G418篩選原理及方法

1、*G418篩選原理及方法分析轉(zhuǎn)化的功能和表達(dá)需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞染色體。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80%的進(jìn)入核內(nèi)的外源 DNA得到瞬時(shí)表達(dá)。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，最終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。細(xì)胞基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)， 只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會(huì)表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。由于攝取、整 合、表達(dá)外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細(xì)菌 Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶

2、的氨基糖昔磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成 ，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖昔磷酸車t移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G 418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G 418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。由于每種細(xì)胞對 G418的敏感性

3、不同，一般變動(dòng)在100ug/ml1000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的 G418 的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的。分子克隆給出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。細(xì)胞系或機(jī)體中國倉鼠卵巢細(xì)胞Madin-Darby犬腎細(xì)胞人上皮A431細(xì)胞猿CV-1細(xì)胞盤基網(wǎng)柄菌屬植物酵母G418 濃度（ug/ml）700 80050040050010 3510125500由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以加藥時(shí)間不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染 了外源基因的細(xì)胞

4、代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽 性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染 24小時(shí)之后才開始加 G418篩選。方法：（）.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸儲(chǔ)水至 10ml,過濾消毒，4度保存。.細(xì)胞培養(yǎng)：取細(xì)胞按一定密度接種于24孔板，待細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)，且細(xì)胞密度小于滿培養(yǎng)皿單層細(xì)胞數(shù)的50%時(shí),棄去原培養(yǎng)液，加入含不同濃度 G418 （ 200-800科g/mD的完全培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，三天一換液，繼續(xù)培養(yǎng)2周，觀察細(xì)胞死亡情況， 以高于殺死全部細(xì)胞的G418最小濃度的一個(gè)梯度為篩選濃度，以篩選濃度的一半

5、為克隆細(xì)胞維持培養(yǎng)的濃度。.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度， 比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml, 按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋 G418制成篩選培養(yǎng)基。.加G418篩選：吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同 4。.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最彳t G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14

6、天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而 800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24小時(shí)或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時(shí)按1: 4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50%70 %匯合時(shí)；b加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死

7、亡時(shí)，可以把 G418濃度減半維持篩選。篩選1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；d挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基 150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到 48孔中增殖。e單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總 RNA ,做RT-PCR檢測目的基因是否存在。常見問題：1、由于每種細(xì)胞對 G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為 0.722g。2、G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)

8、胞的。但是新霉素對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。4、由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源 基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加 G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝 G418的濃度和活性都回下降，所以每 35天都要更 換一次含有G41

9、8的篩選液。加抗生素的時(shí)機(jī)：主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高 表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。5、加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1,死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液。6、體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個(gè)

10、適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng) 液中攝取營養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長因子。這個(gè)過 程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長。在篩選后期，大批 細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不 利于生長?？字屑?xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要 一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的

11、培養(yǎng)液按1:1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制：a培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b離心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液c慮過：再經(jīng)直徑0.22um濾器過濾，再加入 2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩?、適當(dāng)增加血清濃度。8、G418篩選24孔板接種原則是：保證每孔的細(xì)胞數(shù)量剛好在篩選的7天內(nèi)不會(huì)長的過滿，不會(huì)影響篩選實(shí)驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)所說的細(xì)胞數(shù)也要根據(jù)不同的細(xì)胞，不同的生長速度有一些調(diào)整的。我以前做的時(shí)候，剛開始也是按照每孔加入1000個(gè)/ml的培養(yǎng)液100ul這種密度來做的，但是這樣細(xì)

12、胞太少，結(jié)果兩周下來結(jié)果并不好。后來我改為2000個(gè)/孔細(xì)胞做的預(yù)試驗(yàn)，效果就很好了。后面做正式的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以及單克隆篩選什么的都沒有問題，至今穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株還長得 很好。所以我的經(jīng)驗(yàn)是做預(yù)試驗(yàn)時(shí)并不要完全局限于人家說的是多少，一定要根據(jù)自己對該種細(xì)胞的熟悉程度，例如 接種多大密度多長時(shí)間可以長滿等等來最終確定，每種細(xì)胞的性情都是不同。預(yù)試驗(yàn)嘛，本身就是摸索。9、G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜

