論文-對啤酒酵母蔗糖酶提取提純測定研究報(bào)告論文

1、-. z工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)論文 姓 名： 組 員： 學(xué) 號： 學(xué) 科： 食品科學(xué)與工程 所在院系：生物與環(huán)境工程學(xué)院 指導(dǎo)教師： 邱樂泉 2012 年12 月 1日填-. z啤酒酵母蔗糖酶的提取、提純及測定研究論文摘要：為了解酶的初步提取及純化方法，并在此根底上掌握測定酶活力的原理和方法；用Folin-酚試劑、微量凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，SDS測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。除此之外，還要掌握高速離心機(jī)、Q-Sepharose柱層析法、紫外分光光度計(jì)、凱氏定氮儀、蒸餾裝置、電泳等用法。這一系列實(shí)驗(yàn)需要實(shí)驗(yàn)預(yù)制作酵母的自溶，大約3天以后，酵母細(xì)胞壁破裂，胞液流出，經(jīng)

2、屢次分別離心得到初提液A、熱提液B和乙醇提取液C。利用Q-Sepharose柱層析法洗脫乙醇提取液C得到洗脫液D并在280nm處測D的吸光值，用葡萄糖測驗(yàn)試紙定性進(jìn)展酶活力測試，發(fā)現(xiàn)洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高，從第3管以后吸光值開場下降，且吸光值大的酶活力較大。得到4種酶提取液樣品以后，便可以制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)展定量酶活力測定，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條直線，根據(jù)曲線回歸方程計(jì)算4個(gè)樣品的總活力單位數(shù)和酶回收率，比擬計(jì)算結(jié)果可以知道隨著蔗糖酶的不斷提純酶的總活力單位數(shù)和酶回收率都減少。隨后用Folin-酚試劑法測樣品中蛋白質(zhì)的含量，與用微量凱氏定氮法測定的結(jié)果進(jìn)展比擬，后者測出的總蛋白含量

3、比前者大，并且知道隨著酶的提純，A、B、C、D4個(gè)樣品的純化系數(shù)升高，比活力升高，總酶活、總蛋白和蛋白回收率卻在下降，其中A的蛋白質(zhì)含量最高，D的純化程度最高。最后用SDS-聚丙烯胺凝膠電泳法通過凝膠對樣品的篩選別離、考馬斯亮藍(lán)的染色、洗脫等步驟測量蛋白質(zhì)分子和染料的遷移距離間接測定蔗糖酶的相對分子質(zhì)量，得到2條蔗糖酶條帶，計(jì)算的蔗糖酶相對分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞：蔗糖酶；提取純化；酶活力測定；Folin-酚試劑；微量凱式定氮法；SDS-聚丙烯胺凝膠Summary：To understand the the enzymes preliminary e*traction and purification

4、 methods, and on this basis to master the principles and methods of determination of enzyme activity; Folin-phenol reagent, trace Kay ceremony will be the principles and methods of nitrogen determination of the protein content, SDSprotein determination of therelative molecular mass. In addition, we

5、must master the use of high-speed centrifuges, Q-Sepharose column chromatography, UV spectrophotometer, Kjeldahl instrument, distillation apparatus, electrophoresis.This series of e*periments requires e*perimental pre-production - yeast autolysis, about three days later, the yeast cell wall rupture,

6、 cytosolic outflow to the beginning of e*tracts A, after repeatedly respectively centrifugal heat e*tracts B and ethanol e*tract C. Using Q-Sepharose column chromatography to obtain an eluate D eluted ethanol e*tract C and the absorbance value of the 280nm measured at D, the enzyme activity test, an

7、d found to penetrate wash peak obtained with glucose tests strips qualitative 1,2 tube enzyme activity began to decrease from the absorbance values after 3 and suck the light value greater enzyme activity. Later to obtain four kinds of enzyme e*traction fluid sample, it can produce a standard curve

