16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、16SrDNAM定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程2020年4月19日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了經(jīng)過(guò)特定引物對(duì)細(xì)菌的16SrDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析比對(duì)，快速獲得細(xì)菌種屬信 息的操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于未知細(xì)菌的快速種屬分析，以及為細(xì)菌的生化 鑒定提供指導(dǎo)信息。.方法和原理16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌 16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì) 菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCRT增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、 DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。是一種快 速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。細(xì)菌rRNA （核糖體R

2、NA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、 16S和23S rRNA。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼 16S rRNA相對(duì) 應(yīng)的DNA序歹Jo 16S rDNA由于大小適中， 約1.5Kb左右，既能體 現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序 列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類(lèi)學(xué)家接受。在 16S rRNA 分子中，可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，因此可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將 16S rDNA 片段擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)2020年4月19日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。16SrDNA序列的前500bp序列變化較大，包含有豐富的

3、細(xì)菌 種屬的特異性信息，因此對(duì)于絕大多數(shù)菌株來(lái)說(shuō)，只需要第一對(duì) 引物測(cè)前500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論文發(fā)表 或是前500bp無(wú)法鑒別的情況，需要進(jìn)行16SrDNA的全序列擴(kuò)增和測(cè)序，得到較為全面的 16SrDNA的序列信息。由于測(cè)序儀一次反應(yīng)最多只能測(cè)出700bp的有效序列，為了結(jié)果的可靠性，一般將 16SrDNAr長(zhǎng)序列分成3部分進(jìn)行測(cè)序。16SrD .27 519357 TOC o 1-5 h z 111926，1493對(duì)引物正反向測(cè)通后，拼接成 1500bp左右的16SrDNA手 歹限3,設(shè)備和材料2020年4月19日文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正3.1 器材移液器

4、（ 1000w L、200 pL、100p L、10 w L）;渦旋振蕩器；Eppendorf MixMate ;離心機(jī)；水浴鍋；電泳儀；制冰機(jī)；低溫冰箱；PCR儀：Veriti 96 Well Thermal Cycler ; 凝膠成像儀:VersaDoc MP 4000;基因分析儀： AB350Q AB3130試齊ijDNA快速提取試劑：PrepMan Ultra ;瓊脂糖；PCR試劑：Taq2+酶，10 x Taq Buffer(Mg ), dNTPs ddHO 等；ExoSAP-IT ;測(cè)序 試齊ij : BigDye Terminator , 5X Sequencing Buffer

5、 ; BigDye XTerminator Purification Kit ;耗材移液器吸頭：1000口、200 口、10pL ;離心管：1.5mL、 200 p L; Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate ; Micro AmpMOptical Adhesive Film;3.4 引物16SrDNA正向引物27F5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3第1部分反向引物519R5- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3500 bp左右正向引物357F5- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3

6、第2部分反向引物1115R5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3750bp左右第3部分正向引物926F5- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3560 bp左右2020年4月19日4文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正。反向引物 1492R 5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3-其中 M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1.操作流程核酸產(chǎn)物測(cè)序I序列.實(shí)驗(yàn)方法核酸提?。禾羧尉?，然后置于裝有 100 H LPrepMan Ultra的離心管 中，渦旋震蕩混勻 30s左右，

7、然后100 c水浴10min后，以離心 機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心 3min,取10 HL上清液與490 L ddH?O（即稀釋 50倍），混勻作為下步 PCR勺模板DNA提取的DNAT-20 C保 存?；驍U(kuò)增PCR5應(yīng)體系試齊使用量（25. L體系）模板DNA21a (10ng100ng)Taq 酶(5U30.2 p L10Taq Buffer(Mg2+)2.5 i LdNTPs(各 2.5mM)2 n L2020年4月19日5文檔僅供參考，不當(dāng)之處，請(qǐng)聯(lián)系改正引物F(1 pM)5 n L引物R(1 pM)5 n LddH2O8.3 p L備注：DNMI板量一般在100 ng以下，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀 釋?zhuān)_定最佳的DNA莫板使用量。PC皈應(yīng)體系應(yīng)在冰中配置， 然后置于冰箱中冷卻 35min,最后放于PCF58 C： 30s30C72 C： 45s72 C： 5min4 C ： oo5.2.3 電泳稱(chēng)取1g瓊脂糖置于1