原代培養(yǎng)細(xì)胞課件

1、動(dòng)物的克隆“動(dòng)物的細(xì)胞和組織培養(yǎng)” 是動(dòng)物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”也是細(xì)胞生物學(xué)的主要技術(shù)基礎(chǔ)。將動(dòng)物體內(nèi)的一部分組織取出分散成單個(gè)細(xì)胞人工控制的培養(yǎng)條件下細(xì)胞得以生存并保持生命活動(dòng)現(xiàn)象生長(zhǎng)、分裂乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡性能等機(jī)械消化、胰酶消化（一）定義： P28一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)原理：細(xì)胞增殖無(wú)菌、無(wú)毒 （消毒、滅菌 ；可添加抗生素；定期更換培養(yǎng)液，清除代謝廢物 ）營(yíng)養(yǎng)： （液體培養(yǎng)基：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等） 溫度和pH ：（36.50.5，pH7.27.4 弱堿性）氣體環(huán)境：O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）（二）操作流程及過(guò)程解讀： 離體的動(dòng)物細(xì)胞

2、如何才能保證其正常的生命活動(dòng)？需要哪些條件？ 1、培養(yǎng)條件：CO2培養(yǎng)箱,維持培養(yǎng)的PH值可以補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)動(dòng)物體內(nèi)一部分組織分散成單個(gè)細(xì)胞 機(jī)械消化 或 胰蛋白酶酶解原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液細(xì)胞株或細(xì)胞系動(dòng)物培養(yǎng)液細(xì)胞形成生長(zhǎng)暈并增大取樣剪碎分裝含有葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等。2、過(guò)程：（P29圖）應(yīng)選擇幼齡動(dòng)物組織或胚胎使細(xì)胞與外界充分接觸；與外界物質(zhì)交換更迅速高效；？取動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物器官和組織因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)機(jī)械消化：剪碎組織胰蛋白酶酶解消化分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液2、過(guò)程：（P29圖）消化分解動(dòng)物組織間的膠原蛋白和

3、其他成分，獲取單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)分瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng) 貼滿瓶壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理使其從瓶壁上脫落下來(lái)，分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液？特點(diǎn)：貼壁生長(zhǎng)、接觸抑制接觸抑制細(xì)胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白,也叫做糖被,他在細(xì)胞上起識(shí)別作用。當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的時(shí)候,糖蛋白識(shí)別了這種信息,就會(huì)使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖,這種現(xiàn)象就叫做接觸抑制。細(xì)胞系、細(xì)胞株原代培養(yǎng)細(xì)胞系（可傳代）原代培養(yǎng)物在首次傳代時(shí)就成為細(xì)胞系 連續(xù)細(xì)胞系 有限細(xì)胞系可連續(xù)傳代傳代培養(yǎng) 細(xì)胞株（具特殊性質(zhì)）連續(xù)細(xì)胞株有限細(xì)胞株挑選細(xì)胞系：泛指可以傳代的細(xì)胞；細(xì)胞株：具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞系不可連續(xù)傳代原代

4、培養(yǎng)：即直接從體內(nèi)取出細(xì)胞、組織和器官立即進(jìn)行培養(yǎng)；沒(méi)有分瓶培養(yǎng)之前的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)細(xì)胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中（分瓶），使其繼續(xù)生長(zhǎng)、增殖。即稱為傳代培養(yǎng)。強(qiáng)調(diào)幾個(gè)概念：細(xì)胞系:（2）連續(xù)細(xì)胞系:（1）有限細(xì)胞系：連續(xù)細(xì)胞株：連續(xù)多次有限細(xì)胞株：次數(shù)有限細(xì)胞株:泛指可傳代的細(xì)胞不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系、認(rèn)為其發(fā)生了轉(zhuǎn)化：遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變 大多數(shù)具有異倍體核型；有的是惡性細(xì)胞系，具有異體致瘤性，不保留接觸抑制，有的獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌）例：二倍體細(xì)胞通過(guò)一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞具有恒定的染色體