8、of glucose, quantitative enzyme activity assay, the glucose standard curve is a straight line, according to the regression equation to calculate the number of units and enzyme recovery of the total activity of the four samples, and paring the calculated results You can know are reduced as the number

9、 of units of the total activity of the purified enzyme sucrase continues and enzyme recoveries. Followed by the protein content in the measured samples of the Folin-phenol reagent method, micro Kjeldahl nitrogen method results were pared, which measured the total protein content than the former, and

10、 know with the purification of the enzyme, A, B, C, D4 samples purified coefficient increases, increased specific activity, the total enzyme activity, total protein and protein recovery is on the decline, wherein A is the highest protein content, D, the highest degree of purification. SDS-polyacryla

11、mide gel electrophoresis gel sample screening separation test brilliant blue staining, elution step measurement of protein molecules and dye migration distance Indirect determination of the relative molecular mass of sucrase get two the sucrase strip sucrase relative molecular mass, the calculatedKe

12、ywords: sucrase; e*traction and purification; enzyme activity assay; Folin-phenol reagent; micro-Kjeldahl method; SDS-polyacrylamide gel正文：文獻(xiàn)綜述1.1蔗糖酶(Sucrase,EC .26)又稱轉(zhuǎn)化酶(Invertase)，可作用于21,2糖苷鍵,將蔗糖水解為D2葡萄糖和D2果糖1。隨著分子生物學(xué)的開展，不管對酶分子本身作用機(jī)制的研究還是其他研究，越來越需要純度高的酶制劑。由于酶本身也是蛋白質(zhì)，因此酶別離提存的方法大體上與蛋白質(zhì)純化方法一樣，一般來說，沒有

13、一種固定的方法，而往往根據(jù)你所要?jiǎng)e離提純酶的取材以及酶本身的物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)來確定別離提純方法。各種酶的純化通常有五個(gè)階段：材料的選擇與預(yù)處理；細(xì)胞破碎；抽提；純化；濃縮枯燥及保存。實(shí)驗(yàn)原理、材料和方法2.1 蔗糖酶的提取及初步提純實(shí)驗(yàn)原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)展提取。酶的生產(chǎn)方法有生物提取法、微生物發(fā)酵法及化學(xué)合成法，細(xì)胞破碎又有化學(xué)裂解法、低滲溶液法等，本法屬于生物提取法、菌體自溶的方法。經(jīng)破碎提取的蔗糖酶液再經(jīng)熱提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提純。 試劑與器材.1試劑新鮮的啤酒酵母冰凍在冰箱，由實(shí)驗(yàn)室從啤酒廠買來；醋酸鈉AR；甲苯AR；4m

14、ol/L醋酸；95%乙醇-20；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液。稱取121.1g Tris溶于1500ml的蒸餾水中，用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.3HCl量約為230ml，用蒸餾水稀釋到2L，即為0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液：將0.5mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液稀釋10倍即得。注：整個(gè)實(shí)驗(yàn)要注意防止高溫，以防止酶失活。.2器材錐形瓶250ml1，50ml1；量筒10ml125ml1;燒杯100 ml1，1000 ml1；具塞試管10 ml3；吸球、玻棒、滴管、p

15、H試紙；培養(yǎng)箱；恒溫水浴箱；磁力攪拌器，攪拌子；高速冷凍離心機(jī)。操作方法 1 酵母的自溶 ：培養(yǎng)60小時(shí) 2 初提取液A 在培養(yǎng)箱中取出裝有已自溶酵母的錐形瓶，經(jīng)操作取上層液體記體積為VA=14.8ml。 3 熱提取液B： VB=13.0ml。4 乙醇沉淀提取液C將熱提取液B 倒入100ml小燒杯中，將燒杯放入冰浴中邊攪拌邊緩慢滴加98%的冰乙醇，30min后繼續(xù)攪拌5min，離心，平衡用50%的乙醇，對方加，用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液溶解燒杯中的固體，與離心管中固體一起再次離心，得Vc=5.0ml。結(jié)果與分析.1結(jié)果表2-1提取液顏色狀態(tài)體積ml分析評價(jià)A棕黃