13、受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。篩選之前由于每種細(xì)胞對 G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定 G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到 1000個(gè)細(xì)胞/ml,在100ug/ml1mg/ml的G418濃 度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在1014天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低 G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。匯合度(confluence)也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí)際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比例，如果細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器，我們 就認(rèn)為它們100%匯合，也就是匯合度 100%

14、。最近的一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：3X106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小時(shí)后加g418篩選，這個(gè)時(shí)候接種了1/300細(xì)胞的孔會(huì)大約 50%匯合，而理論上接種了1/4000細(xì)胞的孔會(huì)4%左右匯合，今天是篩選后第 9天，觀察到1/4000孔有兩三個(gè)小克隆，按道理 1/300孔會(huì)有20-30個(gè)克隆，但實(shí)際的情況是它們幾 乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！所以匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50% !10、問題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選 3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消

15、化，在消化過程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近）就是說幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且 PBS潤洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用 1MIN ,這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散

16、開,能夠被吸走為止。11、問題4。單克隆化的時(shí)機(jī)和個(gè)數(shù)：加藥篩選時(shí) ，一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長到 70%以上時(shí)，再做有限稀釋法，以克隆 出陽性細(xì)胞，同時(shí)要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，以防突變和污染。若?xì)胞長好了，如有40%以上，就可以有限稀釋了一般，篩選5, 6個(gè)克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見，篩 10個(gè)吧。 單克隆化的操作方法；方法1。單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的，我現(xiàn)在作了 15個(gè)96孔板的單克隆，總共才得到大約50株單克隆在做時(shí)候應(yīng)保證每個(gè)孔中的細(xì)胞是一個(gè)，因此，我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于 96個(gè)的細(xì)胞，這樣平均到每個(gè)孔中因該可以由滿意 的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過，我也百思不得其解，只

17、好做多一點(diǎn)的 96孔板來補(bǔ)充。培養(yǎng) SPC-A1 （人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn) 染了 EGFP,然后進(jìn)行了 G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫出來，希望對你有 所幫助。方法2。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對 96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml/孔，從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細(xì)胞液，操作

18、示意圖見下圖。一般來說，每一列都會(huì)有某個(gè)孔中只有12個(gè)細(xì)胞。 方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個(gè)細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號(hào)筆在皿底把單個(gè)熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺(tái)里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一 共獲彳導(dǎo)了 6株單克隆。但需注意的是：時(shí)間不能超過30min,否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時(shí)間長的方法：拿一個(gè)96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了56次后非常熟練了。培養(yǎng)液：最好是含 15%的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾, 過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單

19、克隆的培養(yǎng)液。方法4。我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30分鐘，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個(gè)，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將 6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時(shí)，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的 96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問題），你

20、可以試試，只要小心一些就行了。方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法：1） 3.5cm皿鋪細(xì)胞，長到大概 80%以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。2）轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿（1:6）或者兩個(gè)大皿（1: 12）。3）再過一天后加入帶 G418的培養(yǎng)基。4）依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細(xì)胞就形成單克隆。5）單克隆長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上 48個(gè)，種在兩塊24孔板上。6）于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約 4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù) western結(jié)果確定真陽性。我們基本上都是這樣 pick stabl

21、e的，除非一些對細(xì)胞生長抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到 stable。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50%就相對比較容易了，10%以上的可能最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長滿了 就傳代），好像比較有效。除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時(shí)也多。12、轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，

22、但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。 13、neo基因和目的基因是不是一定會(huì)整合在一起？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用 RT-PCR的方法進(jìn)一步鑒定。14、我的質(zhì)粒中含有 SV40與neo基因，好像就不存在外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞形成優(yōu)勢這個(gè)問題了吧。可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過FISH驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了 SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對表達(dá)的影

23、響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完 GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的 觀點(diǎn)理解。有時(shí)，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。15、按您的講法，篩選要進(jìn)行10代，那么維持劑量要進(jìn)行多長時(shí)間？如果我使用對照組，在對照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因，那 么，一種基因拷貝數(shù)為 0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打 個(gè)比方