5、組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性。強(qiáng)調(diào)幾個(gè)概念：（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾 素、單克隆抗體等。（3）用于檢測(cè)有毒物質(zhì)。（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)有毒物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：？如何獲得純系的細(xì)胞系？ “克隆培養(yǎng)法”或“細(xì)胞克隆 ” 把一個(gè)單細(xì)胞從群體中分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的技術(shù)。 概念：產(chǎn)物具備怎樣的特點(diǎn)？遺傳性狀均一、表現(xiàn)的性狀相似，稱為純系？一個(gè)細(xì)胞克隆培養(yǎng)法（細(xì)胞克隆）純系適合于克隆的細(xì)胞： （原因？） 無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞 對(duì)環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞？ 怎樣保證是純系？ 基本要求：必

6、須保證所建成的克隆來(lái)源于“單個(gè)細(xì)胞”。？原代培養(yǎng)細(xì)胞、有限細(xì)胞系 如何提高細(xì)胞克隆的形成率？選擇適宜的培養(yǎng)基添加血清 以滋養(yǎng)細(xì)胞支持生長(zhǎng)激素刺激（如胰島素）使用CO2培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)pH ？(胎牛血清最好，可以補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì))維持培養(yǎng)的pH值促進(jìn)對(duì)糖的利用液體培養(yǎng)基失去增殖能力的小鼠成纖維細(xì)胞 成纖維細(xì)胞：是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)。胞體多突起，呈星狀，細(xì)胞質(zhì)豐富、核較大從普通細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細(xì)胞系。例如研究缺少某種特殊蛋白的細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞中這種蛋白的功能。作為科研材料，是研究遺傳規(guī)律和生理特性的重要材料。細(xì)胞克隆最主要

7、的用途？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，從單個(gè)細(xì)胞開始、從組織開始、從器官（器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官）開始的培養(yǎng)分別叫做細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。但無(wú)論怎么樣，三種培養(yǎng)中主要的生命活動(dòng)都是以“細(xì)胞”為單位的，且長(zhǎng)期培養(yǎng)的結(jié)果通常只能使單一類型的細(xì)胞保存下來(lái)，最終成了簡(jiǎn)單的細(xì)胞培養(yǎng)，這三種培養(yǎng)一般統(tǒng)稱為“組織培養(yǎng)”。4、 動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：1.1885年，雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活。2.1903年，將皮膚及白細(xì)胞培養(yǎng)于腹水及血清中，細(xì)胞存活達(dá)一個(gè)月，且觀察到細(xì)胞分裂3.1907年，將蛙胚神經(jīng)管培養(yǎng)在蛙淋巴液中，成功看到神經(jīng)末端的阿米巴運(yùn)動(dòng)。4.1912年，對(duì)雞胚心

8、臟組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。5. 1943年，獲得長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞系L-細(xì)胞系。書P29 1951年，獲得海拉細(xì)胞系?！敖M織培養(yǎng)”一詞產(chǎn)生真正的組織培養(yǎng)開始；創(chuàng)立了懸浮培養(yǎng)法成功進(jìn)行了傳代培養(yǎng)；發(fā)明了卡氏瓶；研制了人工培養(yǎng)液大量細(xì)胞系的建成標(biāo)志著組織培養(yǎng)工作進(jìn)入了全新階段五、動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：真正開始1885年雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活組織培養(yǎng)一詞誕生1903年 皮膚及白細(xì)胞培養(yǎng)于腹水和血清中，結(jié)果細(xì)胞的成活期達(dá)1個(gè)月，并且看到細(xì)胞分裂1907美國(guó)科學(xué)家將一部分蛙胚神經(jīng)管培養(yǎng)在蛙淋巴液中，成功看到了神經(jīng)纖維末端的阿米巴運(yùn)動(dòng)，解決了神經(jīng)纖維起源問(wèn)題，并創(chuàng)立了懸浮培養(yǎng)法萌芽1912年雞胚細(xì)胞的培養(yǎng)1943科學(xué)家在致癌物20-甲基膽蒽的誘導(dǎo)下培養(yǎng)小鼠結(jié)締組織，獲得了能在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)肉瘤的L-細(xì)胞系1951通過(guò)對(duì)黑人婦女的宮頸癌組織的體外連續(xù)培養(yǎng)，獲得腫瘤細(xì)胞系即不死細(xì)胞系-海拉細(xì)胞系組織培養(yǎng)工作進(jìn)入了全