16、色液體25.62過大B橙黃色液體24.00C淡黃色液體6.10過小 VA總=VA=25.62ml VB總=VBVA/(VA-3)=24.0ml VC總=VcVA/(VA-3) VB/(VB-3)=VcVB總/(VB-3)=6.1ml.2分析 在這次試驗(yàn)中，數(shù)據(jù)為初始數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠是以后實(shí)驗(yàn)的保障。我們的數(shù)據(jù)在A的時(shí)候偏大，C偏小，可能是因?yàn)槲覀冸x心過程的操作不是很正確，但是這不會影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)。.3結(jié)論VA總=25.62ml ； VB總=24.0ml ； VC總=6.1ml。 考前須知第一次離心后取液體時(shí)要小心。重新離心后倒出液體留下固體。水浴時(shí)的溫度不要超過50。同時(shí)在保溫過程中不

17、斷搖動錐形瓶。冰浴時(shí)要迅速操作。冰浴操作過程中加緩沖液使固體充分溶解，減少損失。2.2 蔗糖酶的純化Q Sepharose-柱層析法實(shí)驗(yàn)原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以一定pH和離子強(qiáng)度的溶液為流動相，流動相和固定相之間發(fā)生可逆的離子交換反響，利用離子交換劑對需要?jiǎng)e離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)展別離的層析技術(shù)。由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的種類和數(shù)量不同，它們被吸引的程度也不同。當(dāng)被吸附的蛋白質(zhì)的Kd值有差異時(shí)，降低pH值或提高離子強(qiáng)度均可使之洗脫下來，用含陰離子如Cl-)的溶液洗柱，含電荷少的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，增加Cl-濃度，含電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種

18、蛋白質(zhì)被分開。分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長圍光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)展定性和定量分析。試劑與器材.1試劑0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液；1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液；0.5mol/LNaOH；Q Sepharose，長期保存需置于20%乙醇中，4保存。注：整個(gè)實(shí)驗(yàn)要注意防止高溫，以防止酶失活。.2器材層析柱；梯度混合器;磁力攪拌器，攪拌子；紫外分光光度計(jì)；點(diǎn)滴板；尿糖試紙、擦鏡紙；止水夾；燒杯、試管。操作方法 1 離子交換柱的填充 將層析柱垂直固定，加水，排除氣泡，再加少量水，裝入離子交換劑，至柱

19、高5cm，交換柱上端保存少許水不得干柱。 2 緩沖液鹽度梯度發(fā)生器的安裝在低濃度一段裝入攪拌子。且要形成梯度。3柱的平衡將柱子與恒流泵連通，用25ml Tris-HCl pH7.3緩沖液進(jìn)展沖洗平衡完成后，交換劑上方需保存5ml左右的緩沖液。4加樣緩慢加樣，不能把柱面沖到導(dǎo)致柱面不平，這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一5洗脫為防止液面低于交換劑外表，參加了5ml緩沖液。6測OD值在紫外分光計(jì)光度計(jì)上測出每管在280nm處的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下： 表2-2試管號OD值試管號OD值10.630 130.528 20.237 140.551 30.145150.198 40.165 160.0

20、94 50.121 170.174 60.114 180.174 70.066 190.099 80.049 200.041 90.082 210.051 100.169 220.006 110.350 230.012120.431 7酶活力測試用葡萄糖測驗(yàn)試紙測試每管蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取13 、14、19管進(jìn)展測試。 酶活力測試方法：在點(diǎn)滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待測洗脫液，用玻璃棒攪勻，放置5min，浸入葡萄糖試紙，1s后取出，60s比擬顏色深淺。將其合并成一管，VD=5.6ml2.2.4結(jié)果與分析2.2.4.1結(jié)果 VD =5.6ml VD總=VDVC總/V樣=5.66