24、，一個(gè)大口袋，抓1 0。個(gè)紅球，再抓 100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？ 應(yīng)該是很小的。紅球就是neo,黃球就是你的目的基因。 我們用neo,實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個(gè)紅球，另一次抓著1。個(gè)紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次 黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。外源基因整合后的基因表達(dá)量與整合的位置高度相關(guān)，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)，則有利于表達(dá)。通常用的載體是靠非同源重組隨機(jī)整合的，所以為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，需要對重組克隆進(jìn)行篩選。某些載體如pcDNA3包含SV40

25、的復(fù)制起始位點(diǎn)，可以是質(zhì)粒在反式提供大T抗原的細(xì)胞系中復(fù)制，增強(qiáng)瞬時(shí)表達(dá)，有利于提高質(zhì)粒的隨機(jī)整合幾率。對普通的表達(dá)載體來說，即使抗性基因表達(dá)也無法保證外源基因的整合，表達(dá)載體隨機(jī)整合的結(jié)果常常導(dǎo)致目 的基因的損壞甚至丟失。關(guān)于概率論的思維，我認(rèn)為紅球和黃球的比喻很形象，但未必準(zhǔn)確。因?yàn)榭剐曰蚝湍康幕蛴幸欢ǖ穆?lián)鎖，并不是完全相互獨(dú)立的。只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有 70- 80%,但是想挑到表達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個(gè)可能是在染色體上，合適的整 合位點(diǎn)太少的緣故。16、在細(xì)胞用胰酶進(jìn)行傳代時(shí)，此時(shí)細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng)基

26、中存在G418對細(xì)胞是否有影響？維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托?，但不能沒有?；蛘吒粢欢〞r(shí)間從新使用篩選量壓一下，我不知 你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實(shí)際上我們在篩選耐藥株呀。16、既然細(xì)胞表達(dá)neo,從理論上講是否無論多大濃度的G418對之都無影響，是不是 G418的濃度越高越容易篩選到高拷貝整合的高表達(dá)的克??？neo的產(chǎn)物是酶，過高的 G4 1 8濃度就要有更多的 neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過多的酶要求 會(huì)對細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃 度的G418液中生長速度也不同，

27、嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解 吧。17、篩選幾天后可以減少 G418的濃度？幾天換一次液？要看細(xì)胞生長情況和培養(yǎng)基的狀況，剛加藥時(shí)細(xì)胞死亡不多，很快培養(yǎng)基就會(huì)變酸變黃，要根據(jù)情況及時(shí)換液。篩選 中期會(huì)有大批細(xì)胞死亡，要根據(jù)死亡細(xì)胞多少換液以去除死亡細(xì)胞。18、通過篩選后沒有死亡的細(xì)胞不能直接用嗎？ 一定要單克隆嗎？難道單克隆一次還不夠還要再來一次嗎？轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的,目的蛋白表達(dá)有的多，有的少,外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長較快，在生長若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢，長期之后，表達(dá)最弱的細(xì)

28、胞會(huì)由于競爭優(yōu)勢占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。操作用96孔板法，每代細(xì)胞長滿后，大多數(shù)凍存，留2 0 0 cell左右就可以進(jìn)行該操作了。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強(qiáng)了很多。現(xiàn)在很多代了，很穩(wěn)定。19、篩選后的細(xì)胞和原來的細(xì)胞性狀差異很大這正常嗎？基本算正常，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞據(jù)細(xì)胞種類不同其形態(tài)都較正常細(xì)胞有變化，有的很明顯，比如說細(xì)胞變大，生長緩慢， 細(xì)胞界限不明顯及細(xì)胞愛成堆生長等等；有的則變化不明顯

