cytokine的進(jìn)程，進(jìn)而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào) 節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細(xì)胞免疫一般可通過兩

9、程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每 Precursor T細(xì)胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。ELISPOT分析技術(shù)的幾個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特茴細(xì)胞免疫學(xué)上獨(dú)占鰲頭。此 技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬分之一 1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì) 胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者 Dimer/ tetramer 染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,0000這樣的高靈敏度對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)研究 是必須的，因?yàn)榭乖囟═細(xì)胞一般在機(jī)體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻

10、率通常低于萬中取 一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后 PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r(jià)，沒有喪失功能。這一點(diǎn)對(duì)臨床試驗(yàn)非常重要，它 使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗(yàn)牽涉全國多個(gè)臨床試 驗(yàn)機(jī)構(gòu)，病人血樣可冰存并同時(shí)集中在中央實(shí)驗(yàn)室一齊被測(cè)試。同理，一個(gè)血樣 或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利 LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化ELISPOT未來展望ELISPOT分析技術(shù)正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接 洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，

11、就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng) 由這個(gè)技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進(jìn)入一個(gè)器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到 全新的智識(shí)。從各國文獻(xiàn)可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地 應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時(shí)的反應(yīng)Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)腫瘤(Nagorsen, 2000)或自體免疫病人體內(nèi)的一個(gè)特定 的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。E

12、LISPOT技術(shù)同時(shí)也在數(shù)個(gè)疫苗效價(jià)評(píng)估人體試驗(yàn) 中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合 作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測(cè)HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃將是首次利 用ELISPOT技術(shù)對(duì)亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗(yàn)的有關(guān)研究。我們期待未來 此一技術(shù)能在我國免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。原理ELISPOT就其原理來說實(shí)在是很簡(jiǎn)單的，從本質(zhì)上說和ELISA的原理是一樣 的，理解起來并不難。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆 抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性 磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BC

13、IP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)紫色”的斑點(diǎn)表 明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。 傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過酶的高催化頻率，放大反 應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。ELISPOT全名為 Enzyme-linked Immunospot Assay,其技術(shù)原理與ELISA相 似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒 性（不含sodium azide內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分 離處理后，會(huì)被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳?/p>

14、，并將微孔盤放置于溫箱中 過夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶致細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開始分泌細(xì)胞 激素，此時(shí)局部（在緊靠分泌細(xì)胞的周圍）分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被PVDF薄膜上特異抗體 捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素 （Biotin）標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加 入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下染色斑點(diǎn)。反應(yīng)步驟可大致分為：（1）利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)；（2）加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞 因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)

15、合；（3）洗掉細(xì)胞；（4）加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過底物的顯色反應(yīng)，一個(gè) 細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn)，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)（reader）就可以計(jì) 算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。以上是檢測(cè)分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測(cè)分泌特異抗體的細(xì)胞只需 把包被特異抗體變?yōu)榘惶禺惪乖纯?。目前，ELISPOT已被用于檢測(cè)藥物、化學(xué)制劑及其它復(fù)合物的特性及功能等方面 因此為體內(nèi)免疫功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)提供了檢測(cè)依據(jù)。近幾年來ELISPOT技術(shù)在腫瘤疫苗 評(píng)價(jià)試驗(yàn)、免疫監(jiān)測(cè)及免疫學(xué)研究中越來越被廣泛地使用。在抗腫瘤免疫及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用在許多研究電該技術(shù)已被用于免疫動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞中抗原特

16、異的細(xì)胞毒T寄細(xì) 胞(CTL)的數(shù)量檢測(cè)。近期ELISPOT技術(shù)已用于分析和評(píng)價(jià)從傳染病病人的PBMC中 檢測(cè)肽特異的T淋巴細(xì)胞以及在癌癥病人中誘導(dǎo)腫瘤特異KT細(xì)胞的疫苗試驗(yàn)。ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)敏感性、特異性和可重復(fù)性都很高操作簡(jiǎn)單迅速需要 少量標(biāo)本，在檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)也反應(yīng)其功能并與臨床結(jié)果相關(guān)。 ELISPOT平板可以提前大量準(zhǔn)備移液、洗板和讀板都可自動(dòng)化因而大批量檢查也可做 到快速高效。在與與其他方法的比較后ELISPOT很可能成為定量分析腫瘤或病毒特異 性的T細(xì)胞反應(yīng)的首選。在抗感染免疫中的應(yīng)用CTL在抗病毒感染的免疫應(yīng)答中占有主要地位而CD4+輔助性T細(xì)胞亞群

17、Th1/Th2 的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重要的作用。在HIV研究方面由MHC-1類分子加 工的不同抗原經(jīng)CTL識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答在控制HIV-1感染中同樣起重要作用。利用 ELISPOT方法檢測(cè)CK如IFN2赫可以進(jìn)一步了解到針對(duì)HIV特異的CTL應(yīng)答及相關(guān) 免疫信息。此外,ELISPOT法還用于評(píng)價(jià)由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及 HIVgp 120g與霍亂毒素共表達(dá)的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中ELISPOT還用 來檢測(cè)通過直腸免疫低劑量甲肝疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性的自限性肝炎中 以Th1為主的應(yīng)答促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發(fā)

18、展方面 有重要作用。在許多抗細(xì)菌免疫研究由該方法也發(fā)揮了重要作用。例如：應(yīng)用ELISPOT試驗(yàn)證 實(shí)表達(dá)大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗(rBCG.MalE)誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞 依賴的,rBCG.MalE誘導(dǎo)的特異CD4+T細(xì)胞應(yīng)答存在Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)換現(xiàn)象并逐步形 成Th1/ Th2混合應(yīng)答。細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用目前，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)的領(lǐng)域是對(duì)肺結(jié)核(TB)的檢測(cè)。而最近的研究熱點(diǎn)就是 對(duì)于移植的預(yù)測(cè)。受體對(duì)供體特異性HLA抗體一直以來都是器官移植的一大障礙因?yàn)?它們的存在不僅介導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)而且還可導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)。因此HLA抗體的存 在限制了異體抗原敏感患者對(duì)供體器官的需要因而增加了等待移植的時(shí)間。在心月翩干 臟和腎臟異體移植后早期出現(xiàn)的并發(fā)癥如急性排斥反應(yīng)與移植前存在的異體免疫臨床 相關(guān)性迫切需要一種恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法在器官移植前能了解受體對(duì)供體特異性體液免疫 的功能狀態(tài)。在接受移植的人群中，部分因有多次輸血、或既往有異體移植失敗或多次妊娠史體 內(nèi)曾經(jīng)存在陽性異體抗體在他們接受異體移植時(shí)現(xiàn)有的檢測(cè)方法只能顯示他們對(duì)異體 的免疫功能正常。但他們體內(nèi)存在記憶B淋巴細(xì)胞一旦受到相應(yīng)HLA抗原的刺激則會(huì) 喚起免疫反應(yīng)這不僅影響著移植的結(jié)果甚至?xí)霈F(xiàn)危及患者生命的、與移植相關(guān)的并 發(fā)癥。ELISPOT是一種強(qiáng)有效的檢測(cè)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞的方法具有很高的敏感性。因