21、.1/0.5=68.32ml。由數(shù)據(jù)得表如下： 圖2-1 Q Sepharose-柱層析法提純酶數(shù)據(jù)處理表2.2.4.2分析先用25mlTris-HCl洗穿透鋒，得到8只試管。但是如果在用量筒接的時(shí)候每管不是3ml，則也許就沒有8只了，這是實(shí)驗(yàn)的大忌。會造成很大的誤差，用梯度洗脫時(shí)，測得的OD值會成波動形式，而不是直線上升或者直線下降。 如果上提取液c中的酶濃度不夠高，也可能導(dǎo)致提純酶濃度不夠高，以后在檢驗(yàn)活力的時(shí)候會發(fā)現(xiàn)D根本就沒有酶活力，于是實(shí)驗(yàn)重做，我們在做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候應(yīng)該想到各種情況帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。 在收集D時(shí)，我們不小心到出了些，考慮到 可能不夠用，所以多取了一試管的D液。 在使用

22、Q-Sepharose純化方法之前還有過DEAE-纖維素層析方法和DEAE Sepharose層析方法，但比擬這幾種方法，用Q-Sepharose純化方法有如下特點(diǎn)： (1) 提高實(shí)驗(yàn)效果。瓊脂糖凝膠離子交換介質(zhì)比纖維素介質(zhì)載量高,別離純化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶與雜蛋白得到了很好的別離,提高純度,真正表達(dá)離子交換色譜蛋白質(zhì)純化上的優(yōu)越性,增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的意義。 縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。梯度洗脫時(shí)間由原來的100min縮短到現(xiàn)在的50min,減少不必要的實(shí)驗(yàn)重復(fù),實(shí)驗(yàn)過程比擬緊湊。 節(jié)約實(shí)驗(yàn)支出。離子交換介質(zhì)DEAE-纖維素由于流速慢,柱床高度會隨緩沖液濃度及pH改變,不能承受0.1M以上N

23、aOH清洗,重生效果差,壽命短。瓊脂糖介質(zhì)在分辨率、回收率、流速等具有優(yōu)越性。且其化學(xué)穩(wěn)定性極高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用數(shù)百至上千次,因而降低了本錢。2.2.4.3結(jié)論VD 5.6mlVD總 =68.32ml。2.2.5注意在整個(gè)柱操作過程中，要嚴(yán)格防止液面低于交換劑的外表。當(dāng)液面低 于交換劑外表時(shí)，空氣進(jìn)入交換劑，形成氣泡，而影響別離效果。加樣不可太快，以免攪渾交換劑的外表，而使別離不純。恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液體滴下來，同時(shí)防止液體下滴過快而引起干柱。是絕對不能干柱。 2.3 蔗糖酶活力的測定2.3.1實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)用DNS法測復(fù)原糖的含量，

24、進(jìn)而計(jì)算酶的活力。蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖和果糖均是復(fù)原性糖，可以在氫氧化鈉和丙三醇的作用下與2,3,5-二硝基水酸反響，生成的棕紅色氨基化合物在540nm波長處有最大吸收。在一定圍復(fù)原糖的量與其吸光值呈線性關(guān)系，于是做出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以后，就可以利用比色法可測出樣品中的復(fù)原糖含量。酶活力是指*種酶在最適PH、溫度等條件下催化底物水解的能力，通常以一段時(shí)間后底物的減少量或產(chǎn)物的生成量多少來表示。酶活力單位數(shù)U：在一定條件下，3min能水解蔗糖成復(fù)原糖1mg所需的酶量，稱為1個(gè)活力單位數(shù)。總活力單位數(shù)=V測體積測出的葡萄糖克數(shù)/V測*(試管溶液總體積/2)*V總*nV總為各種提取液在提取過程中的總體