29、。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，建議篩出單克隆后大量凍存。一 方面防止細(xì)胞回復(fù)，因?yàn)槟戕D(zhuǎn)入的質(zhì)粒對于細(xì)胞而言畢竟是個(gè)負(fù)擔(dān)，細(xì)胞較傾向于甩掉負(fù)擔(dān)輕裝前進(jìn)，這一點(diǎn)對于腫 瘤細(xì)胞尤甚；另一方面，如果插入的質(zhì)粒明顯和細(xì)胞周期有關(guān)的話，這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳不了幾代就會(huì)死亡。在傳 代過程中，也可以使用正常培養(yǎng)基，但過一段時(shí)間一定要用維持劑量的含G418的培養(yǎng)基壓一壓，以除去回復(fù)的細(xì)胞。20、我覺得套環(huán)法操作不如 96孔辦法效率高。也不一定.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求而定.如果克隆效率較低的細(xì)胞，套環(huán)可能更好.用96孔板法，如果不是每孔單個(gè)細(xì)胞，就不 能保證是單克隆.即使是增加到每孔十幾個(gè)細(xì)胞或上百個(gè)，一個(gè)96孔板也只能培養(yǎng)

30、一萬個(gè)細(xì)胞，十萬個(gè)細(xì)胞就至少需要 10個(gè)板，100萬個(gè)細(xì)胞就需要100個(gè)板，對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶，工作量就太大了 .且細(xì)胞在單獨(dú)生長條件下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不 如千萬個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好.因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞，有限細(xì)胞系還是無限細(xì)胞系，轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因，篩選還是不篩選，需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少 ？21、請問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的，含neo抗性基因的質(zhì)粒后，如何用 G418篩選？我查看了國內(nèi)、外 50幾篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)定論的說法。即使對于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講， 如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代后。不知這種觀點(diǎn)對不對。然而開始篩

31、選的劑量、維持劑量以及篩選持續(xù)時(shí) 間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時(shí)的劑量是否有一定關(guān)系？1. G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml ,每孔100ul加入有培養(yǎng)基的 24孔板，將每孔中的G418 濃度稀釋至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等 1 2 個(gè)級(jí)另h 培養(yǎng) 10-14 天，以最低細(xì)胞全 部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般 400- 8 0 0左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。1）正式試驗(yàn)前先要根據(jù)你的細(xì)胞做好預(yù)試驗(yàn)2）正式試驗(yàn)時(shí)只要一直維持這一濃度就可以

32、了，先開始有大量細(xì)胞死亡這是很正常的現(xiàn)象，這些細(xì)胞都是所不需要的。3）換液時(shí)間根據(jù)細(xì)胞死亡程度而定，一般 3-5天；2。我們掌握是傳過 10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒有 G418,很快會(huì)形成優(yōu) 勢的。3。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。*A、請問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的，含neo抗性基因的質(zhì)粒后，如何用 G418篩選？我查看了國內(nèi)、外50幾篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)定論的說法。即使對于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳 代后。不知這種觀點(diǎn)對不對。然而開始篩選的劑量、維

33、持劑量以及篩選持續(xù)時(shí)間又該如何確定？維持劑量與開始篩選 時(shí)的劑量是否有一定關(guān)系？22、G418怎么配制？1）我覺得不能用水配，因?yàn)檫@樣 PH會(huì)變化很大，至少要用 PBS。我是配在HEPES溶液中的，具體方法如下： 1g包 裝的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，濃度為100 mg/ml完全溶解后，0.22 um過濾，20度保存。HEPES緩沖 液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na 2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH 調(diào) PH 至 7.05,定容至 100ml。2）推薦用H

34、EPES o特別是當(dāng)細(xì)胞對 G418不敏感，G418使用濃度高時(shí)，如果用水、PBS配置，會(huì)極大的改變細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值，影響細(xì)胞的生長。1mol/L HEPES的簡單配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddH2O ,用10mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5-8.0,定容至50ml, 0.22um小濾器過濾。 HEPES最終使用濃度 15-20mM。23、我用24孔板做了 G418篩選的濃度梯度，確定最低致死濃度為 600mg/l。我現(xiàn)在用這個(gè)濃度篩選我轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞， 我應(yīng)該保持這個(gè)濃度多少天才能確保我篩選完成呢？在這期間可以換液嗎？篩選完了之后存活的細(xì)胞再培養(yǎng)傳代的 話，培養(yǎng)基中