25、積。酶回收率=各提取液的總酶活/處提取液A的總酶活*100%2.3.2試劑與器材2.3.2.1試劑3,5-二硝基水酸1甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.0ml10%氫氧化鈉溶液中并用水稀釋至69ml，在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。 2乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉加到330ml10%氫氧化鈉溶液中，再參加880ml1%3,5-二硝基水酸溶液。 將甲乙二溶液混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用，在室溫放置710天后使用。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mg/ml 準(zhǔn)確稱取20mg分析純葡萄糖預(yù)先在105枯燥至恒重，用少量蒸餾水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；0.2mol/L pH4.6醋

26、酸緩沖液 溶解10.83g醋酸鈉于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸調(diào)pH到4.6，稀釋至2L；5%蔗糖 用0.2mol/L pH4.6醋酸緩沖液配置；2mol/L NaOH 溶解0.80g氫氧化鈉于10ml水中。2.3.2.2器材電爐；恒溫水浴;紫外分光光度計(jì)；試管、吸管；2.3.3操作方法 1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支試管，分別按表3-1參加各種試劑。將各管液體混合均勻，在沸水浴加熱5min。取出后立即用冷水冷卻到室溫，于540nm波長處測OD值，以葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2-3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管號012345葡萄糖0.00.60.81.01

27、.21.4蒸餾水3.02.42.22.01.81.6DNS1.51.51.51.51.51.5總體積4.54.54.54.54.54.5OD0.0000.1210.2360.3590.4820.5992酶活力測定將前個(gè)實(shí)驗(yàn)所得四局部提取液用冷蒸餾水按比例稀釋：初提取液A1：200；熱提取液B(1:200)；乙醇提取液C1：200；柱別離液D1：20。取8支試管，按表3-2參加各種試劑。表2-4 酶的催化反響工程A1：200B(1:200)C1：200D1：20加樣A對A樣B對B樣C對C樣D對D樣酶液/ml222222222N NaOH0.50.50.50.535預(yù)熱10min，同時(shí)預(yù)熱5%蔗糖

28、5%蔗糖22222222立即搖勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反響3min2N NaOH0.50.50.50.5總體積/ml4.54.54.54.54.54.54.54.5取反響液A 0.25ml，B 0.25ml，C 0.20ml，D 0.3ml進(jìn)展DNS反響，測定540nm處OD值。得到ODA=0.193 ODB=0.161 ODC=0.306 ODD=0.2842.3.4結(jié)果與分析2.3.4.1結(jié)果繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2-2總活力單位數(shù)=mg/V測4.5/2V總n酶的回收率=各提取液的總酶活/初提取液A的總酶活100%本次試驗(yàn)最終結(jié)果：表2-5工程初提液A熱提取液B乙醇提取液C柱別離液DV測/ml0.2

29、50.250.20.3mg0.1850.1740.2220.215V總/ml25.62246.168.32總活力單位數(shù)/U8531.467516.83046.952203.32回收率/%10088.135.725.8 2.3.4.2分析本次實(shí)驗(yàn)根本還算成功，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，乙醇提取液C的回收率較低，可能實(shí)驗(yàn)操作帶來的誤差。本次試驗(yàn)的計(jì)算公式有嚴(yán)格的要求，經(jīng)過反復(fù)演算方才能得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)公式可以改為：總活力單位數(shù)=mg/V測*4.5/V配*V總/V取其中，V取 表示稀釋時(shí)的取樣數(shù) V配 表示稀釋后的毫升數(shù) 這是第一次用辦公軟件處理數(shù)據(jù)，感到很新鮮，也意識到計(jì)算機(jī)在科學(xué)研究中的重要

30、性。2.3.5注意做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，加完各種試劑后要充分搖勻。要求測得的OD值在0.10.7測定酶活力時(shí)，要準(zhǔn)確反響3min，這個(gè)反響時(shí)間應(yīng)該準(zhǔn)確把握，不要多1秒也不要少1秒測得在線性圍外的OD值，需重新配液顯色反響。4 蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測定及比活力計(jì)算2.4.1實(shí)驗(yàn)原理比活力是指單位質(zhì)量mg蛋白質(zhì)中酶的含量U，常用來表示酶的純度。比活力=酶的含量U/蛋白質(zhì)含量mg測定蛋白質(zhì)含量的方法有福林-酚試劑法、微量凱式定氮法、紫外吸收法、考馬斯亮法等，本實(shí)驗(yàn)采用的是福林-酚試劑法，或稱Lowry法，蛋白質(zhì)與Folin-酚A試劑堿性在堿性條件下形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后參加Folin-酚B酸性，銅-

31、蛋白質(zhì)復(fù)合物將其復(fù)原形成深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物。因?yàn)镕olin-酚B中的磷鉬酸-磷鎢酸可被蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸復(fù)原生成藍(lán)色化合物。蛋白質(zhì)濃度增高，產(chǎn)物顏色加深，這一藍(lán)色溶液在750nm和660nm有較強(qiáng)的吸光值。故可用比色法測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的OD值，然后據(jù)此測出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度5。2.4.2試劑與器材2.4.2.1 試劑試劑A堿性銅試劑 取Na2CO3AR10g和 NaOHAR2g，加蒸餾水30ml，微熱溶解：另取酒石酸鈉 Na2C2H3O32H2O，AR0.1g和CuSO45H2OAR0.05g，再參加30ml蒸餾水微熱溶解，冷卻后將上述兩溶液混合，再用水稀釋至100ml

32、，即為試劑A。該試劑為含10% Na2CO3，0.1%酒石酸鈉和0.05%硫酸銅的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料試劑瓶中，24至少可使用1個(gè)月。溶解于500毫升蒸餾水中。；試劑B酚試劑 在2升磨口回流瓶中，參加100克鎢酸鈉Na2WO42H2O,25克鉬酸鈉Na2MoO42H2O及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流完畢時(shí)，參加150克硫 酸 鋰Li2SO4，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑

33、瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1mol/L左右。標(biāo)準(zhǔn)濃度牛血清白蛋白溶液200g/ml 準(zhǔn)確稱取結(jié)晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要時(shí)預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度準(zhǔn)確稱重配成。牛血清白蛋白溶于水假設(shè)混濁，可改用0.9%NaCl溶液。；2.4.2.2器材分光光度計(jì)使用直徑為10nm的比色皿；刻度吸管0.5ml1，2ml1，5ml1;試管1.5 cm15cm8；具塞試管10 ml3；恒溫水浴箱55；2.4.3 操作方法 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表2-6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置加樣表管號012345BSA00.20.40.60.81.0水4.54

34、.34.13.93.73.5試劑A1.01.01.01.01.01.0靜置10min立即充分混勻試劑B0.30.30.30.30.30.3靜置10min立即充分混勻試劑B0.20.20.20.20.20.2混勻55水域5min,測A660OD6000.0000.1910.3460.5020.6460.7892.未知蛋白濃度的測定按A1：100、B1：100、C1：20、D不稀釋進(jìn)展稀釋，A稀釋液去0.4ml，B、C、D稀釋液各取5ml測定OD660(所得數(shù)據(jù)如上表所示)。 【注意】Folin-酚B試劑在酸性條件下穩(wěn)定，而Folin-酚A試劑在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)F

35、olin-酚B試劑參加后，應(yīng)迅速搖勻加一管，搖一管，使復(fù)原反響產(chǎn)生在試劑被破壞之前。2.4.4結(jié)果與分析2.4.4.1結(jié)果表2-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)記錄表標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白ml)標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(g)OD6600.2400.1910.4800.3460.61200.5020.81600.64612000.789樣品A1B1C1D1OD6600.4120.3030.2770.156 圖 2-3表2-8實(shí)驗(yàn)處理結(jié)果總匯表總體積/ml總酶活/u總蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%純化倍數(shù)/倍初提取液A25.628531.46506.8716.831001001.00熱提取液B247516.8