35、是否還應(yīng)該加一定濃度的G418?如果要加的話什么濃度比較合適？應(yīng)該保持這個(gè)濃度 9天以上，每3天換液一次。篩選完了之后存活的細(xì)胞再培養(yǎng)傳代的話，培養(yǎng)基中應(yīng)該加一定濃度的G418, 一般在最低致死濃度的60%左右。24、在6孔板里進(jìn)行NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的G418篩選，2周后單克隆形成，于是就挑取單克隆，之前 6孔板里的細(xì)胞 很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，肉眼可以 看到細(xì)胞沉淀，接種至 25ml塑料培養(yǎng) 瓶中，鏡下看密度可以，但是細(xì)胞形態(tài)成多態(tài)性：少量是圓形，大多數(shù)是梭形。第2天一看沒有細(xì)胞貼壁！做了 2次都這樣，請問我的操作步驟有問題嗎

36、？看了你的操作步驟，個(gè)人觀點(diǎn)認(rèn)為你挑出來的不能稱之為單克隆，在 6孔板里用G418篩選兩周后只是大部分細(xì)胞死 亡，少數(shù)細(xì)胞存活并逐漸生長，只能叫作克隆形成。我們一般在轉(zhuǎn)染后 24h將細(xì)胞消化下來(0.25%trypsin + 0.02%EDTA )，以1: 10或更高的比例傳代，貼壁 24h后加選 擇性培養(yǎng)基開始篩選。待大部分細(xì)胞死亡，極少數(shù)細(xì)胞漸形成克隆。再把這些克隆經(jīng)24孔板、6孔板放大后再進(jìn)行單克隆化的操作(具體操作方法見附件)。從嚴(yán)格意義上來講，單克隆化的操作一般要進(jìn)行2-3次，經(jīng)此操作后長起來的才能稱之為單克隆。另外，在把克隆或單克隆放大的過程中動(dòng)作一定要輕柔，否則很容易出現(xiàn)你所說的

37、細(xì)胞不貼壁死亡的現(xiàn)象，也可以在消化完用正常培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后再換為含G418的培養(yǎng)基。還有，在多克隆形成后一定要及時(shí)凍存，以備后續(xù)試驗(yàn)。你挑選的克隆，不能貼壁原因可能有二；一、細(xì)胞很少，那么你接種后，由于密度較低，細(xì)胞是接觸生長，所以密度太低，細(xì)胞難以生存。二、擬消化下來可能用G418篩選液篩選，這樣也會(huì)死亡。消化后先用無G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)，貼壁后，再換取 G428培養(yǎng)液。25、我想問怎樣的方法可以把陽性克隆從培養(yǎng)瓶中取下來，書上說用彎頭吸管，我試了，不好用，根本就不能完整的 吸取總個(gè)陽性克隆細(xì)胞下來，我想著用刮勺，但進(jìn)口的特別貴，所需又不多，你看有什么別的好辦法嗎？謝謝了！如何挑選克隆。

38、你可以按以下操作方法進(jìn)行：(1)將已形成克隆的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察克隆位置，并將各個(gè)克隆位置用標(biāo)記筆標(biāo)記準(zhǔn)確；(2)在超凈臺(tái)內(nèi)，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；(3)用鐐子夾取一塊濾紙塊，用 0.25%Trypsin消化液浸濕，置于所標(biāo)記克隆位置處，5-20秒；(有人可提前在一孔中裝入 0.02%EDTA PBS )(4)將24孔培養(yǎng)板每孔加 G418選擇培養(yǎng)基2ml,用鐐子取出已黏附克隆細(xì)胞的濾紙快，置于一個(gè)孔中的培養(yǎng)基中， 涮洗濾紙塊數(shù)次，以使黏附的細(xì)胞脫落下。鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)脫落后，將濾紙塊取出棄掉，其它克隆方法轉(zhuǎn)移同 上；(有人在細(xì)胞貼壁后再選用培養(yǎng)基)(5)將移有克隆細(xì)胞的 24孔培養(yǎng)板