36、333.4122.5465.988.11.339乙醇提取液C6.13046.959.52320.061.8735.719.02柱別離液D68.322203.220.812720.140.1625.8161.61 2.4.4.2分析此實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，從純化倍數(shù)來看，A與B似乎沒有進(jìn)展提純，而C與D都大大的增加。但是就蛋白質(zhì)的回收率來看幾乎為0，由此可見蛋白質(zhì)的回收與總酶活之間沒有絕對的聯(lián)系，可能回收的蛋白質(zhì)不一定都是具有酶活的。這也證明了蛋白質(zhì)的多樣性。此次方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，靈敏度高；缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)濃度和光密度線性關(guān)系不夠嚴(yán)格，而且不同的蛋白質(zhì)會因Tyr和Trp的含量不同，造成顯色程度有

37、差異。2.4.5注意試劑A加完后，立即充分混勻，靜置10min。再向各管加B后放置10min，再加第二次。每次加A、B后應(yīng)立即迅速充分混合。2.5微量凱氏測總蛋白2.5.1實(shí)驗(yàn)原理 凱氏定氮法由Kieldahl于1833年首創(chuàng)，是一種元素分析方法。根據(jù)取樣量分類，可以分為常量和微量。 而不同蛋白質(zhì)中含氮量平均16%，凱式定氮儀測定含氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，得到蛋白質(zhì)含量。N / 16% = N 6.25 = 蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)共需消化、蒸餾、滴定3個(gè)步驟，其中消化是為了將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮 ，然后在堿性條件下蒸餾，讓無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成氨氣出來，用硼酸試劑吸收，最后用鹽酸滴定。滴定指示劑在堿

38、性條件下是綠色，當(dāng)溶液由綠色-灰色-紅色時(shí)可認(rèn)為是滴定完全。 NH2CH2COOH + H2SO4 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3 2 NH3 + H2 SO4 NH42 SO4 NH42 SO4 + Na OH Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3 2 NH3 + 4 H3BO3 NH42B4O7 + 5H2O NH42B4 O7 + 2 HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO32.5.2試劑與儀器2.5.2.1試劑蛋白樣品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀釋至100ml；濃硫酸；硫酸鉀3份與硫酸銅1份質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合研磨成粉末；30%Na

39、OH溶液:30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml；2%硼酸溶液：2 g溶于蒸餾水，稀釋至100ml；混合指示劑：01甲基紅酒精溶液和 01甲基藍(lán)酒精溶液臨時(shí)按2:1的比例混合?；?1甲基紅酒精溶液和 01溴甲酚綠酒精溶液臨時(shí)按1:5的比例混合2.5.2.2器材改進(jìn)式凱氏定氮儀；克氏燒瓶50ml2;移液管；錐形瓶50ml3；吸球、玻棒、滴管、量筒； 2.5.3操作方法 1消化凱氏瓶參加A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化劑，消化至淡綠色，定容至50ml。2.洗滌定氮儀實(shí)際操作時(shí)，觀察到隨著錐形瓶水量增多，指示劑變棕紅色。第三次洗滌后，指示劑不變色。3蒸餾實(shí)際

40、操作時(shí)，在加反響液后，反響室液體變成棕黑色，液體反響劇烈。指示劑有紅色變成棕色，最后變成綠色。4滴定用0.01N HCl將錐形瓶中的指示劑滴定至淡紫色，記錄消耗HCl的量。2.5.4結(jié)果與分析2.5.4.1結(jié)果 表2-9次數(shù)123HCl消耗量/ml0.260.260.28HCl消耗量同組/ml0.260.27樣品含氮量=(A-B) N=84.1mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=525.6502mg/ml2.5.4.2分析本次實(shí)驗(yàn)是兩組合作共同完成，同組者由于實(shí)驗(yàn)失誤，只有兩組數(shù)據(jù)，但是他們的數(shù)據(jù)與我們的非常接近，說明本次試驗(yàn)我們組實(shí)驗(yàn)做得很好。 本次試驗(yàn)與上次實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果由較大的出入，其影響結(jié)果的

41、主要因素有：1.收集氨氣過程中帶入了水蒸氣對硼酸PH影響較大；2.蒸汽洗滌時(shí)間不夠長也可以大致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大；3.最后滴定過程中，滴定操作的標(biāo)準(zhǔn)與否也對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大。 2.5.4.3結(jié)論 樣品含氮量=84.1mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=525.6502mg/ml2.5.5注意常量凱氏定氮法測總蛋白氮時(shí)可用強(qiáng)酸，微量凱氏定氮法測總蛋白氮必須用弱酸。2.6 SAS測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量2.6.1實(shí)驗(yàn)原理電泳是指溶液中帶點(diǎn)粒子在外加電場的作用下，向相反電極方向移動的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它在*PH下所帶的凈電荷量、分子大小即分子量和形狀的差異性。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體Acr

42、)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺Bis在催化劑過硫酸銨Ap和加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺TEMED的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠。凝膠孔徑大小可通過改變Acr和Bis濃度來調(diào)節(jié)。濃度越大，孔徑越小，顆粒穿過網(wǎng)孔的阻力越大，反之亦然。網(wǎng)孔大小根據(jù)所別離物的分子量的大小來選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇別離膠濃度12%。聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)的和不連續(xù)的凝膠電泳兩類。不連續(xù)凝膠電泳有三大效應(yīng)：1濃縮效應(yīng)：兩層凝膠的孔徑不同孔徑的不連續(xù)性；緩沖液與凝膠離子成分和pH不同緩沖系統(tǒng)的不連續(xù)性2分子篩效應(yīng)：顆粒小，圓球形的樣品分子，移動較快；顆粒大，形狀不規(guī)則的分子阻力較大，移動較慢。3電荷效應(yīng)：大局部蛋白質(zhì)在p

43、H8.3帶負(fù)電，電荷多遷移快SDS即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子外表活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，形成帶大量負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然電荷的差異；引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變。2.6.2試劑與器材2.6.2.1試劑30%丙烯酰胺貯液: 稱丙烯酰胺AR29.2g、甲叉雙丙烯酰胺0.8g，先用80ml雙蒸餾水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸餾水稀釋至100ml，過濾。用棕色瓶中，4保存一個(gè)月。10%的TEMED；10%過硫酸銨AP：現(xiàn)用現(xiàn)配。；別離膠緩沖液貯液1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8：取T

44、ris 9.08g溶解在40ml雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH8.8，用雙蒸水定容至50mL，4保存；濃縮膠緩沖液貯液1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8：取Tris 6.06g溶解在40ml雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH6.8，用雙蒸水定容至50mL，4保存；2SDS-樣品緩沖液：1ml濃縮膠緩沖液貯液1mol/L Tris-HCl，pH6.8+4ml10%SDS+1ml巰基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)，加雙蒸水定容至10mL，4保存。SDS-電極緩沖液貯存液0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml雙蒸水中，參加50ml 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS貯存液，加雙蒸水定容至1000mL則成5SDS-電極緩沖液。10%SDS：25gSDS用雙蒸水定容至250mL，室溫保存。染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250，參加90mL 50%甲醇溶液和10mL冰乙酸，用濾紙過濾。 2.6.2.2器材垂直板型電泳槽；玻璃板; 大培養(yǎng)皿；燒杯；吸量管；滴管 2.6.3 操作方法 1別離酸制備 裝配制膠工具，按表比例配制別離膠，小心加滿水，待