39、，繼續(xù)置 37c 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-5天；(6)待細(xì)胞長滿后，0.25%Trypsin消化液消化，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)入多瓶中擴(kuò)增，此后可做進(jìn)一 步鑒定工作。*單克隆挑取為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除發(fā)結(jié)合有 限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或者用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后一般經(jīng)

40、過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因 還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生 很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢，強(qiáng)表達(dá)目的蛋 白的細(xì)胞會(huì)越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。具體方法：#貼紙片法：1.取定性濾紙，剪成直徑12mm左右的小圓片.2.放小燒杯中以紙圭口高壓滅菌.3.棄選擇培養(yǎng)液，以Hanks洗細(xì)胞兩遍.4.用小鐐子將浸有胰蛋白

41、酶的12mm濾紙片覆蓋在細(xì)胞克隆之上 .消化一定時(shí)間后(根據(jù)你消化該細(xì)胞所需時(shí)間，將濾紙片取出，立即轉(zhuǎn)移至事先加有培養(yǎng)液的6孔板中.擴(kuò)大培養(yǎng)即可.#全皿消化法：PBS洗后吸去PBS,再加PBS到合適的水平，至少要使所有的克隆都不暴露在空氣里以免干掉，加胰酶數(shù)滴后輕搖片刻，過一分鐘，用小槍頭在克隆部位吸 1ul到已預(yù)加培養(yǎng)基的96孔板）。最要注意的就是不要讓克隆干掉；其次要注意的就是不要搖動(dòng)平皿，那樣會(huì)使克隆不純。*轉(zhuǎn)染和篩選：.使用含編碼抗生素抗性基因表達(dá)序列的質(zhì)粒（如pSV2neo）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。.轉(zhuǎn)染后第二天，將細(xì)胞傳代，給細(xì)胞分裂的空間（根據(jù)細(xì)胞生長的速度，一般1:10到1:40可以達(dá)到效果

42、）。.轉(zhuǎn)染后2-3天，開始使用抗生素。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抗生素的濃度由劑量-反應(yīng)分析確定。含抗生素的培養(yǎng)基每周更換兩次。. 10到14天后，可以觀察到抗性克隆，未轉(zhuǎn)染的對照應(yīng)該沒有細(xì)胞生長?？梢愿鶕?jù)需要固定，染色，傳代或克隆抗性 細(xì)胞。*單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：.單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對細(xì)胞的生長有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。.單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。.篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇 后加G418傳代2次，然

43、后按部就班。.過一段時(shí)間再篩選時(shí)，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫，此外，加藥后對蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。.穩(wěn)車P PA317細(xì)胞后再此篩選（需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次） ，細(xì)胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用 合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。.有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長滿后再轉(zhuǎn)到 6孔板繼續(xù)加藥

44、篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。單克隆化后鑒定：.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過 PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下，穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子，或者是改變了細(xì)胞的生理特性 ！用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下！.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代 10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì) 粒的。*進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因（經(jīng)測序驗(yàn)證）一準(zhǔn)備真核表達(dá)載體-將目的基因插入表達(dá)載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定下面以pcD

45、NA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。一、 試劑準(zhǔn)備1、HBS （Hepes-buffered saline） : 876mg NaCl 溶于 90ml ddH 2O,力口入 1M Hepes,調(diào) pH 到 7.4，補(bǔ) ddH2。至 100ml, pH7.4 , 濾過除菌。2、核酸貯存液，過濾除菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。二、操作步驟（一）克隆目的基因1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在上、下游引物的5-端分別引入酶切位點(diǎn) BamH I和Xho,行RT-PCR。2、回收特異性擴(kuò)增片段，連入 T載體。3、轉(zhuǎn)化DH5a ,質(zhì)粒制備。4、酶切初步鑒定，測序證實(shí)。（二）真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及表達(dá)外源DNA序列所必需的所有真核表達(dá)組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamH I和Xho I雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH&質(zhì)粒制備BamH I和Xho I雙酶切鑒定。(三)重組 pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞：G418 篩選濃度測定： SHG-44 培養(yǎng)于 24 孔培養(yǎng)板一 G418 分別用 100mg/L、2